1. Kassetter Tjue (20) engangskassetter som er enkelt pakket i en forseglet aluminiumsfolie, og inneholder et tørkemiddel.

Transkript

1 CalFast Hurtigtest for kvantitativ påvisning av calprotectin i avføringsprøver. For in vitro diagnostisk bruk. CalFast er en immunokromatografisk analysemetode for kvantitativ påvisning av calprotectin i avføringsprøver. Utskillelsen av Calprotectin utføres i en egen enhet, som gjør det mulig å sterkt redusere den tiden som er nødvendig for den pre-analytiske prosedyren. Prinsippet for testen CalFast er en immunokromatografisk analyse som kombinerer en blanding av anti-calprotectin, polyclonal og monoklonale antistoffer. Calprotectin som finnes i den fortynnede prøven blir bundet av gull-konjugerte antistoffer. Det dannende komplekset beveger seg langs reaksjonsstripen og binder seg til anti-calprotectin antistoffene i reaksjonsområdet (T) mens ubundne antistoffer vil binde seg i kontroll-området (C). Konsentrasjonen av calprotectin i prøven beregnes ved hjelp av CalFast leseren. Sammensetningen av angitte materialer/reagenser som følger med i pakningen. 1. Kassetter Tjue (20) engangskassetter som er enkelt pakket i en forseglet aluminiumsfolie, og inneholder et tørkemiddel. 2. Fortynningsbuffer En (1) ampulle som inneholder 50 ml. Klart til bruk. 3. Innsamling og ekstraksjonsenheter Tjue (20) engangsenheter som inneholder en klar-til-bruk ekstraksjons løsning. Nødvendig utstyr som ikke medfølger. 1. Plast-rør for fortynning av avføringsprøver. 2. Vortex. 3. Presisjonspipetter med engangstupper ( µl, 1 ml). 4. Sentrifuge for mikrotuber. 5. Eppendorfrør for ekstra fortynning. 6. Stoppeklokke. 7. CalFast Reader. Ytelseskriterier og begrensninger for testen Intra-analyse variasjon Fire (4) avføringsprøver ble testet tolv (12) ganger i samme kjøring. Resultatene det fremskaffet er som følger: Prøve Snitt mg/kg 208,8 142,4 101,2 72,2 STD 25,5 15,6 8,5 8,2 CV% 12,2 10,9 8,4 11,3 Inter-analyse variasjon Fem (5) avføringsprøver ble duplikattestet i tre (3) ulike serier. Resultatene det fremskaffet er som følger: Prøve Snitt mg/kg 88,4 98,3 114,4 172,3 200,9 STD 7,6 9,3 7,9 16,7 23,6 CV% 8,7 9,4 6,9 9,7 11,8

2 Inter-lot variasjon Fem (5) avføringsprøver ble duplikattestet ved hjelp av tre (3) identiske CalFast analyseinstrumenter med ulike produksjonsdatoer. Resultatene det fremskaffet er som følger: Prøve Snitt mg/kg 80,9 100,0 108,4 96,6 231,0 STD 9,9 2,8 8,4 10,0 33,9 CV% 12,2 2,8 7,8 10,4 14,7 Analytisk følsomhet Positive målinger med en kjent calprotectin-konsentrasjon var fortynnet fra 1150 mg/kg til 9 mg/kg, og testet i henhold til dette. Hver fortynning er testet ti (10) ganger. Innenfor analyseområdet ( mg/kg), var alle verdiene for CV % lavere enn forventet 15% verdi. Diagnostisk sensitivitet Avføringsprøver fra tjue (20) pasienter, med klinisk diagnostisert IBD (betent tarmsyndrom) ble testet. Fremskaffet verdi var 90%. Diagnostiske spesifisitet Avføringsprøver fra hundre og to (102) pasienter, med enten IBS (irritabel tarmsyndrom) eller med andre sykdommer enn IBD ble testet. Fremskaffet verdi var 90,2%. Sammsvar med andre analysemetoder 163 avføringsprøver fra personer med eller uten klinisk diagnostisering av IBD ble testet, med både CalFast og Calprest (ELISA). Resultater i form av positive/negative svar, ble sammenlignet for de to analysemetodene. For 150 av prøvene gav testene det samme resultatet(pos/pos eller Neg/Neg). For de siste 13 prøvene, fikk man motstridende resultater fra de to testene (Pos/Neg eller Neg/Pos). Det ble altså oppnådd samme resultat i 92% av tilfellene. Lagring og utløpsdato av reagenser Alle reagenser må lagres mellom 2-8 C og brukes før utløpsdatoen som er trykt på etiketten. Holdbarhet etter første åpning Fortynningsvæsken er holdbar i 60 dager etter første åpning, hvis den oppbevares i originalforpakning og under korrekt temperatur. Holdbarhet under transport Forsøk har vist at alle elementer i testen tåler lagring i opp til 96 timer, ved temperaturer på 37 C. Forhåndsregler ved behandling av prøver Alle prøver er potensielle mikrobiologiske risikofaktorer, og må behandles deretter. De bør håndteres og kastes i henhold til reglene som gjelder i laboratoriet. Prosedyre for prøvetakning Prosedyre for prøver med normal konsistens 1. Plasser avføringsprøven i en steril beholder. 2. Ta ut prøveholderen fra ekstraksjonsenheten ved å skru den mot klokken. 3. Prøveholderen stikkes inn i avføringen, og roteres til alle rifler i prøveholderen er fylt av avføring. 4. Før prøveholderen plasseres i utvinningsenheten, bør overflødig avføring fjernes ved å rotere holderen langs innsiden av den sterile beholderen. 5. Plasser prøveholderen tilbake i enheten. Skru med klokken til den er ordentlig lukket. Prosedyre for prøver med flytene konsistens, eller som av andre grunner ikke tillater bruk av skrupinnen. 1. Det trengs en pipette som rommer 60ml. 2. Benytt pipetten til og ta opp 60ml avføring. 3. Skru ut prøveholderen og pipetter avføringen ned i ekstraksjonsenheten. 4. Plasser prøveholderen tilbake å skru ordentlig igjen. Prosedyre for spesielt hard avføring(prøveholder kan ikke presses inn i avføringen). 1. Avføringsprøven tas i en steril beholder. 2. Pipetter µl saltløsning opp i beholderen. 3. La beholderen stå i romtemperatur i minst 60 minutter.

