Rubella-IgM-ELA Test PKS medac. Norsk 135-PKS-VPN/010512

Transkript

1 RubellaIgMELA Test PKS medac Norsk 0123

2 FABRIKANT medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUSJON medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Telefon: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ TINGE ADDRESS Telefon: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/

3 RubellaIgMELA Test PKS medac Enzyme immunoassay med Pipetterings Kontroll System for påvisning av IgM antistoff mot rubella virus Cat no.: 135PKS KUN FOR INVITRO DIAGNOSTISK BRUK INTRODUKSJON Patogenet som forårsaker rubella, rubella virus tilhører Togaviridae familien og tilhører Rubivirus slekten. Rubella virus er en enkelttrådet RNA genom og forekommer bare som en serotype Rubella forkommer hovedsaklig hos barn og har vanligvis et mildt forløp. Sykdommen er karakterisert ved små flekket utslett ledsaget av lymphadenosis. I løpet av det første trimester av graviditeten kan rubella infeksjoner føre til infeksjon hos fosteret, noe som kan føre til irreversible embryofoetal skade. Rubella virusspesifikt IgM antistoff kan påvises 4 til 30 dager etter utbrudd, og vedvarer i 1 til 4 måneder. IgM påvisning med Rubella IgMELA Test PKS medac en egnet metode for diagnose av akutt rubella virus infeksjon. I sjeldne tilfeller kan IgM antistoff vedvare opp til et år, eller ikke opptre i det hele tatt. Derfor skal IgM resultatet alltid tolkes sammen med anamnese opplysninger og om mulig ytterligere undersøkelse for rubella virus infeksjon. 1

4 TEST PRINSIPP Platen er coated med antihuman IgM immunoglobulin. IgM fra prøven blir selektivt bundet til brønnene. Komplekset av mabperoxidasekonjugat og rubella virus antistoff bindes til rubella virusspesifikt IgM antistoff (AG = antigen, P = peroxidase). Inkubering med TMBsubstrate (*). Reaksjonen stoppes ved tilsetning av svovelsyre. Absorbsjonen avleses fotometrisk. TESTENS FORDELER Ingen uspesifikke reaksjoner og ingen falske positive reaksjoner forårsaket av reumatisk faktor. Ingen blokkering av IgM antistoff ved høyt IgG titer. Pipetterings Kontroll Systemet gjør at en kan visuelt kontrollere hvert enkelt pipetterings stegvis farge endringer. De brytbare mikrobrønn stripsen gir god utnyttelse av kitet. Egnet for automatisering på åpne ELISA systemer. 2

5 KIT INNHOLD Cat. no.: 135PKS 1. MTP Mikroplate: 12 x 8 brønner (merket med RUM, med ramme og tørremiddel, forseglet i en aluminium pose), brytbare, Uform, coated med geit antihuman IgM immunoglobulin, BSA og ph indikator, ferdig til bruk. 2. CONTROL Negativ kontroll: 1 flaske med 1,5 ml, humant serum, ferdig til bruk, inneholder BSA, fenol, ProClin TM 300 og gentamycine sulfat. 3. CONTROL + Positiv kontroll: 1 flaske med 1,5 ml, humant serum, ferdig til bruk, inneholder, BSA, fenol, ProClin TM 300 og gentamycine sulfat. 4. WB Vaskebuffer: 1 flaske med 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4 inneholder ProClin TM VIRDIL Prøve fortynning: 1 flaske med 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, ferdig til bruk, inneholder ProClin TM ANTIGENDIL Antigen fortynning: 1 flaske med 14 ml Tris/NaCl, ferdig til bruk, inneholder ProClin TM ANTIGEN Antigen: 4 flasker med 3,0 ml i hver, rubella virus antigen/bsa, frysetørret. 8. CON Konjugat: 1 flaske med 0,3 ml, antirubella virus IgG antistoff, monoklonalt (mus), HRPkonjugert, rød farget, ferdig til bruk, inneholder BSA, fenol, ProClin TM 300 og gentamycine sulfat. 9. TMB TMBsubstrat: 1 flaske med 10 ml, ferdig til bruk. 10. STOP Stopp løsning: 2 flasker med 11 ml i hver, 0,5 M svovel syre (H 2 SO 4 ), ferdig til bruk. 3

