Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

Transkript

1 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 96 For kvalitativ påvisning av humant papillomavirus (HPV) type 16, 18 og 45. For bruk med digene HC2 High-Risk HPV DNA Test QIAGEN Germantown Road Germantown, MD USA QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse Hilden TYSKLAND NO Rev. 02 Sample & Assay Technologies

2

3 Innhold Bruksområde 6 Sammendrag og forklaring 6 Prinsippene for prosedyren 7 Denaturering 7 Hybridisering 7 Hybrid-capture 7 Hybridpåvisning 7 Vasking 8 Signalforsterkning 8 Medfølgende materialer 10 Settets innhold 10 Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger 11 Utstyr og materiale som er tilgjengelig fra QIAGEN 11 Tilleggsutstyr og materiale for PreservCyt-prøveklargjøring 12 Advarsler og forsiktighetsregler 13 Advarsler 13 Forsiktighetsregler 16 Oppbevaring og håndtering av reagens 18 Komponenter i settet 18 Klargjorte reagenser 18 Prøvetaking og -klargjøring 18 Livmorhalsprøver i STM 18 Livmorhalsprøver i PreservCyt-løsning 19 Prosedyre 20 Klargjøring av reagenser 22 Klargjøring av prøver 27 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 3

4 Protokoll 1: Denaturering 28 Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding 30 Protokoll 3: Hybridisering og hybrid-capture 33 Protokoll 4: Hybridpåvisning 35 Protokoll 5: Vasking 37 Protokoll 6: Signalforsterkning 40 Protokoll 7: Måle capture-mikroplaten og generere resultater 41 Tolking av resultater 42 Resultater fra testingen 42 Feilsøkingsveiledning 42 Kvalitetskontroll 52 Verifisering av analysekalibrering 52 Probespesifikke kvalitetskontroller 55 Begrensninger 55 Ytelsesegenskaper 56 Overenstemmelse mellom digene HPV Genotyping PS Test og en validert kvantitativ PCR HPV-genotypingstest 56 Analytisk spesifisitet 58 Reproduserbarhet 58 Gjenvinning av DNA for STM og PreservCyt-prøver 60 Kryssreaktivitet 60 Effekt av blod og andre substanser på STM-prøver 62 Effekt av blod og andre substanser på PreservCyt-prøver 62 Referanser 62 Siterte referanser 63 Symboler 64 Kontaktinformasjon 65 4 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

5 Vedlegg A: Prosedyrer for kontaminasjonsevaluering 66 Deteksjonsreagens 2 66 Vaskeapparat og/eller vannkilden 66 Automated Plate Washer 67 Vedlegg B: Skjema for registrering av testdata 69 Bestillingsinformasjon 70 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 5

6 Bruksområde digene HPV Genotyping PS Test er en reflekstest beregnet på kvalitativ påvisning av høyrisiko HPV type 16, 18 og 45 etter et positivt digene HC2 High-Risk HPV DNA Testresultat (kvalitativ påvisning av 13 høyrisikotyper). Identifisering av høyrisiko HPV type 16, 18 og 45 gir ytterligere informasjon for å bidra til klinisk styring av kvinner i screeningsprogrammer for livmorhalskreft. Livmorhalsprøver som kan testes med digene HPV Genotyping PS Test inkluderer følgende: Prøver som er samlet inn med digene HC2 DNA Collection Device Prøver som er samlet inn med en kostlignende prøvetakingsenhet eller en kombinert børste-/spatelprøvetakingsenhet, og deretter plassert i PreservCyt løsning Sammendrag og forklaring Forekomsten av enkelte HPV-typer i skjeden er forbundet med en rekke sykdommer, herunder kondylom, Bowenoid papulose og cervikal, vaginal og vulval intraepitelial neoplasi og karsinom (1 3). Det er generelt akseptert at disse virusene hovedsakelig overføres seksuelt, og at høyrisiko HPV-typene er den største erkjente risikofaktoren for utvikling av livmorhalskreft (4 8). Humane papillomavirus består av et ikosahedral viralt partikkel (virion) som inneholder et dobbelttrådet, sirkulært DNA-molekyl med 8000 basepar, omgitt av en proteinkappe. Etter infeksjon i epitelcellene blir viralt DNA etablert gjennom hele epitelets tykkelse, men intakte virioner finnes kun i de øvre lagene av vevet. Viralt DNA kan derfor finnes enten i virioner eller som episomale eller integrerte HPV-sekvenser, avhengig av lesjonens type og grad. Indirekte holdepunkter for anogenital HPV-infeksjon kan oppnås ved hjelp av fysiske undersøkelser og forekomsten av karakteristiske celleendringer forbundet med viral replikasjon i cervikale celleprøver eller biopsiprøver. Alternativt kan biopsiprøver analyseres ved bruk av nukleinsyrehybrydisering for å direkte påvise forekomsten av HPV-DNA. Kvinner med normal cytologi som samtidig tester positivt for HPV 16 eller 18 har en anslått sannsynlighet på henholdsvis 26,7 % og 19,1 % for å utvikle 6 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

7 cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) 3 eller verre innen 12 år etter oppfølging (9). I tillegg var HPV-typene 16, 18 og 45 de tre vanligste genotypene funnet i skvamøst cellekarsinom, adenokarsinom og adenoksvamøst cellekarsinom. De tre HPV-typene utgjorde samlet 75 % av tilfellene av skvamøst cellekarsinom og 94 % av tilfellene av adenokarsinom (10). Det er også påvist at tumorer som inneholder HPV 18 eller 45 har mer enn dobbelt så høy sannsynlighet for å forårsake dødsfall enn tumorer som inneholder andre HPVtyper (11). Prinsippene for prosedyren digene HPV Genotyping PS Test, som benytter Hybrid Capture 2 (HC2)- teknologi, er en in vitro hybridiseringsanalyse av nukleinsyrer som bruker typespesifikke oligoribonukleotider, antistoff-capture og kvalitativ kjemiluminescerende signalpåvisning. Testen, utført i triplikat for hver livmorhalsprøve, genotyper for tre høyrisikotyper (16, 18 og 45) av HPV-DNA i livmorhalsprøver. Denaturering Livmorhalsprøver behandles med en baseløsning, som forstyrrer viruset og frigjør mål-dna. Hybridisering Mål-HPV-DNA hybridiseres med spesifikke RNA-prober som skaper DNA-RNAhybrider. Hybrid-capture Antistoffer, spesifikke for DNA-RNA-hybridene og belagt på overflaten til en mikroplatebrønn, fanger opp DNA-RNA-hybridene. Hybridpåvisning Når deteksjonsreagens 1 (DR1) tilsettes, reagerer de immobiliserte DNA-RNAhybridene med alkalisk fosfatase-konjugerte antistoffer som er spesifikke for DNA-RNA-hybridene. En rekke alkaliske fosfatasemolekyler konjugeres til hvert Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 7