3 4. Man kan deretter følge prosedyren beskrevet for avføring med normal konsistens. Prosedyre hvis man mangler ekstraksjonsenheten. 1. Hvis man er midlertidig tom for ekstraksjonsenheter kan en avføringsprøve oppbevares i kjøleskap(2-8 C) opptil 7 dager. For lengre oppbevaring må prøven fryses i -20 C. 2. Når man har fått tilgang til nye ekstraksjonsenheter kan prosedyren fortsette som normalt, fryste prøver må tines for testen fortsetter. Lagring av prøver En avføringsprøve oppbevares i dens originale beholder i kjøleskap(2-8 C) opptil 7 dager. For lengre oppbevaring må prøven fryses i -20 C. Når det er blitt tatt ut en prøve med ekstraksjonsenheten kan denne oppbevares opptil 48 timer i 2-8 C. Etter 48 timer må ekstraksjonsprosessen gjennomføres for at prøven skal kunne benyttes. Lagring av ekstrakter Etter ekstraksjonsprosessen kan den ekstraherte prøven fryses ned og lagres i opptil 3 måneder. Advarsler 1. Både reagens og prøve bør oppnå romtemperatur(18-28 C) før testen startes. 2. Det anbefales å behandle avføringsprøver som smittsomt materiale. 3. For og oppnå pålitelige og kvantitative resultater, må ekstraktet sentrifugeres før man fortsetter med fortynningsprosessen. 4. Ferdig fortynnede prøver må testes innen 2 timer, og kan ikke lagres i lengre perioder. 5. Ufortynnede ekstrakt kan overføres fra ekstraksjonsenhet til rene glass, og fryses ned i opptil 3 måneder i -20 C. Ekstraksjonsprosedyre 1. Ekstraksjonsenheten ristes med en Vortex i sekunder for å få en homogen løsning. 2. Enheten plasseres så på en ristemaskin i 20 minutter. 3. Steg 1 og 2 gjentas for alle prøver som skal analyseres. 4. Etter 20 minutter fjernes alle prøvene fra ristemaskin og plasseres opp ned i sentrifugen. Alle prøvene sentrifugeres samtidig i 5 minutter på 3000rpm. 5. Etter sentrifugering tas prøvene ut en og en. Brekk av den lave enden og overfør supernatanten til et rent rør. Fortynningsprosedyre 1. Ekstraktet fra avføringsprøven fortynnes 1:50( for eksempel 20µl ekstrakt med 980µl fortynningsbuffer). Fortynningen blandes med vortex i 10 sekunder. 2. Prøven er nå klar for testing. Test prosedyre 1. Åpne aluminiums pakningen med testkassetten. Ta ut kassetten og plasser den på en flat overflate. 2. Ta ut 100µl av den fortynnede prøven og plasser den i det runde prøvekammeret i kassetten. 3. Prøven inkuberes ved romtemperatur i 20 minutter. Avlesning av testresultater med CalFast Reader. Som vist på bildet under. 1. Hold <ENTER> inne i 1 sekund for å skru på instrumentet. Vent til instrumentet har utført selvtest og kalibrert seg slik at det er klart til bruk. 2. Kontroller at den valgte metoden på instrumentet er <CalFast>. Hvis dette ikke er tilfelle må denne metoden velges ved å velge <Method>(type test), og så <CalFast>. Bekreft valg ved å trykke <ENTER>. 3. Kontroller at lot nummer i displayet stemmer med det lot nummeret som står oppgitt på esken. Hvis disse numrene ikke matcher må lot nummer i instrumentet oppdateres ved hjelp av strekkodeleseren på instrumentet. 4. Velg <ID Sample> og tast inn prøvens referansenummer ved hjelp av tastene på instrumentet. Trykk <ENTER> for å bekrefte.