6 1. OPPBEVARING OG HOLDBARHET Material/Reagens Tilstand Lagring Holdbarhet Test kit uåpnet C inntil utløpsdato Mikroplate åpnet C i pose 6 uker med tørre middel Kontroller åpnet C 6 uker Vaskebuffer fortynnet C 6 uker Prøve fortynning åpnet C 6 uker Antigen fortynning åpnet C 6 uker Antigenkonjugat ferdig til C 1 uke blanding bruk TMBsubstrat åpnet C 6 uker Stopp løsning åpnet C inntil utløpsdato Ikke bruk reagenser etter utløpsdato 2. REAGENSER SOM ER NØDVENDIGE, MEN SOM IKKE FØLGER MED I KITET 2.1. Destillert vann (H 2 O redist.). Bruk av deionisert vann kan forstyrre test prosedyren Justerbare mikro pipetter Rene glass eller plastikk beholdere til fortynning av vaske buffer og prøver Passende utstyr for vasking av mikroplater (f. eks. multistepper eller ELISA vasker) Inkubator for 37 C Mikroplate leser med filtre for 450 nm and nm. 3. TILBEREDNING AV REAGENSER Alle kit komponenter må få romtemperatur før bruk. Beregn det nødvendige antall brønner som trenges Mikroplate Aluminium posen må forsegles helt tett igjen etter hver gang det taes ut brønner. Oppbevaring og stabilitet til brønnene er nevnt i avsnitt 1. NB: Mikroplate brønnene har en lyse grønn farge. Eventuell forekomst av grønnaktig og brunfarg på innsiden av brønnene kommer av produksjons prosessen og har ingen innvirkning på testen egenskaper. 4

7 3.2. Vaskebuffer Bland en del vaskebuffer (10x) med ni deler destillert vann (f. eks. 50 ml vaskebuffer (10x) med 450 ml vann). 10 ml fortynnet vaskebuffer rekker til åtte brønner. Krystaller i vaskebufferen (10x) må løses opp ved oppvarming (maks. 37 C) og/eller risting ved romtemperatur Antigenkonjugat blanding Rekonstituer det frysetørrete antigenet med 3,0 ml antigen fortynning til hver flaske. Bland forsiktig og pass på at eventuelle partikler som er festet til korken også blir oppløst. Tilsett 50 µl konjugat til 3,0 ml antigen 60 min før bruk. Etter rekonstituering av antigenet og tilsetning av konjugat får antigenkonjugat blandingen en rød farge og er ferdig til bruk. Den ferdig til bruk antigenkonjugat blandingen kan lagres ved 2 8 C i en uke (se 1.). NB! Må ikke fryse! Ikke bland test spesifikke reagenser (mikroplate, kontroller, konjugat, antigen, antigen fortynning) fra ulike lot numre. Derimot kan prøve fortynning, vaskebuffer, TMBsubstrat og stopp løsning vanligvis blandes innbyrdes med alle virologiske ELISA medac kit. Reagenser fra andre produsenter kan ikke brukes. Gyldige og reproduserbare resultater kan bare oppnåes hvis prosedyre er fulgt nøyaktig. 4. PRØVER 4.1. Testen er for serumprøver. Pasientprøvene kan oppbevares i 7 dager ved 28 C. For lengre oppbevaring må prøvene fryses ved 20 C. Unngå gjentatte tining og frysing av prøvene Forbehandling av sera, f. eks. inaktivering er ikke nødvendig. Men de må ikke være kontaminert med mikroorganismer eller inneholde røde blodlegemer Seraene må fortynnes 1:100 med prøve fortynning. De kan fortynnes ytterligere for titer bestemmelse. 5