8 antistoff, og flere antistoffer bindes til hver immobiliserte DNA-RNA-hybrid, som fører til betydelig signalforsterkning. Vasking DNA RNA-hybridkomplekset vaskes for å fjerne ubundet materiale. Signalforsterkning Når deteksjonsreagens 2 (DR2) tilsettes, inntreffer en kjemiluminescerende reaksjon når subtratet spaltes av den bundede alkaliske fosfatasen. Det utstrålte lyset måles som relative lysenheter (Relative Light Units RLU) på et DMLinstrument. Intensiteten til det utstrålte lyset angir forekomsten av mål-dna i prøven. 8 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

9 Arbeidsprosess for hybrid-capture Denaturering Hybridisering RNA-probe Enkelttrådet DNA DNA-RNA-hybrid Hybrid-capture Hybridpåvisning Vasking Signalforsterkning Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 9

10 Medfølgende materialer Settets innhold digene HPV Genotyping PS Test (96) Katalognr Antall tester* 96 HPV Negative Control 1 (HPV negativ kontroll 1) HPV Positive Control 1 (HPV positiv kontroll 1) HPV Negative Control 2 (HPV negativ kontroll 2) HPV Positive Control 2 (HPV positiv kontroll 2) Denaturation Reagent (Denatureringsreagens) Indicator Dye (Indikatorfargestoff) Probe Diluent (Probefortynningsmiddel) Detection Reagent 1 (Deteksjonsreagens 1) Detection Reagent 2 (Deteksjonsreagens 2) Wash Buffer x15 (Vaskebuffer x15) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 12 ml 0,35 ml 5,5 ml 12 ml 12 ml 2 x 100 ml HPV 16 Probe ASR (HPV 16-probe ASR) 110 µl HPV 18 Probe ASR (HPV 18-probe ASR) 100 µl * Antallet testresultater varierer avhengig av antallet anvendelser pr. sett, siden kontroller kreves for hver utførelse av testen. Antallet tillatte fryse-/tinesykluser for de denaturerte kontrollene kan også være en faktor i antallet anvendelser pr. sett. Se Alternativt stoppunkt, side 29, for mer informasjon. 10 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

11 HPV 45 Probe ASR (HPV 45-probe ASR) 100 µl 5,5 % NP-40 2 x 1,5 ml Capture Microplate (Capture-mikroplate) 1 Materialer som er nødvendige, men som ikke medfølger Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. Du finner mer informasjon på det aktuelle sikkerhetsdatabladet (MSDS) som fås fra leverandøren av produktet. Utstyr og materiale som er tilgjengelig fra QIAGEN digene Hybrid Capture 2-system ( digene HC2-system ), som består av et QIAGEN-godkjent luminometer ( DML-instrument ), QIAGEN-godkjent datamaskin og tilhørende periferiutstyr (monitor, tastatur, mus, skriver og skriverkabel), digene HC2-systemprogramvare ( digene assay analysis software ), LumiCheck Plate-programvare og brukerhåndboken for digene HC2-systemprogramvaren (digene HC2 System Software User Manual). Hybrid Capture System Rotary Shaker I Hybrid Capture System Automated Plate Washer Hybrid Capture System Multi-Specimen Tube (MST) Vortexer 2 (tilleggsutstyr) Hybridiseringsmikroplater Mikroplatelokk Ekstra lange pipettespisser Reagensbeholdere til engangsbruk DuraSeal TM prøveglassforseglerfilm Plateforseglere Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 11

12 Utstyr og tilbehør til generell laboratoriebruk Inkubatorshaker som kan opprettholde en temperatur på 55 ± 2 ºC og rysting ved 1100 ± 100 rpm Mikrosentrifuge Vorteksblander med koppfeste Enkeltkanals pipette; variable innstillinger for µl og µl volum Repeterende positiv fortrengningspipette, slik som Eppendorf Repeater pipette Pipette med åtte kanaler (multikanals); variable innstillinger for µl volum Tidtaker Natriumhypoklorittløsning, 0,5 % v/v Parafilm eller tilsvarende Engangspipettespisser med aerosol-barriere for enkeltkanals pipetter ( µl og µl) Engangsspisser for repeterende positive fortrengningspipetter (12,5, 5, 2,5 og1,25 ml) Engangsspisser for pipette med åtte kanaler ( µl) KimTowels våtservietter eller tilsvarende lofritt papirhåndkle Alkoholvåtservietter Engangsbenkdeksel Pudderfrie engangshansker 1,5 ml og/eller 5 ml polypropylenglass med rund bunn Flytende stativ til mikrosentrifugeglass Tilleggsutstyr og materiale for PreservCyt-prøveklargjøring Se bruksanvisningen for digene HC2 Sample Conversion-settet. 12 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

13 Advarsler og forsiktighetsregler Til in vitro-diagnostisk bruk. Advarsler Bruk alltid egnet laboratoriefrakk, engangshansker og vernebriller ved arbeid med kjemikalier. For mer informasjon, se gjeldende sikkerhetsdatablad (MSDS). Disse er tilgjengelige på nettet i praktisk og kompakt PDF-format på Her kan du finne, vise og skrive ut sikkerhetsdatabladet for hver(t) QIAGEN-sett og -settkomponent. Prøver FORSIKTIG: Prøver kan inneholde smittestoffer, og må håndteres deretter. Betrakt alle prøver som potensielt smittefarlige. Ingen kjent testmetode kan fullstendig garantere at prøver ikke vil overføre infeksjon. Det anbefales at prøver fra mennesker håndteres i samsvar med egnede nasjonale og lokale praksiser innen biosikkerhet. Bruk disse biosikkerhetspraksisene med materialer som inneholder eller mistenkes å inneholde smittestoffer. Disse forsiktighetsreglene inkluderer, men er ikke begrenset til, følgende: Ikke pipetter med munnen. Ikke røyk, spis eller drikk i områder der reagenser eller prøver håndteres. Bruk pudderfrie engangshansker ved håndtering av reagenser eller prøver. Vask hendene grundig når testen er fullført. Rengjør og desinfiser alt søl fra prøver med et tuberkulocidalt desinfeksjonsmiddel, for eksempel 0,5 % v/v natriumhypokloridd eller annet egnet desinfeksjonsmiddel (12, 13). Dekontaminer og kast alle prøver, reagenser og andre potensielt kontaminerte materialer i samsvar med lokale og nasjonale forskrifter. Etter denaturering og inkubering anses prøvene ikke lenger som smittefarlige (14), men laboratoriepersonell bør likevel overholde nasjonale og lokale forsiktighetsregler. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 13

14 Natriumazid Enkelte reagenser inneholder natriumazid. Natriumazid er rapportert å danne bly- eller kopperazid i laboratorienes rørsystemer. Disse azidene kan eksplodere ved støt eller slag, for eksempel fra hammer. Dannelse av bly- eller kopperazid kan forhindres ved å skylle avløpene grundig med vann etter avhending av løsninger som inneholder natriumazid. U.S. Occupational Safety and Health Administration anbefaler følgende for å fjerne kontaminasjon fra gamle avløp der man mistenker oppsamling av azider: 1. Trekk opp oppsamlet væske med en gummi- eller plastslange. 2. Fyll med 10 % v/v natriumhydroksidløsning. 3. La stå i 16 timer. 4. Skyll godt med vann. 14 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

