QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet

Transkript

1 QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA er en enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) for semikvantitativ påvisning av Intrinsic Factor-antistoffer i humant serum. Forekomsten av Intrinsic Factorantistoffer kan brukes sammen med kliniske resultater og andre laboratorietester som støtte i diagnosen av Pernisiøs anemi. Sammendrag og forklaring av testen Pernisiøs anemi (Biermers anemi) er en kronisk sykdom og sluttfasen til type A (autoimmun) kronisk atrofisk gastritt. Type A er autoimmun fra naturens side og assosiert med pernisiøs anemi. Type B (ikkeautoimmun) er assosiert med H. pylori-infeksjon. 1,2,3 Under progresjonen til type A kronisk atrofisk gastritt blir gastriske parietalceller som produserer intrinsisk faktor og HCI og zymogenceller som produserer pepsinogen ødelagt og produksjonen av intrinsic faktor (IF) og HCI elimineres. Intrinsic faktor er essensiell for absorpsjonen av vitamin B 12 fra tarmene og dens fravær fører til vitamin B 12 -mangel og megaloblastisk anemi. Diagnose av pernisiøs anemi er viktig for behandling av selve anemien og forebygging av irreversibel neurologisk skade. 1,4 Pasienter med pernisiøs anemi har blitt rapportert å ha tre ganger økt risiko for gastrisk karsinom, 13 ganger økt risiko for gastrisk karsinoid og økt risiko for spiserørscellekreft. 5-7 Antistoffer i omløp mot intrinsisk faktor er meget spesifikke og kan påvises hos >50% av pasientene med pernisiøs anemi. 1,3 Disse antistoffene er av to typer: Type 1, blokkerende antistoffer som forhindrer bindingen av vitamin B 12 med IF-molekylet og type 2 antistoffer som kan forstyrre bindingen av IF-vitamin B 12 -komplekset med ileal reseptor. 1,8 I motsetning til radioimmunanalysebaserte metoder, påviser QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA både type 1 og type 2 antistoffer. Sammen med andre kliniske og laboratoriedata kan et positivt intrinsicfatorantistoffresultat hjelpe å skille autoimmun pernisiøs anemi fra andre megaloblastiske anemier og skille type A atrofisk gastritt fra andre former for ikke-spesifikk histologisk gastritt. 1,3,9 Prosedyreprinsipper Renset fullengde rekombinant humant intrinsicfaktorantigen bindes til brønnene på en mikrobrønnplate av polystyren under forhold som vil konservere antigenet i naturlig tilstand. Forhåndsfortynnede kontroller og fortynnet pasientserum blandes i separate brønner slik at tilstedeværende Intrinsic Factor-antistoff bindes til det immobiliserte antigenet. Ubundet prøve vaskes vekk og et enzym-merket anti-human IgGkonjugat tilsettes hver brønn. En andre inkubasjon gjør det mulig for det enzym-merkede anti-humane IgG-antistoffet å binde seg til pasientens antistoff som har festet seg på mikrobrønnene. Etter å ha vasket bort enzym-merket anti-humant IgG-antistoff som ikke har festet seg, måles gjenværende enzymaktivtet ved å tilsette et substrat og fargeutviklingen måles. Analysen kan avleses spektrofotometrisk ved å måle og sammenlikne fargeintensiteten som utvikles i pasientbrønnene med fargen i kontrollbrønnene. Reagenser 1. Mikrotiter ELISA-plate av polystyren dekket med renset Intrinsic Factor-antigen (12-1 x 8 brønner), med holder i foliepakning inneholdende tørkemidler 2. ELISA negativ kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum uten humane antistoffer mot Intrinsic Factor antigen, forhåndsfortynnet, klar til-bruk, 1,2mL 3. Intrinsic Factor ELISA lav positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med ikke-humane antistoffer mot Intrinsic Factor antigen, forhåndsfortynnet, beredt-til-bruk, 1,2 ml 4. Intrinsic Factor ELISA høy positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum med antistoffer mot Intrinsic Factor antigen, forhåndsfortynnet, beredt-til-bruk, 1,2 ml - 1 -

2 5. HRP prøvediluent prøve, 1 ampulle rosafarget som inneholder fosfatbufret saltvann, Tween 20, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 50 ml 6. HRP vaskekonsentrat, 1 ampulle med 40x konsentrat rødfarget som inneholder fosfatbufret saltvann og Tween 20, 25 ml Se metodeavsnittet for veiledning om fortynning. 7. HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG, 1 ampulle blåfarget som inneholder buffer, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 10 ml 8. TMB-kromogen, 1 ampulle som inneholder stabilisatorer, 10 ml 9. HRP stoppløsning, 0,344M svovelsyre, 1 ampulle fargeløs, 10 ml Advarsler 1. ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie (0,02% kloramfenikol) i prøvediluenten, kontrollene og konjugat antatt som kreftfremkallende i staten California. 2. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Imidlertid kan ingen testmetode gi fullstendig sikkerhet om at HIV, HBV, HCV eller andre smittsomme agens er fraværende. Derfor skal Intrinsic Factor ELISA lav positiv, Intrinsic Factor ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll behandles på samme måte som potensielt smittefarlig materiale Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med blyeller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 4. HRP-konjugatet inneholder et fortynnet giftig/korrosivt kjemikalie som kan være giftig ved svelging av store mengder. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 5. TMB-kromogenet inneholder et kjemikalie som kan være skadelig ved inhalering, svelging eller opptak gjennom huden. Unngå inhalering, svelging eller hud- og øyenkontakt for å forhindre skader. 6. HRP-stoppløsningen inneholder en fortynnet svovelsyreoppløsning. Unngå eksponering av baser, metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer. Svovelsyre er giftig og korrosiv og kan være giftig ved svelging. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 7. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 8. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking og utilstrekkelig væskefjerning fra ELISA-brønnremsene vil forårsake dårlig presisjon og/eller høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, lufttemperaturen, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske fra brønnen til ELISA-remsen, fotometeret som er brukt til å måle resultatene og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Det anbefales at man holder seg strengt innenfor rammene til protokollen. 7. Ufullstendig forsegling av glidelåsen til posen som inneholder mikrobrønnremsene og tørkemidlene vil resultere i degradasjon av antigen og dårlig presisjon

3 8. Uakseptabelt lave sbsorbanser kan observeres etter to eller flere bruk fra én enkel flaske med HRP-konjugat over en tidsperiode. Det er viktig å følge alle anbefalte behandlingsprosedyrer for HRP-konjugatet for å forhindre at dette oppstår. 9. Kjemisk kontaminasjon av HRP-konjugatet kan forårsakes av ufullstendig rengjøring eller skylling av utstyr eller instrumenter. Avfall fra vanlige laboratoriekjemikalier slik som formalin, blekemiddel, etanol eller vaskemiddel vil forårsake degradasjon av HRP-konjugatet over tid. Skyll alt utstyret og alle instrumentene grundig etter bruk av kjemiske rengjørings-og desinfeksjonsmidler. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Ubrukte antigen-dekkede mikrobrønnremser skal forsvarlig forsegles på ny i folieposen som inneholder tørkemidlene og oppbevares ved 2-8 C. 3. Fortynnet vaskebuffer er stabil i én uke ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. 11 Prosedyre Leverte materialer 1 Intrinsic Factor ELISA-mikrotiterplate (12-1 x 8 brønner), med holder 1 1,2mL forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet Intrinsic Factor ELISA lav positiv 1 1,2mL forhåndsfortynnet Intrinsic Factor ELISA høy positiv 1 50mL HRP-prøvediluent 1 25mL HRP-vaskekonsentrat, 40x konsentrat 1 10mL HRP IgG-konjugat, (geit), anti-humant IgG 1 10mL TMB-kromogen 1 10mL HRP-stoppløsning, 0,334M svovelsyre Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 5, 100, og 500µL Engangs mikropipettetips Testrør for pasientprøvefortynninger, 4mL volum Destillert eller deionisert vann 1L beholder for fortynnet HRP-vaskekonsentrat Mikrotiterplateleser som er i stand til å måle OD ved 450nm (og 620nm for dobbel bølgelengdeavlesninger). Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Fortynn HRP-vaskekonsentratet ut (1:40) ved å blande innholdet av HRP-vaskekonsentratflasken med 975mL destillert eller deionisert vann. Hvis hele platen ikke skal kjøres i denne perioden, kan du forberede en mindre mengde ved å blande 2,0mL av konsentratet med 78mL destillert - 3 -

