INNHOLDSFORTEGNELSE 1. TILTENKT BRUK 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN 3. ANALYSEPRINSIPP 4. KITTETS INNHOLD OG REAGENSKLARGJØRING

Transkript

1 PLATELIA HSV (1 + 2) IgM 96 TESTER IMMUNENZYMATISK FANGSTMETODE FOR KVALITATIV BESTEMMELSE AV ANTISTOFFER AV IgM-TYPEN MOT HERPES SIMPLEX VIRUS (TYPER 1 OG 2) I HUMANT SERUM INNHOLDSFORTEGNELSE 1. TILTENKT BRUK 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN 3. ANALYSEPRINSIPP 4. KITTETS INNHOLD OG REAGENSKLARGJØRING 5. OPPBEVARING OG STABILITET FOR REAGENSENE 6. FORSIKTIGHETSREGLER 7. PRØVETYPE OG OPPBEVARING 8. ANALYSEPROSEDYRE 9. SKJEMA FOR ANALYSEPROSEDYRE 10. VALIDERING AV ANALYSEN 11. TOLKNING AV RESULTATER 12. BEGRENSNINGER VED PROSEDYREN 13. ANALYTISK SPESIFISITET 14. DIAGNOSTISK SENSITIVITET OG SPESIFISITET 15. PRESISJON 16. FEILSØKING 17. REFERANSER Ref /BRD 1/10

2 1. TILTENKT BRUK IMMUNENZYMATISK FANGSTMETODE FOR KVALITATIV BESTEMMELSE AV ANTISTOFFER AV IgM- TYPEN MOT HERPES SIMPLEX VIRUS (TYPER 1 OG 2) I HUMANT SERUM 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN Herpes simplex-viruset (HSV) er medlem av Herpesviridae-familien som har to kjente typer: Type 1 (HSV- 1) og type 2 (HSV-2) og disse har små antigene forskjeller. HSV-1 forårsaker hovedsaklig sår i munn og ansikt, mens HSV-2 hovedsaklig fører til sår på kjønnsorganer, men denne forskjellen er ikke absolutt da begge typer enkelte ganger kan føre til infeksjoner begge steder. HSV kan også føre til en type okular keratitt og lesjoner på sentralnervesystemet. HSV kan i praksis ramme hele befolkningen. Primærinfeksjonen er ofte en subklinisk form og blir sjelden diagnostisert. Etter en varierende latent periode, kan reaktivering skje, og virusreplikasjon kan eller kan ikke gi en utvikling av kliniske lesjoner. Infeksjon som er påført under fødselen er av spesiell interesse, da dette er en viktig årsak til sykelighet og død. Derfor er det viktig å bestemme immunitetsstatus for kvinner under graviditeten for å påvise serumkonvertering. Analysen for spesifikk IgM er viktig for diagnostisering av neonatal infeksjon og encefalitt forårsaket av HSV. Videre kan nærvær av spesifikt IgM indikere pågående virusaktivitet, selv om det ikke er mulig å skille mellom primær infeksjon og reaktivering. 3. ANALYSEPRINSIPP Testen for analysering av HSV IgM er basert på prinsippet om fangst av disse immunglobulinene og etterfølgende identifikasjon av de spesifikke, og å benytte deres evne til å binde et antigen som er konjugert til peroksidase (1-8). Fangingen utføres med monoklonale antistoffer bundet til fast fase (mikrotiterbrønner). Antigenet som er sammensatt av renset, inaktivert HSV type 1 og type 2. Konjugatet er sammensatt av spesifikke anti-hsv monoklonale antistoffer merket med peroksidase. 4. KITTETS INNHOLD OG REAGENSKLARGJØRING - Det er tilstrekkelig reagens til 96 bestemmelser. Må ha romtemperatur før bruk. MT PLATE CONTROL + MIKROPLATE. 12x8 brønner belagt med anti-humane IgM monoklonale antistoffer. Bruk: Åpne pakningen i motsatt ende av koden (M fulgt av lottnummeret) som er nyttig til identifikasjonsformål, fjern vedlegg og de strimlene som skal brukes fra foliepakningen og plasser de ubrukte strimlene i polytenposen med kiselgel, klem ut luften og forsegl ved å trykke på lukkemekanismen. POSITIV KONTROLL (1 x 1,6 ml) Innhold: Fortynnet humant serum (med anti-hsv IgM-antistoffer) i fosfatbuffer 0,01 mol/l, med BSA 1 % og natriumazid 0,09 %, flytende, klar til bruk uten videre fortynning. Farge: Fargen er proporsjonal med relativ antistofftiter. CONTROL CUT OFF CUT-OFF-KONTROLL (1 x 2,5 ml) Innhold: Fortynnet humant serum (med anti-hsv IgM-antistoffer) i fosfatbuffer 0,01 mol/l, med BSA 1 % og natriumazid 0,09 %, flytende, klar til bruk uten videre fortynning. Farge: Fargen er proporsjonal med relativ antistofftiter. Ag CONJ ANTIGEN. Frysetørket pudder x 6 flasker. Innhold: Renset Herpes Simplex-virus, I fosfatbuffer med ascitesvæske fra mus og laktose. Klargjøring: Rekonstituer med mengden konjugat som er vist på etiketten og bland ved å vende flasken. KONJUGAT (1 x 18 ml) Innhold: Monoklonale antistoffer merket med peroksidase, i fosfatbuffer med fenol 0,05 % og Bronidox 0,02 %. Klargjøring: Klar til bruk. Immunkomplekset må klagjøres ca. 45 min. før bruk. Ref /BRD 2/10

3 CONTROL IgM - IgM NEGATIV KONTROLL (PF93900) (1 x 1,6 ml) KAN BRUKES FOR ALLE LOTTER Innhold: Fortynnet humant serum i fosfatbuffer 0,01 mol/l, med BSA 1 % og natriumazid 0,09 %, flytende, klar til bruk uten videre fortynning. WASH BUF 10x VASKEBUFFER 10X (PF93603) (1 x 100 ml) KAN BRUKES FOR ALLE LOTTER Innhold: Fosfatbufret saltvann, konsentrert 10 ganger, tilsatt Brij 0,5 %. Klargjøring: Fortynn nødvendig volum 1:10 med destillert vann for å få vaskebufferen klar til bruk. Dersom det finnes krystaller må de løses ved 37 C før fortynning. SAMP DIL SUBS TMB H 2 SO M DILUENT 2 (PF93611). 1 x 100 ml. For fortynning av serumprøver. Klar til bruk. KAN BRUKES FOR ALLE LOTTER Innhold: Proteinløsning i fosfatbuffer med natriumazid 0,09 % og metyloransje som fargestoff. SUBSTRAT (PF93619). (15 ml). Klar til bruk. KAN BRUKES FOR ALLE LOTTER Innhold: Tetrametylbensidin 0,26 mg/ml og hydrogenperoksid 0,01 % stabilisert i citratbuffer 0,05 mol/l (ph 3.8). STOPPLØSNING (PF93602). (1 x 16 ml). KAN BRUKES FOR ALLE LOTTER H 2 SO 4 0,3 mol/l, i løsning, klar til bruk. KLEBENDE FILM (2) POLYTENPOSE (1) NØDVENDIGE MATERIALER SOM IKKE MEDFØLGER. - Inkubator på 37 C - Mikroplateleser (bølgelengde 450 eller 450/620 nm, med linearitet opp til OD >= 2000). - Mikroplatevasker (foretrukket) som kan dispensere volumer i området µl - Destillert eller avionisert vann - Normalt laboratorieutstyr i glass: sylindre, testglass etc. - Mikropipetter for nøyaktig pipettering av 10, 100 og 1000 µl løsning - Engangshansker - Timer - Natriumhypoklorittløsning (5 %) - Beholdere for innsamling av potensielt smittsomme materialer - Cellestoff 5. OPPBEVARING OG STABILITET FOR REAGENSENE Reagenser må oppbevares ved 2/8 C. Utløpsdatoen er trykket på hver komponent og på eskens etikett. Reagenser har begrenset stabilitet etter åpning og/eller klargjøring REAGENS BETINGELSE Mikroplate 5 uker ved 2/8 C, polytenpose Kontroller 5 uker ved 2/8 C Konjugat 5 uker ved 2/8 C Rekonstituert antigen Må brukes same dag. Kan ikke fryses Substrat Til utløpsdatoen ved 2/8 C, 1 uke ved C, oppbevares mørkt Prøvefortynner Til utløpsdatoen ved 2/8 C Vaskebuffer 2 uker ved 2/8 C, 5 dager ved 15/30 C Stoppløsning Til utløpsdatoen ved 2/8 C Ref /BRD 3/10

4 6. FORSIKTIGHETSREGLER KUN TIL IN VITRO DIAGNOSTISK BRUK. Forsiktig: Dette kittet inneholder materialer av human opprinnelse som er testet og funnet negative med FDAgodkjente metoder for nærvær av HbsAg og anti-hiv-1-, anti-hiv-2- og anti-hcv-antistoff. Siden ingen diagnostiske tester kan gi fullstendig garanti angående fravær av smittsomme stoffer, må alt materiale av human opprinnelse håndteres som potensielt smittefarlig. Alle forholdsregler som normalt brukes i laboratoriepraksis må følges ved håndtering av materialer av human opprinnelse. Informasjon om helse og sikkerhet 1. Ikke pipetter med munnen. Bruk beskyttelseshansker og vernebriller ved håndtering av prøver og utførelse av analysen. Vask hendene godt etterpå. 2. Følgende reagenser inneholder små konsentrasjoner av farlige eller irriterende substanser: a) Vaskebufferen inneholder rengjøringsmidler b) Konjugatet inneholder fenol c) Substratet er syre d) Kontrollene inneholder 0,09 % natriumazid som kan reagere med bly- og kobberrør og danne høyeksplosive avleiringer av metallazider. Skyll med store mengder vann for å eliminere dette. Hvis noen av reagensene kommer i kontakt med hud eller øyne, må området vaskes grundig med vann. 3. Utstyr som skal brukes flere ganger må steriliseres etter bruk. Den foretrukne metoden er å autoklavere i en time ved 121 C. Engangsutstyr må autoklaveres eller brennes. 4. Svovelsyre som er nødvendig i stoppløsningen og saltsyre som brukes for å vaske glassutstyr er etsende og må håndteres på egnede måter. Hvis de kommer i kontakt med hud eller øyne, må det vaskes grundig med vann. 5. Nøytraliserte syrer og annet flytende avfall må dekontamineres ved å tilsette tilstrekkelig natriumhypokloritt til å få en sluttkonsentrasjon på minst 1,0 %. 30 minutters eksponering med 1 % natriumhypokloritt kan være nødvendig for å sikre effektiv dekontaminasjon. 6. Søl av potensielt smittsomme materialer må fjernes umiddelbart med cellestoff og det forurensede området vaskes med f.eks. 1,0 % natriumhypokloritt før arbeidet fortsetter. Natriumhypokloritt må ikke brukes på søl som inneholder syre hvis ikke området med søl først er tørket tørt. Materialer som brukes for å tørke opp søl, inkludert hansker, må kastes som potensielt helseskadelig avfall. Ikke autoklaver materialer som inneholder natriumhypokloritt. Analytiske forholdsregler 1. Alle reagenser og prøver må ha romtemperatur (18-30 C) før bruk. Umiddelbart etter bruk må reagensene settes tilbake til anbefalt oppbevaringstemperatur. Det er viktig å arbeide med riktig temperatur. Kontroller at termostaten ikke går under 35 C eller over 39 C. Åpne omslaget som inneholder strimmelen etter minst ½ t i romtemperatur. 2. Ikke bruk reagenser etter angitt utløpsdato. Mikrobiologisk forurensning av reagenser må unngås da dette kan redusere levetiden for produktet og forårsake feil resultater. 3. Ikke modifiser analyseprosedyren eller bytt ut med reagenser fra andre produsenter eller andre lotter hvis det ikke er angitt at reagensene kan byttes om. Ikke reduser noen av de anbefalte inkubasjonstidene. 