15 Sikkerhets- og risikosetninger for komponenter Følgende risiko- og sikkerhetssetninger gjelder for komponenter i digene HPV Genotyping PS-testsettet: 5.5% NP-40 Inneholder: Ethoxylated nonylphenol. Advarsel! Forårsaker mild hudirritasjon. Skadelig, med langtidsvirkning, for liv i vann. Unngå utslipp til miljøet. Innhold/ beholder leveres til godkjent avfallsanlegg. Denaturation Reagent Inneholder: sodium hydroxide. Fare! Gir alvorlige etseskader på hud og øyne. Kan være etsende for metaller. Innhold/ beholder leveres til godkjent avfallsanlegg. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. VED HUDKONTAKT (eller håret): Tilsølte klær må fjernes straks. Skyll/dusj huden med vann. Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONSSENTER eller lege. Oppbevares innelåst. Benytt vernehansker/ verneklær/ vernebriller/ ansiktsskjerm. Detection Reagent 1 Skadelig, med langtidsvirkning, for liv i vann. Unngå utslipp til miljøet. HPV Negative Control 1 Advarsel! Forårsaker mild hudirritasjon. Ved hudirritasjon: Søk legehjelp. HPV Positive Control 1 Advarsel! Forårsaker mild hudirritasjon. Ved hudirritasjon: Søk legehjelp. HPV Positive Control 2 Advarsel! Forårsaker mild hudirritasjon. Ved hudirritasjon: Søk legehjelp. HPV Negative Control 2 Advarsel! Forårsaker mild hudirritasjon. Ved hudirritasjon: Søk legehjelp. Probe Diluent Inneholder: acetic acid; Polyacrylic acid. Fare! Gir alvorlige etseskader på hud og øyne. Innhold/ beholder leveres til godkjent avfallsanlegg. VED KONTAKT MED ØYNENE: Skyll forsiktig med vann i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser dersom dette Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 15

16 enkelt lar seg gjøre. Fortsett skyllingen. VED HUDKONTAKT (eller håret): Tilsølte klær må fjernes straks. Skyll/dusj huden med vann. Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONSSENTER eller lege. Oppbevares innelåst. Benytt vernehansker/ verneklær/ vernebriller/ ansiktsskjerm. Wash Buffer, 15x Inneholder: Sodium azide. Advarsel! Farlig ved svelging. Forårsaker mild hudirritasjon. Skadelig, med langtidsvirkning, for liv i vann. Unngå utslipp til miljøet. Innhold/ beholder leveres til godkjent avfallsanlegg. Ved hudirritasjon: Søk legehjelp. VED SVELGING: Kontakt umiddelbart et GIFTINFORMASJONSSENTER eller lege. Benytt vernehansker/ verneklær/ vernebriller/ ansiktsskjerm. Tilleggsinformasjon Sikkerhetsdatablader: Forsiktighetsregler Brukeren må alltid overholde følgende forsiktighetsregler ved utførelse av digene HPV Genotyping PS Test: Reagensene må ikke brukes etter utløpsdatoen angitt ved siden av - symbolet på yttereskens etikett eller utløpsdatoen for de klargjorte reagensene. Hvis testen utføres utenfor de angitte tids- og temperaturområdene, kan det produseres ugyldige resultater. Tester som ikke ligger innenfor de fastsatte tids- og temperaturområdene er ugyldige og må gjentas. Prosedyren for digene HPV Genotyping PS Test, analysekalibreringen, kvalitetskontrollen og tolkningen av resultater må observeres nøye for å oppnå pålitelige testresultater. Det er viktig å pipettere det nøyaktige reagensvolumet som er angitt og å blande godt etter hver reagenstilsetning. Hvis dette ikke gjøres, kan det føre til feilaktige testresultater. Man kan bekrefte at disse forholdene er oppfylt ved å kontrollere at de angitte fargeendringene oppstår. Settets komponenter er blitt testet som en enhet. Ikke veksle komponenter fra andre kilder eller fra ulike partier. 16 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

17 Nukleinsyrer er svært følsomme overfor miljømessig nedbrytning av nuklease. Nukleaser finnes på menneskehuden og på overflater eller materialer som håndteres av mennesker. Rengjør og dekk til arbeidsoverflater med et engangsbenkdekselog bruk pudderfrie engangshansker ved utførelse av alle testtrinn. Livmorhalsprøver kan inneholde blod eller andre biologiske materialer som kan maskere fargeendringene i prøvene. Prøver med mørk farge vil ikke nødvendigvis vise den angitte fargeendringen. I disse tilfellene vil manglende evne til å utvise fargeendring ikke påvirke testresultatene. Bekreft riktig blanding ved å observere fargeendringen i kontrollene. Sørg for å forhindre kontaminasjon av capture-mikroplaten og DR2 med eksogen alkalisk fosfatase mens testen pågår. Substanser som kan inneholde alkalisk fosfatase inkluderer DR1, bakterier, spytt, hår og oljer fra huden. Tildekking av capture-mikroplaten etter vasketrinnet og under DR2- inkubasjon er spesielt viktig, siden eksogen alkalisk fosfatase kan reagere med DR2 og produsere falskt positive resultater. Beskytt DR2 mot langvarig eksponering for direkte lys. Bruk DR2 rett etter alikvotering, og unngå direkte sollys. Prim den repeterende positive fortrengningspipetten før reagenslevering, og se etter store luftbobler med jevne mellomrom. Store mengder store luftbobler i pipettespissen kan forårsake unøyaktig levering og kan unngås ved å fylle pipetten, dispensere all væske og fylle på nytt. Se brukerhåndboken for pipetten for spesifikk bruksanvisning. Utfør multikanals pipettering ved bruk av den omvendte pipetteringsteknikken (se Protokoll 4: Hybridpåvisning, side 35) for å dispensere DR1 og DR2 Kontroller hver pipettespiss på den multikanals pipetten for riktig montering og fylling. Påse at hver capture-mikroplatebrønn vaskes grundig (se Protokoll 5: Vasking, side 37). Utilstrekkelig vasking fører til økt bakgrunn og kan forårsake falskt positive resultater. Vaskebufferrester i capturemikroplatebrønnene kan føre til redusert signal eller dårlig reproduserbarhet. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 17

18 Oppbevaring og håndtering av reagens Komponenter i settet Når settet mottas, må det oppbevares ved 2 8 ºC. Vaskebufferen x15, denatureringsreagensen og indikatorfargestoffet kan oppbevares ved romtemperatur (15 30 ºC), ved behov. Alle reagenser leveres klare til bruk, med unntak av denatureringsreagensen (DNR), probeblandingene og vaskebufferen. Klargjorte reagenser Etter klargjøring er DNR stabil i 3 måneder 2 8 ºC. Etter klargjøring er vaskebufferen stabil i 3 måneder 2 30 ºC. Prøvetaking og -klargjøring Samle inn og transporter livmorhalsprøver for testing med digene HPV Genotyping PS Test ved bruk av en av følgende prøvetakingsenheter: digene HC2 DNA Collection Device [består av en livmorhalsbørste og et prøvetransportmedium (Sample Transport Medium STM)] En kostlignende prøvetakingsenhet eller kombinert børste- /spatelprøvetakingsenhet plassert i PreservCyt-løsning Prøver som tas med andre prøvetakingsenheter eller som transporteres i andre transportmedier, har ikke blitt validert for bruk med denne testen. Utførelsesegenskapene til denne testen ble kun etablert med de angitte prøvetakingsenhetene. Se bruksanvisningen for digene HC2 DNA Collection Device for ytterligere prosedyrer for prøvetaking og -håndtering. Livmorhalsprøver i STM Livmorhalsprøver samlet inn i STM krever ikke prøveklargjøring før testing med digene HPV Genotyping PS Test. Siden digene HPV Genotyping PS Test er en refleks for digene HC2 High-Risk HPV DNA Testen, er STM-prøvene allerede denaturerte og klare til å fortsette til 18 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

19 Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding i testen. Minst 225 µl av hver denaturerte STM-prøve må være tilgjengelig for å utføre digene HPV Genotyping PS Test. Livmorhalsprøver i PreservCyt-løsning PreservCyt-prøver krever prøveklargjøring før testing med digene HPV Genotyping PS Test Samle inn prøver på normal måte og klargjør ThinPrep objektglass med livmorhalsprøver i samsvar med instruksjonene fra produsenten. Etter prøvetaking kan PreservCyt-prøvene oppbevares i opptil tre måneder ved 2 30 ºC før prøveklargjøring for digene HPV Genotyping PS Test. PreservCytprøver kan ikke fryses. Resultatet av prøveklargjøringen ved bruk av digene HC2 Sample Conversionsettet er en denaturert prøve som er klar til å fortsette til Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding i testen. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 19

20 Prosedyre Gjør følgende før du starter La inkubatorshakeren tempereres i minst 60 minutter til 55 C ± 2 ºC fra en kald start. Hvis du ikke setter av tid til denne oppvarmingsperioden, kan det føre til unøyaktige testresultater. Påse at vannbadet er ved 65 ºC og at vannivået er tilstrekkelig til å senke hele væskevolumet ned i glassene. Skriv ut et nytt Skjema for registrering av testdata og skriv ned følgende informasjon (se Vedlegg B: Skjema for registrering av testdata, side 69): Teststed Testdato Bruker-ID Omgivelsestemperatur digene HPV Genotyping PS Test, settets partinummer Kontrollene og prøvene kjøres i en konfigurasjon med 8 mikroplatebrønnkolonner. Fyll ut Skjema for registrering av testdata ved å skrive ned ID-kodene for alle påkrevde kontroller og prøver i mikroplatebrønnplasseringene. For hver test må kontrollene testes i følgende posisjoner på mikroplaten (se figur 1 nedenfo): Negativ kontroll 1 (NC1)-replikater i mikroplatebrønn A1, B1 og C1 Positiv kontroll 1 (PC1)-replikater i mikroplatebrønn D1, E1 og F1 Negativ kontroll 2 (NC2) med probeblanding 16 i mikroplatebrønn G1 NC2 med probeblanding 18 i mikroplatebrønn H1 NC2 med probeblanding 45 i mikroplatebrønn A2 Positiv kontroll 2 (PC2) med probeblanding 16 i mikroplatebrønn B2 20 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

21 PC2 med probeblanding 18 i mikroplatebrønn C2 PC2 med probeblanding 45 i mikroplatebrønn D2 Prøve Figur 1. Posisjon til kontroller og prøver på mikroplaten. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 21

22 Klargjøring av reagenser Viktige punker før du starter Kargjør PreservCyt-prøver før romtemperering av eventuelle prøver og reagenser som allerede er denaturert. Fjern alle prøver og alle påkrevde reagenser fra oppbevaring før testen startes. La dem nå ºC i minutter. Kast alle klargjorte reagenser (med mindre annet er angitt) og reagensalikvoter på slutten av testen. Bruk Tabell 1 nedenfor for å bestemme påkrevd volum for hver reagens basert på antallet tester. Tabell 1. Påkrevde volum av klargjorte og bruksklare reagenser Antall HPV 16- HPV 18- HPV 45- tester/ probe- probe- probe- remser* blanding blanding blanding Vaskebuffer DR1 DR2 4/5 0,77 ml 0,56 ml 0,56 ml >1 liter 2,55 ml 2,55 ml 8/5 0,91 ml 0,70 ml 0,70 ml >1 liter 3,45 ml 3,45 ml 12/8 1,05 ml 0,84 ml 0,84 ml >1 liter 4,35 ml 4,35 ml 16/8 1,19 ml 0,98 ml 0,98 ml >1 liter 5,25 ml 5,25 ml 20/11 1,33 ml 1,12 ml 1,12 ml >1 liter 6,15 ml 6,15 ml 24/11 1,47 ml 1,26 ml 1,26 ml >1 liter 7,05 ml 7,05 ml 28/12 1,61 ml 1,40 ml 1,40 ml >1 liter 7,95 ml 7,95 ml * Antallet tester/remser er basert på testing av én prøve for HPV-type 16, 18 og 45, og inkluderer reagensmengden som kreves for kontrollene. Capture-mikroplate Capture-mikroplaten inneholder 12 åttebrønnsremser med capture-brønner i en plateramme. Alle capture-mikroplatebrønner som ikke brukes under testen må 22 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

23 fjernes fra platerammen, settes tilbake i folieemballasjen og oppbevares for å brukes til ytterligere testing. 1. Bruk en markør og merk capture-mikroplaten med en egnet identifikator. 2. Bestem antallet påkrevde capture-mikroplatebrønner basert på det ufylte skjemaet for registrering av testdata. 3. Plasser capture-mikroplaten opp ned på en ren KimTowels-serviett eller tilsvarende lofritt papirhåndkle. 4. Med en finger med hanske eller viskelæret på en blyant, skyv capturemikroplatebrønnremsene som ikke vil bli brukt fra platerammen. 5. Sett de uttatte capture-mikroplatebrønnremsene tilbake i folieemballasjen, lukk og sett til oppbevaring. Merk: Capture-mikroplaten oppbevares ved 2 8 ºC. Denatureringsreagens Vær forsiktig ved håndtering av denatureringsreagensen. Se side 13 for advarsler og forsiktighetsregler. 1. Tilsett to dråper indikatorfargestoff i flasken med denatureringsreagens. 2. Bland DNR godt. DNR skal ha en enhetlig, mørkelilla farge. 3. Merk DNR med den nye utløpsdatoen. Merknader: Etter klargjøring er DNR stabil i tre måneder 2 8 ºC. Hvis fargen blekner, tilsett en ekstra dråpe indikatorfargemiddel og bland godt før bruk. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 23

24 Probeblandinger Testing av hver prøve for HPV-type 16, 18 og 45 krever en spesifikk probeblanding for hver type i totalt tre probeblandinger pr. prøve. En ytterligere mengde HPV 16-probeblandingen er påkrevd siden den brukes for åtte kontrollmikroplatebrønner. En ytterligere mengde er påkrevd av HPV 18- og HPV 45-probeblandingene, siden hver brukes for to kontrollmikroplatebrønner. Klargjør hver probeblanding hver for seg, som beskrevet under. Viktige punker før du starter Klargjør probeblandingene under Protokoll 1: Denaturering, (se side 28). Vær ekstremt forsiktig for å forhindre RNase-kontaminasjon. Bruk pipettespisser med aerosolbarriere ved pipettering av proben. Probefortynningsmidlet er viskøst. Sørg for at en synlig vorteks oppnås ved klargjøring av probeblandingene. Ufullstendig blanding kan føre til redusert signal. 1. For å unngå at proben settes fast i hetteglasslokket må hvert hetteglass med proben sentrifugeres raskt for å bringe væsken til bunnen av hetteglasset. 2. Bank forsiktig på hetteglasset for å blande. 3. Bestem volumene som kreves for en 1:24:10 fortynning av proben: Probefortynningsmiddel: 5,5 % NP-40 for å klargjøre probeblandingen. Merk: 35 µl probeblanding er påkrevd pr. mikroplatebrønn. Anbefaling: Lag ekstra probeblanding for å ta høyde for volumet som kan gå tapt i pipettespissene eller på siden av hetteglasset. Bruk de anbefalte volumene (se Tabell 1, side 22) som inkluderer det anbefalte ekstra volumet. 4. Merk en ny engangsbeholder med relevant informasjon. Avhengig av antallet tester, anbefales enten et 1,5 ml eller 5 ml polypropylenglass med rund bunn. 5. Pipetter påkrevd mengde probefortynningsmiddel (se Tabell 2 nedenfor) inn i det merkede hetteglass. 24 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

25 6. Pipetter påkrevd mengde av proben inn i probefortynningsmidlet (se Tabell 2 nedenfor) ved å plassere pipettespissen mot den innvendige prøveglassveggen, rett over menisken, og skill ut innholdet. Viktig: Ikke senk pipettespissen ned i probefortynningsmidlet. 7. Pipetter påkrevd mengde 5,5 % NP-40 (se Tabell 2 nedenfor) inn i det merkede hetteglass. Tabell 2. Klargjøring av probeblanding Volum av Påkrevd volum av probefortynnings- Volum av 5,5 probeblanding middel Volum av probe % NP-40 0,56 ml 384 µl 16 µl 160 µl 0,70 ml 480 µl 20 µl 200 µl 0,77 ml 528 µl 22 µl 220 µl 0,84 ml 576 µl 24 µl 240 µl 0,91 ml 624 µl 26 µl 260 µl 0,98 ml 672 µl 28 µl 280 µl 1,05 ml 720 µl 30 µl 300 µl 1,12 ml 768 µl 32 µl 320 µl 1,19 ml 816 µl 34 µl 340 µl 1,26 ml 864 µl 36 µl 360 µl 1,33 ml 912 µl 38 µl 380 µl 1,40 ml 960 µl 40 µl 400 µl 1,47 ml 1008 µl 42 µl 420 µl 1,61 ml 1056 µl 44 µl 440 µl 8. Roter i minst 5 sekunder ved maksimal hastighet for å blande grundig. En synlig vorteks må produseres. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 25

26 Vaskebuffer Viktige punker før du starter Klargjør vaskebufferen under Protokoll 3: Hybridisering og hybridcapture, (se side 33). For den manuelle mikroplatevaskemetoden, klargjør 3 liter vaskebuffer i vaskeapparatet. Anbefaling: Hver 3. måned, rengjør vaskeapparatet og slangene med 0,5 % natriumhypoklorittløsning og skyll grundig med destillert eller deionisert vann for å forhindre mulig kontaminasjon fra alkalisk fosfatase som finnes i bakterier og muggsopper. For Automated Plate Washer, klargjør vaskebufferen og oppbevar i en tildekt beholder, eller klargjør 1 liter og plasser i vaskebeholderen til Automated Plate Washer. 1. Bland vaskebufferens x15 brønn og tilsett påkrevd volum vaskebuffer x15 (se tabell 3 nedenfor) i den angitte beholderen. 2. Tilsett påkrevd volum av destillert eller deionisert vann (se tabell 3 nedenfor) i den angitte beholderen. Tabell 3. Klargjøring av vaskebuffer Påkrevd volum av vaskebuffer Volum av vaskebuffer x15 Volum av destillert eller deionisert vann 1 liter 67 ml 933 ml 1,5 liter 100 ml 1400 ml 2 liter 133 ml 1867 ml 3 liter 200 ml 2800 ml 3. Plasser et rent, lofritt papirhåndkle over eventuelle åpninger i beholderen, og bland godt. 26 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

27 4. Forsegle beholderen eller plasser på det relevante instrumentet, hvis relevant. 5. Merk vaskebufferen med den nye utløpsdatoen. Merk: Etter klargjøring er vaskebufferen stabil i 3 måneder 2 30 ºC. Klargjøring av prøver PreservCyt-prøver krever prøveklargjøring før testing med digene HPV Genotyping PS Test digene HPV Genotyping PS Test krever 225 µl klargjort prøve for å teste for HPV-typene 16, 18 og 45. Riktig oppbevarte og tidligere klargjorte PreservCyt-prøver kan brukes for å utføre denne testen. Hvis det ikke gjenstår en tilstrekkelig mengde av klargjort PreservCyt-prøve, må minst 6 ml PreservCyt-prøve klargjøres for å utføre testen. Se bruksanvisningen for digene HC2 Sample Conversion-settet for manuell klargjøring av PreservCyt-prøver. Resultatet av prøveklargjøringen ved bruk av digene HC2 Sample Conversionsettet er en denaturert prøve som er klar til å fortsette til Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding i testen (se side 30). Klargjør kontrollene hver for seg i samsvar med Protokoll 1: Denaturering, (se side 28). Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 27

28 Protokoll 1: Denaturering Kontrollene som kreves med digene HPV Genotyping PS Test denatureres i samsvar med instruksjonene nedenfor. Viktige punker før du starter Ikke denaturer STM-prøver i samsvar med Protokoll 1: Denaturering. STMprøver ble tidligere denaturert som en følge av testing med digene HC2 High-Risk HPV DNA Testen og er klare til å fortsette til Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding i testen. Ikke denaturer PreservCyt-prøver i samsvar med Protokoll 1: Denaturering. Denaturering av PreservCyt-prøver utføres som en del av prøveklargjøringen. De klargjorte PreservCyt-prøvene er klare til å fortsette til Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding i testen. Pass på at du ikke søler kontrollene eller spruter DNR når du utfører denne protokollen. Tilsetningen av DNR i kontrollglasset fyller glasset slik at væsken er nær toppen. Se side 13 for advarsler og forsiktighetsregler. Gjør følgende før du starter Sørg for at det er nok vann i vannbadet til å senke ned hele volumet ned i prøveglassene. For å unngå falskt positive resultater, er det sentralt at alt kontrollmateriale kommer i konatkt med DNR. 1. Merk hettene til NC1, PC1, NC2 og PC2. Hettene vil brukes på nytt for å lukke kontrollglassene. 2. Fjern hettene fra NC1, PC1, NC2 og PC2 og plasser hettene på avstand fra mulig kontaminasjon. 3. Ved bruk av en enkeltkanals pipette med en ny pipettespiss for hver tilsetning, pipetter 500 µl DNR inn i hvert kontrollglass ved å plassere pipettespissen under væskeoverflaten og dispensere. 4. Sett hetten tilbake på hver respektive kontroll og lukk prøveglasset. Sørg for at hettene er skrudd godt på for å unngå kontaminasjon eller søl. 28 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