4 5. Plasser den ferdige kassetten i skuffen på siden av instrumentet, slik at det runde prøvekammeret er lengst mot høyre. Lukk skuffen. 6. Velg <Measure> og trykk <ENTER>. 7. CalFast Reader vil tolke reaksjonen å oppgi resultatet i mg/kg. Advarsel: For hver nye lot med CalFast prøvesett, må parametere for den aktuelle lotten lastes opp til avlesningsinstrument. Dette gjøres ved å lese av 2D strekkoden på innsiden av produktets eske, ved hjelp av CalFast strekkodeleser. Alle testparametere er gitt i strekkoden på innsiden av lokket på esken til prøvesettet. Hvis man benytter parametere fra en annen lot, vil dette kunne gi feil og upålitelige resultater. Avlesning av testresultater med CalFast Reader New. Som vist på bildet under. 1. Kontroller at instrumentet er koblet til PC eller Laptop med den dedikerte USB kabelen som følger med i esken. Skru på datamaskinen, og logg deg inn programvaren for CalFast med brukernavn og passord. MERK: Det er påkrevd at PC har vært påskrudd i hvert fall 20 minutter før man starter testing. Kontroller at all lot informasjon stemmer med informasjonen oppgitt på utsiden av CalFast settet. Hvis denne informasjonen ikke stemmer må den oppdateres som beskrevet under: Plasser 2D strekkoden som følger med pakningen inn i CalFast instrumentet. Pass på at strekkoden er korrekt plassert. Trykk på ikonet i programmet for å lese av strekkoden. All informasjon vil da automatisk lastes opp i instrumentet. Trykk på for å lagre informasjonen. Trykk på for å gå tilbake. Denne prosedyren må gjennomføres hver gang man tar i bruk en ny lot. All informasjon fra en lot, vil lagres til informasjon fra en ny lot lastes opp. 2. Innlesning av pasientdata. Navn og fødselsdato på pasienten skrives inn i programmet(obligatorisk), man kan også skrive inn pasient nummer(valgfritt). Når dette er gjort vil en grønn lampe på instrumentet lyse, dette indikerer at testkassetten kan plasseres i instrumentet. 3. Kassetten plasseres i instrumentet. For å kontrollere at kassetten er korrekt plassert kan man trykke på «check the strip»(valgfritt). 4. «Check the strip» Batch kode: viser hvilken lot som er i bruk. Kit name: identifiserer produktet som benyttes. Kontroll av strip: benyttes før testen starter(valgfritt). Når denne er aktiv vil et bilde av kassetten vises på skjermen, og man kontrollere at kontroll linjen er korrekt plassert. Hvis kassetten er korrekt plassert vil «READABLE» vises på skjermen. Hvis kassetten ikke er korrekt plassert vil «UNREADABLE» vises. Kontroll strip bilde: Viser kassetten slik den er inne i instrumentet. Analysert bilde: Bilde av kassetten som benyttes til gjennomføring av testen. 5. Kjøring av testen Hvis kassetten er lesbar startes testen ved å trykke på Mens testen pågår vil det gule LED lyset være på, og symbolet byttes ut med. Det vises to bilder av kassetten. Et bilde er det «ekte» bildet, mens det andre er det bildet som benyttes for å analysere prøven. Analysert bilde: Dette er bildet som benyttes for beregninger. Den røde og blå linjen markerer avlesningsområdet for beregningene. Resultatet som beregnes vises i rammen øverst til høyre. Resultatet er bare gyldig hvis testen og kontroll linjen er korrekt plassert mellom den blå og den røde linja. 6. CalFast Reader New leser av og oppgir resultatet fra prøven i mg/kg eller µg/g. 7. Testresultatet lagres automatisk, og knyttes til den aktuelle pasienten.