4. Alt glassutstyr som skal brukes til reagensene må vaskes grundig med 2 M saltsyre og deretter skylles med destillert vann eller deionisert vann med høy kvalitet. 5. Ikke utsett reagensene for sterkt lys eller hypoklorittdamp under oppbevaring eller under inkubasjonstrinnene. 6. Ikke la brønnene tørke inn under analyseprosedyren. 7. Påse at ikke reagensene krysskontamineres. Det er viktig med en pipette for hvert enkelt reagens. 8. Sørg for å unngå å berøre eller sprute på kanten av brønnen med konjugat. Ikke "blås ut" fra mikroplater. 9. Enzymatiske immunanalyser kan enkelte ganger vise en rand-effekt som må minimaliseres ved å øke luftfuktigheten under inkubasjonstrinnene. Platene må tildekkes med dekslene og inkuberes ved 37 C, enten i et vannbad med et stativ eller en flåte for om nødvendig å støtte platene, eller i en inkubator. Alternativt kan platene inkuberes i en godkjent analysator. Se egnet brukerhåndbok for ytterligere informasjon. CO 2 -inkubatorer må ikke brukes. 10. Sørg for at bunnen av platen er ren og tørr og at ingen bobler finnes på væskeoverflaten før platen leses. 11. Bruk av svært hemolyserte prøver, ufullstendig koagulert sera, eller prøver med mikrobiell kontaminasjon kan gi en økning i feil resultater. Ref /BRD 4/10

5 12. For hvert instrument som brukes, må produsentens instruksjonshåndbok leses grundig for å få ytterligere informasjon om følgende punkter: - installasjon og spesielle behov - bruksprinsipp, instruksjoner, forholdsregler og risiko - produsentens spesifikasjoner og instrumentytelse - service og vedlikehold. 7. PRØVETYPE OG OPPBEVARING Prøven består av serum som er tatt på vanlig mate fra en vene og håndtert med alle forholdsregler med hensyn til god laboratoriepraksis. Friskt serum kan oppbevares i 4 dager ved 2/8 C, eller frosset i lengre tid ved 20 C. Unngå gjentatt frysing og tining. Tinte prøver må ristes grundig før analysering. Inaktivering av varme kan gi feil resultater. Kvaliteten på prøvene kan påvirkes alvorlig av mikrobiell forurensning som fører til feil resultater. Sterkt lipemiske, ikteriske eller forurensede prøver må unngås. Analysen kan ikke utføres på humant plasma. 8. ANALYSEPROSEDYRE Manuell teknikk - Klargjør nødvendig antall strimler. - Klargjør vaskebufferen ved å fortynne Wash Buffer 10x (100 ml ml H 2 O). - Klargjør immunkomplekset ved å rekonstituere frysetørket pudder med konjugatet (volumet er vist på etiketten). Fortynn prøver 1:101 ved å distribuere 10 µl serum i 1 ml diluent. La en brønn være igjen til blank der det tilsettes 100 µl substratblanding. Dispenser 100 µl av hver fortynnede prøve per brønn (duplikatanalysering er nødvendig). Dispenser UFORTYNNEDE kontroller på en strimmel (100 µl i hver brønn). Minimumsantallet er 1 negativ kontroll, 2 cut-off og 1 positiv kontroll. Brønnene dekkes med beskyttende film og inkuberes i 45 minutter ved 37 C. Etter fire vaskinger i 30 sekunder (300 µl), tilsettes 100 µl immunkompleks (antigen/monoklonale antistoffer som er anti HSV-merket med HRP) til hver brønn og inkuberes på nytt i 45 minutter ved 37 C mens brønnene er dekket med beskyttende film. Platen vaskes duretter 4 ganger som beskrevet ovenfor. Til slutt distribueres substratet med 100 µl/brønn. Etter 15 minutter ved romtemperatur stoppes den enzymatiske reaksjonen med 100 µl stoppløsning. Absorbansen (OD) leses av ved 450 nm eller 450/620 nm innen 30 min. Manuell teknikk 9. ANALYSEPROSEDYRE FOR PLATELIA HSV IgM TRINN 1: Fordel 100 µl fortynnede prøver/kontroller i strimmelens brønner Inkuber i 45 min. ved 37 C Vask 4 ganger (300 µl) TRINN 2: Tilsett 100 µl immunkompleks til hver brønn Inkuber i 45 min. ved 37 C Vask 4 ganger (300 µl) TRINN 3: Tilsett 100 µl substrat til hver brønn Inkuber i 15 min. ved R.T. TRINN 4: Tilsett 100 µl stoppløsning Avles absorbansen ved 450 nm innen 30 min. Ref /BRD 5/10

6 10. VALIDERING AV ANALYSEN Subtraher blankverdien (<= 0,150) fra alle andre avlesninger. OD-verdien for Cut-off-kontrollen må være innen 25 % av gjennomsnittsverdien ved analysering i triplikat. Subtraher blankverdien (<= 0,150) fra alle andre avlesninger. Positiv kontroll må ha en OD på minst 1,5 ganger den for cut-off-kontrollen. Forholdet mellom negativ kontroll og cut-off må være mindre enn 0,6. OD for cut-off må være >= 0,2 ved 450 nm og >= 0,16 ved 450/620 nm. 11. TOLKNING AV RESULTATER Kvalitative resultater Hvis absorbansen for prøven er høyere enn den for cut-off, er prøven positiv for nærvær av spesifikt IgM. Beregn forholdet mellom OD-verdien for prøven og den for cut-off (INDEKS). Prøven betraktes som: Positiv: Hvis forholdet er > 1,2 Usikker: ± 20 % av cut-off Negativ: Hvis forholdet er < 0,8 Hvis resultatet er usikkert, må analysen gjentas. Hvis det forblir usikkert må man ta en ny serumprøve. 12. BEGRENSNINGER VED PROSEDYREN Som med mange andre serologiske tester tjener de gitte resultater kun som hjelp til å diagnostisere og må alltid tolkes sammen med andre funn. Parede prøver kreves for å bestemme serokonversjon. Ta den første prøven så snart som mulig etter at symptomene oppstod og den andre prøven 2-3 uker senere. Hvis den første prøven er tatt for sent under infeksjonen, oppdages kanskje ikke serokonversjon. Hvis testresultatene som oppnås med parede prøver er usikkert må prøvene analyseres på nytt. Resultatene må alltid tolkes sammen med en bedømming av det kliniske bildet og resultatene fra andre diagnostiske undersøkelser. 13. ANALYTISK SPESIFISITET 87 serumprøver med potensielt interfererende substanser ble testet: - Antinukleære antistoffer (ANA) (n=12) - Revmatoid faktor (n=8) - Heterofile antistoffer (n=5) - Bilirubin (n=9) - Triglyserider (n=10). - Cytomegalovirus IgM (n=23) Ikke i noe tilfelle ble det registrert interferens. 14. DIAGNOSTISK SENSITIVITET OG SPESIFISITET I et klinisk forsøk utført på et sykehuslaboratorium, ble 313 prøver analysert med Platelia kittet og sammenlignet med annen kommersiell metode. Alle uoverensstemmende prøver ble analysert med en tredje kommersiell metode. Resultatene er lagt inn i tabellen nedenfor. REFERANSEMETODE Platelia HSV IgM Platelia HSV IgM-kittet har en sensitivitet på 95,6 % og en spesifisitet på 97,8 %. Ref /BRD 6/10