29 5. Bland hvert glass grundig ved bruk av pulsvorteksblanding hver for seg, ved høy hastighet, i minst 30 sekunder. Viktig: Blanding etter tilsetning av DNR er et sentralt trinn. 6. Inkuber prøveglassene i et flytende mikrosentrifugeglasstativ i et 65 ± 2 ºC vannbad i 45 ± 5 minutter. Klargjør de påkrevde probeblandingene under (se Klargjøring av reagenser side 22). 7. Fjern glassene fra vannbadet etter inkuberingen. De denaturerte kontrollene kan: Testes omgående (fortsett til Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding side 30) Oppbevares (se Alternativt stoppunkt side 29) Alternativt stoppunkt Viktig: Ikke oppbevar eller send denaturerte prøver eller kontroller på tørris. Denaturerte kontroller kan oppbevares ved 2 8 ºC over natten eller ved 20 ºC i samsvar med følgende: Maksimalt én fryse-/tinesyklus kan utføres for oppbevaring på opptil 4 uker. Maksimalt tre fryse-/tinesykluser kan utføres for oppbevaring på opptil 9 uker. For hver fryse-/tinesyklus er maksimalt 2 timer ved romtemperatur tillatt under tinesyklusen. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 29

30 Protokoll 2: Tilsetning av probeblanding Viktige punker før du starter Probeblandingen er viskøs. Sørg for at probeblandingen blandes grundig og at den påkrevde mengden dispenseres fullstendig inn i hver hybridiseringsmikroplatebrønn. Når kontrollene og prøvene overføres til hybridiseringsmikroplaten, må du passe på følgende: Unngå å berøre sidene av hybridiseringsmikroplatebrønnene, siden det kan oppstå falskt positive resultater hvis prøvene ikke overføres forsiktig. Begrens dannelsen av luftbobler. Bruk en ren, ekstra lang pipettespiss for hver overføring for å unngå krysskontaminasjon. Gjør følgende før du starter Hvis de denaturerte kontrollene eller prøvene har vært oppbevart, må de romtempereres til ºC. Hvis STM- eller PreservCyt-prøvene har vært oppbevart i et prøvestativ og MST Vortexer 2 skal brukes til vorteksering, må hettene på prøveglassene fjernes og kastes. 1. Få tak i og merk en hybridiseringsmikroplate. 2. Vortekser kontrollen og prøveglassene ved bruk av en av følgende metoder: Alle prøvetyper med vorteksblander Vortekser hvert prøveglass hver for seg i minst 5 sekunder ved maksimal hastighetsinnstilling. STM-prøver med MST Vortexer 2 a. Ved behov, dekk til prøveglassene med DuraSealprøveglassforseglerfilm og fest stativlokket på prøvestativet. b. Vortekser prøvestativet i minst 5 sekunder ved maksimal hastighetsinnstilling. 30 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

31 c. Plasser umiddelbart prøvestativet på benken og frigi låsene. Løft stativlokket ca. 1 cm og flytt det forsiktig til venstre og høyre for å frigi alle prøveglass som kan ha klebet seg til DuraSealprøveglassforseglerfilmen. Fjern stativlokket ved å løfte det rett opp inntil det er borte fra prøvestativet. d. Trekk DuraSeal-prøveglassforseglerfilmen forsiktig av lokket og kast den. PreservCyt-prøver med MST Vortexer 2 a. Ved behov, dekk til prøveglassene med DuraSealprøveglassforseglerfilm og fest stativlokket på prøvestativet. b. Vortekser prøvestativet i minst 10 sekunder ved maksimal hastighetsinnstilling. c. Plasser umiddelbart prøvestativet på benken og frigi låsene. Løft stativlokket ca. 1 cm og flytt det forsiktig til venstre og høyre for å frigi alle prøveglass som kan ha klebet seg til DuraSealprøveglassforseglerfilmen. Fjern stativlokket ved å løfte det rett opp inntil det er borte fra prøvestativet. d. Trekk DuraSeal-prøveglassforseglerfilmen forsiktig av lokket og kast den. 3. Ved bruk av en enkeltkanals pipette med ekstra lange pipettespisser, overfør 75 µl av hver kontroll eller prøve til bunnen av den tomme hybridiseringsmikroplatebrønnen i samsvar med skjemaet for registrering av testdata. Ved behov, oppbevar det gjenværende volumet i samsavar med følgende instruksjoner: Sett originalhettene tilbake på de denaturerte kontrollene og oppbevar i samsvar med grensene angitt i Alternativt stoppunkt side 29. Sett nye prøveglasskruhetter på STM-prøvene og oppbevar i samsvar med instruksjonene i bruksanvisningen for digene HC2 High-Risk HPV DNA Testen. Sett en ny hette på PreservCyt-prøvene og oppbevar i samsvar med instruksjonene i bruksanvisningen for digene HC2 Sample Conversionsettet. 4. Når den siste prøven er overført, må du dekke til hybridiseringsmikroplaten med et mikroplatelokk og inkubere i 10 minutter ved ºC. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 31

32 5. Vortekser probeblandingene godt. 6. Pipetter forsiktig 35 µl av den relevante probeblandingen i hver hybridiseringsmikroplatebrønn ved bruk av en enkeltkanals eller repeterende positiv fortrengningspipette og en ny spiss for hver probeblandingtilsetning. Unngå oppsprut og berøring av sidene i hybridiseringsmikrobrønnplatene. 7. Dekk til hybridiseringsmikroplaten med et mikroplatelokk eller plateforsegler og ryst i 3 ± 2 minutter på Rotary Shaker I stilt ved 800 ± 100 rpm. 8. Fjern hybridiseringsmikroplaten fra Rotary Shaker I. Fjern mikroplatelokket og plasser det på en ren overflate. Etter rysting skal kontrollene og STM-prøvene bli gule og PreservCyt-prøvene skal bli rosa. Prøver som forblir lilla har kanskje ikke fått riktig mengde probeblanding. Tilsett ytterligere 35 µl av den relevante probeblandingen i prøvene som forblir lilla, og ryst på nytt i 3 ± 2 minutter på Rotary Shaker I stilt ved 800 ± 100 rpm. Hvis en prøve forblir lilla etter å ha fulgt denne prosedyren, må prøven testes på nytt. 9. Fortsett til Protokoll 3: Hybridisering og hybrid-capture, side Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