5 Advarsel: For hver lot med CalFast tester må parameterne for den spesifikke lotten som benyttes lastes opp. Disse parameterne kan lastes opp som beskrevet i steg 2. Bruk av parametere fra feil lot kan gi unøyaktige resultater. For mer informasjon henvises det til brukermanualen for CalFast Reader New. Validering av resultater 1. For at testen skal regnes som gyldig må kontroll linje (C) alltid være på plass. Dette båndet er kun ment for funksjonskontroll. Det kan ikke benyttes for tolkning av test linje (T). 2. Mengden calprotectin i avføringsprøven(t) beregnes ved hjelp av CalFast Reader. 3. Hvis bare testbåndet vises kan ikke testen regnes som gyldig og en ny test med en ny kassett må gjennomføres. 4. Hvis hverken C eller T linjen vises er testen ugyldig og må gjentas med en ny kassett. NB! CalFast Reader New kan kontrollere om prøven kan leses ved hjelp av «check the strip» knappen i programmet. Resultater fra CalFast Reader New 1. CalFast har blitt kalibrert ved hjelp av klinisk informasjon fra pasientene som har blitt testet. I tillegg har man benyttet resultater fra de samme pasientprøvene beregnet med Calprest (ELISA). 2. CalFast benytter en kalibreringskurve som avhenger av lot parameterne for å beregne innholdet av calprotectin. Dette gjør at testen kan detektere calprotectin konsentrasjoner fra mg/kg. Ut ifra dette er det bestemt at CalFast Reader skal vise resultatene som beskrevet i tabellen under. Calprotectin verdier Calprotectin verdier vist på displayet til CalFast Reader 0 50 mg/kg < 50 mg/kg mg/kg Korrekt konsentrasjon vises i displayet > 300 mg/kg > 300 mg/kg Testens referanseområde og tolkning av resultater God laboratoriepraksis tilsier at hvert laboratorie som benytter denne testen, bør beregne sitt eget normal område for resultatene. For å finne dette, er det nødvendig å gjennomføre et signifikant antall tester, før man kan benytte resultatene til å gi en klinisk vurdering. En intern analyse gav disse cut-off verdiene: Negativ: < 70,0 mg/kg Positiv: 70,0 mg/kg Prøver som viser konsentrasjoner over 70,0 mg/kg må regnes som positive med CalFast testen. Disse prøvene bør leveres for videre analyse for å finne årsaken til det forhøyede nivået av calprotectin. Hos friske voksene pasienter, ligger gjennomsnittsverdien av calprotectin rundt 25 mg/kg. Slike resultater vil vises som < 50 mg/kg på CalFast Reader. Calprotectin nivåer er ganske like for barn og voksene, men hos nyfødte kan verdiene være betraktelig høyere. Referanseverdier Kliniske studier har kommet frem til følgende resultater: Frisk normal referanse, medianverdi Kolorektal kreft, medianverdi Inflammatorisk tarmsykdom (CD & UC), medianverdi 25 mg/kg 350 mg/kg 1722 mg/kg Referanser: 1. Fagerhol M.K. et al.: Calprotectin (The L1 leukocyte protein) in: Smith V.L. and Dedman J.R. (eds.): Stimulus response coupling: The role of intracellular calcium-binding proteins. CRC Press, Boca Raton 1990, p Røseth A.G. et al.: Assessment of the neutrophil dominating protein calprotectin in feces. Scand J Gastroenterol 1992;27: Røseth A.G. et al.: Correlation between faecal excretion ofindium-111-labelled granulocytes and calprotectin, a granulocyte marker protein, in patients with inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol 1999; 34: Tibble J. et al.: A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn s disease. Gut 2000;47: Bunn S.K. et al.: Fecal calprotectin: Validation as a noninvasive measure of bowel inflammation in childhood inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001;33: Sohnle P.G. et al.: The zinc-reversible antimicrobial activity of neutrophil lysates and abscess fluid supernatants. Journal of Infectious Diseases 1991;164:

6 7. Steinbakk M. Et al.: Antimicrobial actions of calcium binding leukocyte L1 protein, calprotectin. Lancet 1990;336: Ton H. et al.: B. Improved assay for fecal calprotectin. Clinica Chimica Acta 2000;292: Røseth A.G. et al.: Assessment of disease activity in ulcerative colitis by faecal calprotectin, a novel granulocyte marker protein. Digestion 1997;58: Johne B. et al.: A new fecal calprotectin test for colorectal neoplasia. Clinical results and comparison with previous method. Scand J Gastroenterol 2001;36: CalFast Kode 9191 Pakningsinnhold: 20 tester Revisjonsdato: