Ab BUF CAL CONJ HRP Antistoffer mot Buffer Kalibrator Konjugat HRP

Transkript

1 Sanquin Division Reagents Plesmanlaan 125 NL 1066CX Amsterdam Level infliximab M2920_02 Telephone: Fax: M ELISA for kvantitativ måling av medikamentnivåer for infliximab Ab BUF CAL CONJ HRP Antistoffer mot Buffer Kalibrator Konjugat HRP HUM IFX MOU REK TNF Human Infliximab Mus Rekombinant TNF WELL Brønn - Område 1. Generell informasjon Level infliximab er en enzymforbundet immunanalyse (ELISA) for rask, reproduserbar og spesifikk kvantitativ bestemmelse av infliximabkonsentrasjoner i plasma og serum fra mennesker. Det terapeutiske kimeriske antistoffet infliximab påvirker tumornekrosefaktor-alfa (TNF) og administreres hyppig til pasienter som lider av revmatoid artritt, tarmsykdommer, hudsykdommer og kreft. TNF spiller en viktig rolle i inflammasjon, det forårsaker for eksempel smerter, opphovnede ledd og stivhet hos pasienter med revmatoid artritt. Hemming av TNF antas derfor å lette noen av disse symptomene og slik å forbedre livskvaliteten til pasienter. Plasmaog serumnivåer av TNF-hemmere er svært variable mellom pasienter og korrelerer tydelig med de kliniske symptomene hos pasientene. Hos omtrent 8-43% av pasientene som ble behandlet med infliximab, dannes det antistoffer rettet mot infliximab. Dette kan delvis hemme funksjonene til TNF-hemmeren og kan forårsake en reduksjon i plasmakonsentrasjonen av TNF-hemmeren. Identifisering av medikamentnivåer kan være viktig for pasientjusterte behandlingsplaner, da lave legemiddelnivåer ofte er en indikasjon på antistoffdannelse mot infliximab. I tillegg kan lave legemiddelnivåer være et tegn på manglende effekt av infliximab før tilbakefall av kliniske symptomer. Det foreslås alternativt at hos pasienter som responderer godt på infliximab, kan dosen med infliximab reduseres i henhold til serumkonsentrasjoner. Medikamentnivåtester kan derfor hjelpe til å tilpasse pasientens medisinering eller bytte til en alternativ TNF-hemmer. Denne infliximab level ELISA har blitt utviklet for rask, reproduserbar og spesifikk kvantifisering av infliximabkonsentrasjoner i plasma og serum. Klinisk optimale områder, f.eks. terapeutisk cut-off, ble fastsatt hos Sanquin Diagnostic Services, med infliximab ELISA for revmatoid artritt skal være minst 3,0 µg/ml (Van de Bemt et al. 2013). For inflammatorisk tarmsykdom er det optimale området 3-7 µg/ml (Vande Casteele et al.). 2. Testprinsipp Infliximab level ELISA er en enzymimmunanalyse av "sandwich-type". TNF fanges opp i mikrotiterplater med polysterinmikrotiterbrønner trukket med monoklone antistoffer. Infliximab som er til stede i pasientprøven, kalibratoren eller kontrollene, bindes til TNF på mikrotiterplaten. Materiale som ikke er bundet, fjernes deretter ved vasking. Deretter tilsettes et pepperrotperoksidasemerket monoklonalt anti-medikament-antistoff. Dette antistoffet binder til infliximab/tnf/anti-tnf-komplekset som er til stede i mikrotiterbrønnen. Etter fjerning av ikke-bundet HRP-konjugat ved vasking, tilsettes substratumløsning til brønnene. Det dannes et farget produkt proporsjonalt med mengden infliximab til stede i prøven, kalibratoren og kontrollene. Etter at reaksjonen er stoppet ved tilsetning av stoppløsning, måles absorbering i en mikrotiterplateleser. Fra absorberingen av prøvene og de for kalibratorkurven, kan konsentrasjonen av infliximab fastsettes ved interpolering med kalibratorkurven. 