33 Protokoll 3: Hybridisering og hybrid-capture 1. Plasser hybridiseringsmikroplaten ved siden av capture-mikroplaten. 2. Ved bruk av en 8-kanals pipette, overfør hele innholdet (ca. 110 µl) av hybridiseringsmikroplatebrønnene til bunnen av de tilsvarende capturemikroplatebrønnene. Bruk nye pipettespisser for hver overføring, og la hver pipettespiss renne av for å sikre at hele prøven er overført. Ved behov kan du stabilisere pipetten ved å støtte midten av pipettespissene på den øvre kanten av capturemikroplatebrønnene (se Figur 2 nedenfor). Merk: For et lite antall prøver kan en enkeltkanals pipette med µl pipettespisser brukes i stedet for en 8-kanals pipette. Bruk nye pipettespisser for hver overføring. Riktig Ikke pipetter vertikalt for å unngå oppsprut. Ikke la pipettespissen berøre siden av mikroplatebrønnen. Figur 2. Riktig pipetteringsteknikk. 3. Dekk til capture-mikroplaten med en ny plateforsegler og inkuber capturemikroplaten i 120 ± 5 minutter ved 1100 ± 100 rpm i inkubatorshakeren temperert til 55 ± 2 ºC. 4. Når inkuberingen er fullført, må du fjerne capture-mikroplaten fra inkubatorshakeren og fjerne plateforsegleren forsiktig. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 33

34 5. Fjern væsken fra capture-mikroplatebrønnene ved å helle den i en vask; vend capture-mikroplaten opp ned over vasken og ryst hardt ned en nedadvendt bevegelse. Viktig: Ikke vend platen opp igjen. Pass på å ikke helle væsken for nært bunnen av vasken, da dette kan føre til oppsprut. 6. Absorber ved å banke bestemt 2 3 ganger på rene KimTowels-servietter eller tilsvarende lofrie papirhåndklær. Sørg for at væsken fjernes fra capture-mikroplatebrønnene og at toppen av capture-mikroplaten er tørr. 7. Fortsett til Protokoll 4: Hybridpåvisning, side Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

35 Protokoll 4: Hybridpåvisning Viktige punker før du starter Tilsett reagenser på tvers av capture-mikroplaten fra venstre til høyre ved bruk av en 8-kanals pipette. Tørk pipettespissene på reagensbeholderen til engangsbruk for å fjerne overflødig reagens før levering til capturemikroplaten. Hvis det ikke brukes en 8-kanals pipette, kan en egnet repeterende positiv fortrengningspipette brukes i stedet. Alikvoter DR1 inn i et polypropylenprøveglass som er stort nok til å romme det påkrevde volumet. Det anbefales at den omvendte pipetteringsteknikken benyttes for å forbedre konsekvensen av reagensleveringen. Prosedyren er beskrevet nedenfor. Ved behov kan pipetten stabiliseres ved å støtte midten av pipettespissen på den øvre kanten av capture-mikroplatebrønnene. Sørg for å ikke berøre sidene av capture-mikroplatebrønnene, siden det kan oppstå krysskontaminasjon av prøver (se Figur 2, side 33). 1. Bland DR1 grundig, og mål opp det riktige volumet nøye (se Tabell 1, side 22) inn i en ren reagensbeholder til engangsbruk. 2. Pipetter forsiktig 75 µl av DR1 inn i hver capture-mikroplatebrønn ved bruk av den omvendte pipetteringsteknikken, som følger: a. Fest spissene på en 8-kanals pipette og påse at alle spissene sitter godt fast. b. Skyv stempelet på pipetten forbi det første stoppet til det andre stoppet. c. Senk spissene ned i reagensen. d. Slipp opp stempelet langsomt og la reagensen fylle spissene. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 35

36 e. Dispenser reagensen inn i mikroplatebrønnene ved å trykke stempelet til det første stoppet. Slipp ikke opp stempelet før pipettespissene er senket ned i reagensen igjen. f. Fyll spissene på nytt og gjenta til alle mikroplatebrønner er fylt. Bekreft at alle capture-mikrobrønner er fylt ved å observere intensiteten til rosafargen. Alle capture-mikroplatebrønnene skal ha lik intensitet på rosafargen. 3. Dekk til capture-mikroplaten med et mikroplatelokk, ren Parafilm eller tilsvarende og inkuber i minutter ved ºC. 4. Fortsett til Protokoll 5: Vasking, side Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

37 Protokoll 5: Vasking Vask capture-mikroplaten ved bruk av en av metodene nedenfor. Automated Plate Washer-metode Automated Plate Washer må alltid være slått PÅ. Automated Plate Washer vil skylle systemet for rengjøring. Se håndboken for Automated Plate Washer (Automated Plate Washer User Manual) for ytterligere instruksjoner. Gjør følgende før du starter Bekreft at vaskebeholderen er fylt med minst 1 liter vaskebuffer. Hvis ikke må du klargjøre vaskebufferen (se Klargjøring av reagenser, side 22). Bekreft at skyllebeholderen er fylt med deionisert eller destillert vann. Bekreft at avfallsbeholderen er tom og at hetten sitter godt fast. Automated Plate Washer vil prime automatisk før hver vask og skylle etter hver vask. Automated Plate Washer vasker kun fullstendige remser og kan ikke hoppe over brønner eller remser. Hvis det kun brukes en delvis remse med capturemikroplatebrønner, må tomme mikroplatebrønner plasseres i platerammen for å fullføre remsen før vasking. Alle vaskede remser må ha mikroplatebrønner. 1. Fjern capture-mikroplatelokket, ren Parafilm eller tilsvarende, og plasser capture-mikroplaten på plattformen til Automated Plate Washer. 2. Bekreft at Automated Plate Washer er slått PÅ, og at displayet viser Digene Wash Ready (Digene-vask klar) eller P1. 3. Velg antall remser som skal vaskes ved å trykke på tasten Rows (Rader) og deretter + eller for å justere. 4. Trykk på tasten Rows for å returnere til Digene Wash Ready eller P1. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 37

38 5. Trykk på Start/Stop (Start/stopp) for å starte. Det automatiske platevaskeapparatet vil utføre 6 fyll-og-aspirer-sykluser som tar ca. 10 minutter for hver syklus. Det vil oppstå en kort pause i løpet av programmet. Ikke fjern capture-mikroplaten for tidlig. Når Automated Plate Washer er ferdig med vaskingen, viser det Digene Wash Ready eller P1. 6. Fjern capture-mikroplaten fra plattformen til Automated Plate Washer når programmet er ferdig. capture-mikroplatebrønnene skal være hvite, og ingen rester av rosa væske skal være igjen i capture-mikroplatebrønnene. 7. Fortsett til Protokoll 6: Signalforsterkning, side 40. Manuell platevasking Ting du skal gjøre før du starter: Bekreft at vaskeapparatet er fylt med minst 1 liter vaskebuffer. 1. Fjern capture-mikroplatelokket, ren Parafilm eller tilsvarende. 2. Plasser rene KimTowels-servietter eller tilsvarende lofrie papirhåndklær oppå capture-mikroplaten. 3. Sørg for at papirhåndklærne er i kontakt med hele overflateområdet av capture-mikroplaten, og vend capture-mikroplaten forsiktig opp ned. 4. La capture-mikroplaten renne av i 1 2 minutter. 5. Absorber væske fra capture-mikroplaten på rene KimTowels-servietter eller tilsvarende lofrie papirhåndklær. Kast de brukte papirserviettene forsiktig for å unngå kontaminasjon med alkalisk fosfatase. 6. Vask capture-mikroplatene manuelt seks ganger med vaskeapparatet. For å vaske skikkelig må hver capture-mikroplatebrønn oversvømmes godt med vaskebuffer. Dette vil fjerne DR1 fra toppen av capturemikroplatebrønnene. Vasking starter med capture-mikroplatebrønn A1 og fortsetter i en slangeaktig bevegelse til høyre og nedover. Når alle capturemikroplatebrønnene er fylt, må væsken helles i vasken med en kraftig 38 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