8 5.A. TEST PROSEDYRE 5.1. Klipp opp aluminium posen ovenfor zip låsen og ta ut det nødvendige antall mikroplate brønner (se 3.1.). Mikroplate brønnene er ferdig til bruk og trenger ikke å prevaskes La brønn A1 være tom for blank (se 6.A.). Tilsett 50 µl av de fortynnede prøvene, negative og positive kontroll i duplikat til brønnene. Etter pipettering av prøvene (ph nøytrale eller basisk væske) blir brønnene blå. Manglende farge endring i en brønn indikerer at prøve eller kontroll ikke er tilsatt. Hvis nødvendig kan mikroplate brønnene oppbevares i et fuktighets kammer i maksimum 60 minutter ved 2 8 C før videre prosedyre Inkuber mikroplate brønnene i 60 min (± 5 min) ved 37 o C (± 1 C) i et fuktighets kammer, eller forseglet med dekkfolie over brønnene Til lag antigenkonjugat blandingen (se 3.3.) Etter inkubering vaskes mikroplate brønnene tre ganger med 200 µl vaskebuffer per brønn. Pass på at alle brønnene fylles. Etter vaskingen bankes mikroplate brønnene mot et filter papir. Brønnene må ikke få tørke ut! Fortsett umiddelbart! 5.6. Tilsett antigenkonjugat blandingen (rød farget) til hver brønn (unntatt A1). 50 µl antigenkonjugat blanding må pipettere til brønnene hvis testen blir gjort manuelt. NB: Hvis det brukes automatisk utstyr må 60 µl antigenkonjugat tilsettes hver brønn grunnet høyere fordamping i utstyrets inkuberings kammer. Egnetheten til testen for automatisering er bekreftet under evaluering av testen. Men vi anbefaler å kontrollere kompatibiliteten med det utstyret som laboratoriet bruker. 6

9 5.7. Inkuber igjen i 60 min (± 5 min) ved 37 o C (± 1 o C) i et fuktighets kammer, eller forseglet med dekkfolie over brønnene Etter inkubering vaskes mikrobrønnene igjen (se 5.5.) Tilsett 50 µl TMBsubstrat til hver brønn (også A1) og inkuber i mørke i 30 min (± 2 min) ved 37 o C (± 1 C) i et fuktighets kammer, eller forseglet med dekkfolie over brønnene Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 µl stopp løsning hver brønn (også A1). Positive prøver blir gule. Tørk undersiden av mikroplatebrønnene før de leses av i fotometeret og pass på at det ikke er luftbobler I brønnene. Avlesningen må gjøres innen 15 minutter etter tilsetting av stopp løsningen. 5.B. TABELL FOR TEST PROSEDYREN Negativ kontroll Positiv kontroll Prøve Blank (A1) Negativ kontroll 50 µl Positiv kontroll 50 µl Prøve 50 µl Inkuber i 60 min ved 37 C, vask 3x gang 200 µl vaskebuffer Antigenkonjugat blanding 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkuber i 60 min ved 37 C, vask 3x med 200 µl vaskebuffer TMBsubstrat 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkuber mørkt i 30 min ved 37 o C Stopp løsning 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Fotometrisk avlesning ved 450 nm (ref nm) *) manuell/automatisk prosedyre (se 5.6.) 7

10 6.A. BEREGNING AV RESULTATER (VALIDERING) Avles OD verdiene ved 450 nm (referanse bølgelengde nm). Trekk OD til blank (brønn A1) fra alle de andre OD verdiene. Gjennomsnitts OD verdien til den negative kontrollen må være < 0,100. Gjennomsnitts OD verdien til den positive Kontrollen må være > 0,800. Cutoff = gjennomsnitts OD verdi til den negative kontrollen + 0,320 Grå sone = Cutoff ± 10 % Repeter kjøringen hvis resultatene ikke møter spesifikasjonen. 6.B. TOLKNING AV RESULTATER/BEGRENSNINGER TIL METODEN Prøver med OD verdier lavere enn den laveste grensen til grå sonen er NEGATIVE. Prøver med OD verdier i grå sonen er USIKRE. Disse bør retestes sammen med en fersk prøve som er tatt 14 dager senere for å se om det er titer endring. Prøver med OD verdier over den over øvre grensen i grå sonen er POSITIVE. Resultatene skal alltid tolkes sammen med kliniske data og andre diagnostiske parameter. I sjeldne tilfeller kan ANApositive prøver gi falske positive resultater. Meget høye konsentrasjoner av lipider kan lede til høyere OD verdier, noe som kan influere på test resultatet. Høye konsentrasjoner av hemoglobin eller bilirubin har ingen influens på test resultatet. 8

11 7. KARRAKTERISTISKE EGENSKAPER Følgende egenskaper er blitt fastslått under den diagnostiske evalueringen. 7.A. SENSITIVITET OG SPESIFISITET 466 serum prøver, inkludert friske blodgivere, pasienter med mistenkt akutt rubella infeksjon, med IgM antistoff mot andre virus (CMV, HSV, VZV, EBV, Parvo B19), samt sera som inneholdt ANA og reumatoid fakter ble testet med RubellaIgMELA Test PKS medac i sammenligning med en høy spesifikk ELISA som er i bruk i rutine laboratorier. Resultatene er vist i tabellen nedenfor. Referanse test negativ positiv RubellaIgMELA Test PKS negativ medac positiv Sensitivitet = 99,03 % Spesifisitet = 99,17 % Positiv prediktiv verdi: 97,14 % Negativ prediktiv verdi: 99,72 % 7.B. PRESISION Prøve Intraassay Variasjon Prøve Interassay Variasjon Gj.sn. SD CV (%) n Gj.sn. SD CV (%) n OD OD NC 0,025 0, NC 0,024 0, PC 1,235 0, PC 0,962 0, N 1 1,400 0, N 4 0,922 0, N 2 0,930 0, N 5 0,230 0, N 3 0,488 0, N 6 1,159 0, N 7 0,426 0, NC = negativ kontroll; PC = positiv kontroll 9

12 GENERELLE RÅD For å unngå kryss kontaminasjon ikke bland flaskene og de tilhørende korkene. Reagensene må forsegles umiddelbart etter bruk for å forhindre fordampning og mikrobiell kontaminasjon. Etter bruk må reagensene oppbevares som anbefalt for å garantere holdbarheten. Etter bruk må alle komponenter i kitet oppbevares i deres originale forpakning for å unngå blanding med andre reagenser eller lot nr. (se også 3.). HELSE OG SIKKERHETS INFORMASJON De lokale helsemyndigheters reguleringer må følges. Reagenser av human opprinnelse er testet negativt på HbsAg og på antistoff mot HIV1/2 og HCV. Men det anbefales på det sterkes at dette materialet så vel som det som er av animalsk opprinnelse (se kit innhold) skal behandles som potensielt smittefarlig. KASSERING Rester av kjemikalier og reagenser er å anse som risikoavfall. Kassering skal skje i henhold til lokale eller nasjonale regler. Ta kontakt med lokal myndighet som vil gi råd om hvordan risikoavfall skal håndteres. Dato utgave:

13 LITTERATUR Enders, G.: Röteln. Fortschr. Klin. Virol. München, (1986). Hermann, K.L.: Available Rubella serological tests. Rev. Infect. Dis. 7, (1985). Pustowoit, B., Hofmann, J. und Trauer, H.: Rötelnvirus, in: Diagnostische Bibliothek, Bd. 1, Virusdiagnostik, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell WissenschaftsVerlag, (1996). Selb, B.: Rötelnvirus, in: Medizinische Virusdiagnostik, Selb, B. (Hrsg.), Umschau Verlag, (1992). Thomas, H.I., MorganCapner, P., Roberts, A., Hesketh, L.: Persistent rubellaspecific IgM reacitivity in the absence of recent primary rubella and rubella reinfection. J. Med. Virol. 36, (1992). Wolinsky, J.: Rubella, in: Virology, 2. Edition, Field, B. N., Kiepe, D. M. et al. (Eds.), Raven Press, Ltd., New York (1990). 11