3. Settets deler Mouse-anti-TNF/recombinant TNF pre-coated microtiter plate 12x8 brønner - M2911 klar til bruk Calibrator 1-6 6x0,5 ml svarte hetter M2922 klar til bruk Control 1 Control 2 1x0,5 ml 1x0,5 ml gjennomsiktig hette gjennomsiktig hette M2923 M2924 Human anti-infliximab HRP-conjugate 1x12,5 ml brun flaske M2925 klar til bruk klar til bruk; terapeutisk område klar til bruk; sub-terapeutisk område Wash buffer stock solution 1x50 ml hvit flaske M1805 fortynn 1:20 i destillert vann HPE dilution buffer 1x50 ml hvit flaske M2940 klar til bruk TMB substrate solution 1x12,5 ml brun flaske M1821 klar til bruk Stop solution 0.18M H2SO4 1x13,5 ml hvit flaske M1822 klar til bruk Plate seals 10x :40 IFU M2920 Level infliximab 1 5

2 - Flatbunnet mikrotiterplate bestående av 12 striper med 8 brønner klar til bruk. Alle brønnene er trukket med TNF-spesifikt monoklonalt antistoff fra og rekombinant TNF fra mus. Mikrotiterplatene vakuumforsegles i en plastpose inneholdende tørkemiddel. Settet gir fleksibilitet for bruk av mikrotiterplatene ved forskjellige anledninger. Bestem antall striper som kreves for å teste det ønskede antallet prøver, pluss 8 brønner som trengs for kalibratorer og kontroller. Fjern stripene som ikke vil bli brukt fra rammen på mikrotiterplaten og pakk dem på nytt i plastposen med tørkemidlet. - Etter åpning kan alle reagenser og mikrotiterplatestripene brukes i inntil 4 uker hvis oppbevart ved 2-8 C. - Se informasjonsarket som følger med settet for informasjon om de settspesifikke infliximabkonsentrasjonene i kalibrator 1-6 og i kontroll 1 og kontroll 2. - Ingen av materialene og reagensene i settet krever et sikkerhetsdatablad (MSDS) i henhold til direktiv EC 1272/2008 /Annex VI. 4. Andre nødvendige materialer - Destillert eller avionisert vann. - Kalibrerte pipetter ( µl). - Kalibrerte pipetter ( µl). - Begerglass, kolber, sylindre og væskebeholdere som nødvendige for tilberedning av reagenser. - Mikrotiterplateleser (for avlesning av OD ved 450 nm). 5. Forsiktighetsregler - Alle reagenser må oppbevares ved 2-8 C. - Lekkende eller skadde hetteglass kan ikke brukes. - Reagenser (uåpnet eller åpnet) kan ikke brukes etter utløpsdatoen, som er trykket på flaskens etikett. - Ikke bruk prøver med interferensfaktorer som er høyere enn indikert i 8. Spesifikasjoner. - Alle prøver må behandles som potensielt smittefarlige. Håndter alle plasma- og serumprøver forsiktig, for å forhindre overføring av blodbårne infeksjoner. - Det er viktig å være nøye ved bruk og avhending av hver beholder og dens innhold. Avhending i vann etter fullføring av testen må utføres i overensstemmelse med laboratoriets regler. 6. Testprosedyre 6.1 Innsamling og preparering av prøver 1. Det må brukes lavpunktprøver for å måle konsentrasjonen av infliximab, og prøvene må således tas innen 24 timer FØR legemidlet injiseres for å sikre at de indikerte, forventede nivåene reflekterer lavpunktnivået for pasienten. 2. Det kan kun brukes serum og plasma (Li-heparin og EDTA) i analysen. 3. Separer plasma eller serum fra blodcellene innen 4 timer etter innsamling og utfør analysene umiddelbart. Hvis testingen av prøvene forsinkes, kan de oppbevares ved 2-8 C i 24 timer. Hvis prøvene ikke analyseres innen 24 timer, må prøvene oppbevares nedfrosset. De kan lagres nedfrosset ved -18 C i 2 måneder. 4. Alikvoter prøver for å unngå fryse-tine-sykluser. 5. Før analysen må frosne prøver tines ved romtemperatur. Ikke bruk 37 C eller 56 C vannbad for tining. 6. Bland prøvene rett før klargjøring av fortynningene. 6.2 Fortynning av prøvene 1. Alle prøver skal fortynnes i duplikat. 