7 15. PRESISJON Presisjon innen serie Prøve HSM 1 HSM 2 HSM 3 Cut Off Positiv (Negativ<Cut Off) (Positiv> (Positiv) kontroll Cut Off) n (gjentakelser) OD 0,202 0,643 0,816 0,638 1,404 CV % 23% 14% 8% 15% 6% Presisjon mellom serier INDEKS Media CV % Pos. Kontr. 5,8 6 HSM1 0,4 14 HSM2 1,2 13 HSM3 2,0 11 Presisjon mellom lotter INDEKS PRØVE Lotnr. 128 Lotnr. 129 Lotnr. 130 Media CV % HSM1 0,4 0,4 0,3 0,4 16 HSM2 1,3 1, ,2 9 HSM3 2 2,0 1,7 2, VEILEDNING FOR FEILSØKING PROBLEM MULIG ÅRSAK TEST ELLER HANDLING Ugyldig analysering (alle negative) Ett eller flere reagenser er ikke tilsatt eller tilsatt i feil rekkefølge Sjekk prosedyren på nytt. Sjekk om noen løsning er ubrukt. Gjenta analysen. Platen er ikke reaktiv Sjekk koden på pakningen som inneholder platen (se pakningsvedleggets punkt 4 for korrekt kode). Sjekk om det er fuktighet i ubrukt plate. (Kiselgeltørkemidlet må være lys gult). Gjenta analysen. Ugyldig analysering (alle Forurensing av substratet. Ta en ny porsjon substrat. positive) Utilstrekkelig vask Sørg for at vaskestasjonen fungerer godt. Dårlig presisjon Utilstrekkelig brønnvask Sørg for at vaskestasjonen fungerer godt. Utilstrekkelig aspirasjon av Sørg for at vaskestasjonen fungerer godt. brønner Pipetteringsfeil Sjekk pipettefunksjonen. Reagenset tilsettes for sakte Unngå at platen tørker etter vasketrinn. Tilsett reagenset umiddelbart. Det finnes bobler Unngå bobler under pipettering. Optisk lysvei er ikke ren. Sjekk om det er skitt på lyskilde og Utilstrekkelig fargeutvikling Feil inkubasjonstider eller temperatur. Utilstrekkelig mengde substrat er tilsatt platen. detektor. Tørk platens bunn med cellestoff. Sjekk temperaturkontroll og tidsovervåking. Følg anbefalt bruksanvisning. Sjekk pipettefunksjonen. Ref /BRD 7/10

8 17. REFERANSER 1. G.B. Wisdom: Enzyme-Immunoassay. Clin. Chem. 22: 1243 (1976). 2. S. Land et al.: Rapid diagnosis of herpes simplex virus infections by enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 19: 865 (1984). 3. B. Gonik et al.: Comparison of two enzyme-linked immunosorbent assays for detection of herpes simplex virus antigen. J. Clin. Microbiol. 29: 436 (1991). 4. C. Gleaves et al.: Evaluation of an enzyme immunoassay for the detection of herpes simplex virus (HSV) antigen from clinical specimens in viral transport media. J. Virological Meth. 28: 133 (1990). 5. M. Morgan and T. Smith: Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of herpes simplex virus antigen. J. Clin. Micronbiol. 19: 730 (1984). 6. D. Ho et al.: Indirect ELISA for the detection of HSV-2 specific IgG and IgM antibodies with glycoprotein G (gg-2). J. Virological Meth. 36: 249 (1992). 7. R. Eberle et al.: The immune response to herpes simplex virus: comparison of the specificity and relative titers of serum antibodies directed against viral polypeptides following primary herpes simplex virus type 1 infections. J. Med. Virology 16: 1247 (1985). 8. J.E. Kuhn et al.: Analysis of the IgM and IgG antibody response against herpes simplex virus type 1 (HSV-1) structural and nonstructural proteins. J. Medical Virology 23: 135 (1987). - CE-merking (Europeisk direktiv 98/79/CE for in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr) - Kun til in vitro-diagnostikk - Produsent - Temperaturgrense for oppbevaring - Se bruksanvisning De andre språkene som er nødvendig i samsvar med det europeiske direktivet kan fås fra din lokale representant for Bio-Rad. Bio-Rad , boulevard Raymond Poincaré 07/ Marnes-la-Coquette Frankrike Tlf. : +33 (0) Faks : +33 (0) Ref /BRD 8/10