39 nedadvendt bevegelse. Den andre vasken starter med capturemikroplatebrønn H12 og snor seg til venstre og oppover. Denne sekvensen på to vasker gjentas to eller flere ganger i totalt seks vasker av capture-mikroplaten. 7. Etter vaskingen må væske på capture-mikroplaten absorberes ved å vende opp ned på rene KimTowels-servietter eller tilsvarende lofrie papirhåndklær og banke bestemt 3 4 ganger. Skift ut papirhåndklærne og absorber på nytt. 8. La capture-mikroplaten stå opp ned og renne av fem minutter. Skift ut papirhåndklærne og absorber på nytt. capture-mikroplaten skal være hvit, og ingen rester av rosa væske skal være igjen i capture-mikroplatebrønnene. 9. Fortsett til Protokoll 6: Signalforsterkning, side 40. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 39

40 Protokoll 6: Signalforsterkning Viktige punker før du starter Bruk et nytt par pudderfrie engangshansker til håndtering av DR2. Tilsett reagenser på tvers av capture-mikroplaten fra venstre til høyre ved bruk av en 8-kanals pipette. Hvis det ikke brukes en 8-kanals pipette, kan en egnet repeterende positiv fortrengningspipette brukes i stedet. Alikvoter DR2 inn i et polypropylenprøveglass som er stort nok til å romme det påkrevde volumet. Tilsett DR2 uten avbrytelser. Inkuberingstiden for alle capturemikroplatebrønnene må være så nær som mulig. Sørg for å ikke berøre sidene av capture-mikroplatebrønnene eller sprute reagens på pipettespissene, siden det kan oppstå krysskontaminasjon av prøver (se Figur 2, side 33). 1. Bland DR2 grundig, og mål opp det riktige volumet (se Tabell 1, side 22) inn i en ren reagensbeholder til engangsbruk. 2. Pipetter 75 µl DR2 inn i hver capture-mikroplatebrønn ved bruk av den omvendte pipetteringsteknikken, som beskrevet tidligere (se Protokoll 4: Hybridpåvisning, side 35). Bekreft at alle capture-mikrobrønner er fylt nøyaktig ved å observere intensiteten på gulfargen. Alle capture-mikrobrønner skal ha lignende intensitet på gulfargen. 3. Dekk til capture-mikroplaten med et mikroplatelokk og inkuber ved ºC i 15 minutter (maksimalt 30 minutter). Unngå direkte sollys. 4. Fortsett til Protokoll 7: Måle capture-mikroplaten og generere resultater, side Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

41 Protokoll 7: Måle capture-mikroplaten og generere resultater 1. Når inkuberingen er fullført, må du måle capture-mikroplaten ved bruk av DML-instrumentets funksjon for rådatamåling. Se den relevante programvarebrukerhåndboken for informasjon om måling av en capture-mikroplate. 2. Skriv ut rådatarapporten. Viktig: Rådatarapporten må skrives ut etter målingen. Rådatarapporten kan ikke lagres ved bruk av digene-analyseringsprogramvaren. 3. Merk rådatarapporten med den relevante informasjonen angitt på skjemaet for registrering av testdata. 4. Hvis det ikke ble brukt en full capture-mikroplate, må du fjerne de brukte capture-mikroplatebrønnene fra plateframmen, skylle platerammen grundig med destillert eller deionisert vann, tørke og spare til neste test. 5. Med mindre annet er angitt, må alle reagensalikvoter og klargjorte reagenser kastes. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 41

42 Tolking av resultater Cut-off (CO) for digene HPV Genotyping PS Test tilsvarer 5000 eksemplarer av HPV 16, 18, 45 plasmider. Viktig: Før testresultatene tolkes, må allle krav til kvalitetskontroll og analysekalibreringsverifisering oppfylles (se Kvalitetskontroll, side 52). Resultater fra testingen CO for bestemmelse av positive prøver er PC1-gjennomsnittet. Ved bruk av det beregnede PC1-gjennomsnittet under analysekalibreringsverifisering, bestemmes RLU/CO for hver prøve. Testresultatene bestemmes som følger: Prøver med en RLU/CO-verdi på 2,0 anses som positive for den HPVtypen. Prøver med en RLU/CO-verdi på <2,0 anses som negative eller ingen HPV-DNA påvist for den HPV-typen. HPV-DNA-sekvensene er enten fraværende eller HPV-DNA-nivåene er under påvisningsgrensen for testen. Feilsøkingsveiledning Kommentarer og forslag Feil eller manglende fargeendring observert under denaturering av kontrollene a) Feil klargjøring av DNR Bekreft at DNR inneholder indikatorfargestoffet og har mørkelilla farge. b) DNR var ikke tilsatt i kontrollene Bekreft at DNR var tilsatt i kontrollene ved å måle volumet i mikroplaten. Volumet skal være 75 µl. Hvis volumet indikerer at DNR ikke er tilsatt, må du tilsette riktig mengde av DNR, blande og fortsette med testen hvis riktig fargeendring observeres. 42 Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test

43 Kvalitetskontroller gir feilaktige resultater Kommentarer og forslag Feil plassering av kontroller på mikroplaten Juster prosedyren for analysekalibreringsverifisering slik at den stemmer overens med Skjema for registrering av testdata. Sørg for at resultatene stemmer overens med de relevante kriteriene for analysekalibreringsverifisering. Feil fargeendring observert under tilsetting av probeblanding a) Feil blanding av probeblandingen med kontrollene og/eller prøvene eller feil volum av probeblandingen ble tilsatt Ryst hybridiseringsmikroplaten i to minutter til. Hvis noen av prøvene fremdeles er lilla, må du tilsette ytterligere 35 µl av den relevante probeblandingen og bland godt ved å ryste i tre minutter ved 800 ± 100 rpm. Hvis du tilsetter probeblanding og blander på nytt, men riktig fargeendring ikke inntreffer og prøven ikke inneholder blod eller andre materialer, må prøven testes på nytt. b) Prøven inneholder blod eller andre materialer som maskerer fargeendringen. Den beskrevne fargeendringen forventes ikke med disse prøvene, og testresultater skal ikke være negativt påvirket. Testens analysekalibreringsverifisering mislykkes; ingen signaler i kontrollene eller prøvene a) Probeblandingen ble klargjort uten proben Se Klargjøring av reagenser, side 22, for instruksjoner om klargjøring av probeblandingen. Bruksanvisning for digene HPV Genotyping PS Test 43