2. Det kan brukes en fortynning på 1:1500 for å måle infliximabnivåene hos pasientene i denne analysen. 3. Hvis konsentrasjonen av prøven er for høy til å oppnå en nøyaktig konsentrasjon, gjenta testen med en prøvefortynning på 1:2000 for å oppnå et pålitelig resultat. 4. Hvis konsentrasjonen av prøven er for lav til å oppnå en nøyaktig konsentrasjon, gjenta testen med en prøvefortynning på 1:200 for å oppnå et pålitelig resultat. Fortynning Prøvetype HPE-volum 1:50 5 µl ufortynnet pasientprøve 245 µl 1: µl 1:50 forhåndsfortynnet pasientprøve 150 µl 1: µl 1:50 forhåndsfortynnet pasientprøve 290 µl 1: µl 1:50 forhåndsfortynnet pasientprøve 195 µl 6.3 Klargjøring av løsning med virkningsstyrke for vaskebuffer Klargjør en løsning med virkningsstyrke ved å tilsette 50 ml vaskestandardløsning (dette er totalvolumet i én flaske) i 950 ml destillert vann. Løsning med virkningsstyrke kan lagres i opptil 2 måneder ved 2-8 C. 6.4 Klargjøring av ELISA-testprosedyre 1. La reagensene romtempereres (18-25 C). 2. Hele analysen må gjennomføres ved romtemperatur (18-25 C) uten risting. 3. Ikke la brønnene stå utildekket eller tørre i lengre perioder mellom inkuberingstrinnene. 4. Fjern forsiktig alle luftbobler fra brønnene før inkubering. 5. For å unngå krysskontaminering, bruk engangspipettespisser for hver overføring og bruk nye plateforseglinger for hvert inkubasjons-/fikseringstrinn i ELISA-eksperimentet. 6. Bland alle reagensene grundig, men forsiktig, før bruk (uten skumdannelse) :40 IFU M2920 Level infliximab 2 5

3 6.5 Gjennomføring av ELISA-testprosedyren 1. Fjern mikrotiterplaten med det påkrevde antallet mikrotiterplatestriper fra posen. De ubrukte stripsene kan lagres i plastposen med tørkemidlet. 2. Klargjør vaskebufferen og prøvene i henhold til protokollen. 3. Tilsett 100 µl per brønn kalibratorer, kontroller eller fortynnede pasientprøver i henhold til den foreslåtte mikrotiterplatelayouten eller din egen layout. 4. Dekk til mikrotiterplaten med klebende forsegling og inkuber i 1 time. 5. Aspirer supernatanter fra brønnene, fyll hver brønn med 250 µl fortynnet vaskebuffer og aspirer vaskebufferen. Gjenta dette fire ganger. Etter den endelige vasken må brønnene være tørre! 6. Tilsett 100 µl av anti-infliximab HRP-konjugatet i hver brønn. 7. Dekk til mikrotiterplaten med klebende forsegling og inkuber i 1 time. 8. Aspirer supernatanter fra brønnene, fyll hver brønn med 250 µl fortynnet vaskebuffer og aspirer vaskebufferen. Gjenta dette fire ganger. Etter den endelige vasken må brønnene være tørre! 9. Tilsett 100 µl TMB-substratløsning i hver brønn. 10. Inkuber mikrotiterplaten i mørket og ikke rist. Sjekk fargedannelsen hvert 5. minutt. Når den blå fargen er utviklet i de positive brønnene og den blanke fremdeles er fargeløs, må reaksjonen stoppes. Gjennomsnittlig inkubasjonstid er 10±1 minutter. 11. Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 µl stoppløsning i hver brønn. 12. Mål mikrotiterplaten i en ELISA-leser ved A450 nm. Les platen innen 30 minutter etter tilsetningen av stoppløsningen. 6.6 Forslag til mikrotiterlayout Kalibreringskurven og kontrollene må inkluderes for hver kvantitative analyserunde. De kan utføres i én enkeltrekke. Reagensene som følger med gir brukeren mulighet til å bruke mikrotiterplaten i én til maksimalt fire kjøringer. Et forslag til layout for mikrotiterplatene gjelder bruk i én enkeltkjøring A CAL1 prøve 1 prøve 5 prøve 9 prøve 13 prøve 17 Prøve 21 prøve 25 prøve 29 prøve 33 prøve 37 prøve 41 B CAL2 prøve 1 prøve 5 prøve 9 prøve 13 prøve 17 prøve 21 prøve 25 prøve 29 prøve 33 prøve 37 prøve 41 C CAL3 prøve 2 prøve 6 prøve 10 prøve 14 prøve 18 prøve 22 prøve 26 prøve 30 prøve 34 prøve 38 prøve 42 D CAL4 prøve 2 prøve 6 prøve 10 prøve 14 prøve 18 prøve 22 prøve 26 prøve 30 prøve 34 prøve 38 prøve 42 E CAL5 prøve 3 prøve 7 prøve 11 prøve 15 prøve 19 prøve 23 prøve 27 prøve 31 prøve 35 prøve 39 prøve 43 F CAL6 prøve 3 prøve 7 prøve 11 prøve 15 prøve 19 prøve 23 prøve 27 prøve 31 prøve 35 prøve 39 prøve 43 G CTRL 1 prøve 4 prøve 8 prøve 12 prøve 16 prøve 20 prøve 24 prøve 28 prøve 32 prøve 36 prøve 40 prøve 44 H CTRL 2 prøve 4 prøve 8 prøve 12 prøve 16 prøve 20 prøve 24 prøve 28 prøve 32 prøve 36 prøve 40 prøve Resultater og tolkninger 7.1 Resultater 1. En hvilken som helst programvaremetode for beregning av konsentrasjoner, tilgjengelig i eget system eller på Internett, kan brukes. En generell metode for beregning for hånd angis. 2. Registrer absorbering ved 450 nm for hver brønn inneholdende kalibrator. 3. Plott absorberingen på Y-aksen i en lineær skala og plott infliximabkonsentrasjonen for kalibratorprøven på X-aksen på en loggskala og tegn kurven for beste samsvar. 4. Registrer absorbering ved 450 nm for hver brønn inneholdende en spesifikk prøve. 5. Finn netto gjennomsnittlig absorberingsverdi for hver prøve på den vertikale aksen og følg en horisontal linje som krysser kalibratorkurven. 6. Trekk en vertikal linje fra krysningen av kalibratorkurven mot X-aksen. 7. Infliximabkonsentrasjonen avleses fra den horisontale aksen ved krysningen med X-aksen. 8. Multipliser den oppnådde infliximabkonsentrasjonen med fortynningsfaktoren for prøven for å finne den faktiske konsentrasjonen av infliximab i prøven. For kontroll 1 og kontroll 2 må det brukes en fortynningsfaktor på 1: Beregn gjennomsnittet av duplikatverdiene når prøven utføres i duplikat. Eksempel på standardkurve etter ti minutters fargedannelse: :40 IFU M2920 Level infliximab 3 5

4 7.2 Fortolkning Den optimale terapeutiske konsentrasjonen av infliximab avhenger av sykdommen i kombinasjon med pasientspesifikke egenskaper. Når det utføres nivåtester for diagnostiske formål og/eller for å bestemme pasientens behandlingsprotokoll, gir den innhentede konsentrasjonen aldri en definitiv diagnose, men må anses som en indikasjon på den kliniske situasjonen som kan kreve videre diagnostisk undersøkelse. Det må anvendes kliniske parametere sammen med konsentrasjonen av infliximab i beslutningsprosessen. For pasienter med en lav konsentrasjon av infliximab, må anti-infliximabantistoffer måles og legges til resultatene av immunogenisitetstesten og de kliniske parameterne i beslutningsprosessen. Indikasjon på terapeutiske nivåer for pasienter behandlet med infliximab* Friske donorer og pasienter som ikke er behandlet med infliximab Sub-terapeutiske nivåer av infliximab Normale terapeutiske nivåer av infliximab Forhøyede nivåer av infliximab negativ <3,0 µg/ml 3-7 µg/ml** >7,0 µg/ml *Kun indikasjoner på terapeutiske verdier er oppgitt. Hvert laboratorium må definere sine egne grenseverdier for diagnostiske formål. **Det normale terapeutiske nivået er konsentrasjonen der en pasient har høyere sannsynlighet for en god til moderat klinisk respons. Det normale terapeutiske nivået er ikke nødvendigvis det samme som det optimale terapeutiske nivået. Det optimale terapeutiske nivået er forbundet med sykdommen og pasientens individuelle parametere. 8. Spesifikasjoner De gjengitte verdiene for testens spesifikke ytelsesegenskaper representerer typiske resultater, og skal ikke forstås som spesifikasjoner for dette settet. Se det vedlagte informasjonsarket for settets spesifikke analyseområde og for infliximabkonsentrasjonen i kalibratorene. Gjenvinning : 94% ved 2 µg/ml (1:1500) Grense for kvantifisering nedre : 0,08 µg/ml (1:200) øvre (for mye antigen) : ingen antigener observert (47 µg/ml ved 1:2000) Presisjon Total presisjon presisjon mellom kjøringene 0,30 µg/ml (1:200) : 11,0% 9,5% 2,14 µg/ml (1:1500) : 8,8% 5,8% 17,3 µg/ml (1:2000) : 7,4% 6,5% Lineært område : 1,8-38 µg/ml Ingen kryssreaksjon med : TNF-hemmerne adalimubab, etanercept og golimumab Interferensfaktorer : interferens <20% med: hemoglobin - 5 og 40 mg/ml konjugert bilirubin - 0,02 og 0,5 mg/ml ukonjugert bilirubin - 0,1 og 1,5 mg/ml triglyserider - 15 og 50 mg/ml humant serumalbumin - 60 og 80 mg/ml revmatoid faktor (RA) U/mL Metodesammenligningsanalyse : 70 pasientprøver ble sammenlignet med metoden validert på stedet av Sanquin Diagnostic Services analyse : Passing and Bablock: y=0.91x+0.04 Spearman correlation: Begrensninger - Settet er designet kun for profesjonell bruk. Brukeren må ha opplæring i og være kjent med ELISA-testprosedyrer. - Kontroller og hold alle pipetter og systemer under full vedlikeholdsservice i henhold til beskrevne prosedyrer fra produsentene for optimal ELISA-ytelse. - Den beskrevne protokollen er for manuell testing. Ved bruk av settet på en ELISA-automat, må testen bekreftes av brukeren før bruk. - Ikke bruk reagenser etter utløpsdatoen som er stemplet på etikettene. - Når kontrollene ikke er innenfor det angitte området, er ikke resultatene gyldige og testen må gjentas. - Fordi kontrollene er forhåndsfortynnet kan de ikke brukes til klargjøring av kontrollprøve og reagenser av brukeren. - Prøver som har en OD450 nm utenfor kalibratorkurven, er ikke gyldige og kan ikke brukes for beregninger. Ekstrapolering av resultatene er ikke akseptabelt. Disse prøvene må måles i lavere og høyere fortynninger. - Falske positive eller negative resultater kan forekomme når prøvene brukes med høyere interferensfaktorer enn som angitt i spesifikasjonene. - Det må kun brukes reagenser som følger med settet. Ikke bruk reagenser fra forskjellige batcher eller forskjellige settpartier, da disse ikke er ombyttbare. - Reagenser eller rester av reagenser (f.eks. dødvolum) kan ikke blandes med innholdet i nylig åpnede flasker. - Hetter og flasker kan ikke skiftes om. Hettene må settes tilbake på de tilsvarende flaskene. - NaN3 må ikke tilsettes reagensene, da dette påvirker testen. - Ikke bruk aluminiumsfolie under inkubasjonstrinnene. 10. Referanser 1. van den Bemt B.J.F.; Annals of the Rheumatic Diseases. 2008;67: :40 IFU M2920 Level infliximab 4 5

5 2. Aarden L.; Current Opinion in Immunology. 2008;20(4): de Vries M.K.; Annals of the Rheumatic Diseases. 2007;66(9): Wolbink G.J.; Arthritis & Rheumatology. 2006;54(3): Van der Bemt B.J.F.; British Journal of Clinical Pharmacology. 2013;76(6): Vande Casteele N.; Gastroenterology. 2015;148: For en fullstendig liste over alle referanser publisert av Sanquin om infliximab, se Ansvarsfraskrivelse Det garanteres at produkter fra Sanquin virker som beskrevet i produsentens originale bruksanvisning. Det er av avgjørende betydning at prosedyrer, testutforminger og anbefalte reagenser og utstyr overholdes nøye. Sanquin fraskriver seg ethvert ansvar som følge av noe avvik fra dette :40 IFU M2920 Level infliximab 5 5