4 eller deionisert vann for hver 16 brønner som skal brukes. Den fortynnede bufferen er stabil i én uke ved 2-8 o C. 3. Gjør klar en oppløsning (1:101) for hver pasientprøve ved å blande 5µL fra prøven med 500µL av HRP-prøvediluent. Fortynnede prøver må brukes innen 8 timer etter klargjøring. IKKE FORTYNN Intrinsic Factor ELISA lav positiv, Intrinsic Factor ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll. 4. Bestemmelse av forekomst eller fravær av Intrinsic Factor ved hjelp av arbitrære enheter krever to brønner for hver av de tre kontrollene og én eller to brønner for hver pasientprøve. Det anbefales at prøvene kjøres i duplikat. Analyseprosedyre 1. ALLE REAGENSER MÅ BRINGES TIL ROMTEMPERATUR (20-26 C) FØR DU BEGYNNER ANALYSEN. Plasser påkrevd antall av mikrobrønner/remser i holderen. Legg straks tilbake remser som du ikke skal bruke tilbake i posen med tørkemidler og forsegl forsvarlig for å minimalisere eksponering for vanndamp. 2. Tilsett 100µL av forhåndsfortynnet Intrinsic Factor ELISA lav positiv, Intrinsic Factor ELISA høy positiv, ELISA negativ kontroll og de fortynnede pasientprøvene til brønnene. Dekk brønnene og sørg for 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur på en vannrett overflate. Inkubasjonstiden begynner etter at siste prøve tilsettes. 3. Vasketrinn: Aspirer innholdet av hver brønn grundig. Tilsett µL av fortynnet HRPvaskebuffer til alle brønnene og deretter aspirer. Gjenta denne sekvensen to ganger til (totalt tre vasker). Inverter platen og bank på absorberende materiale for å fjerne resterende væske etter siste vask. Det er viktig å tømme hver brønn fullstendig etter hvert vasketrinn. Du opprettholder den samme sekvensen for aspirasjon som den som ble brukt for prøvetilsetning. 4. Tilsett 100μL av HRP-IgG-konjugatet til hver brønn. Konjugatet skal fjernes fra flaskene under standard aseptiske forhold og gode laboratorieteknikker. Bare fjern den koblingsmengden fra flasken som er nødvendig for analysen. DU SKAL ALDRI RETURNERE UBRUKT KONJUGAT TIL FLASKEN FOR Å UNNGÅ POTENSIELL MIKROBIELL OG/ELLER KJEMISK KONTAMINERING. Som i trinn 2, sørg for 30 minutters inkubasjon av brønnene. 5. Vasketrinn: Gjenta trinn Tilsett 100µL av TMB-kromogenet til hver brønn og sørg for 30 minutters inkubasjon i mørke ved romtemperatur. 7. Tilsett 100µL av HRP-stoppløsningen til hver brønn. Du opprettholder den samme sekvensen og timing ved tilsetting av HRP-stoppløsning som den som ble brukt for TMB-kromogenet. Bank forsiktig på platen med en finger for å blande brønnene grundig. 8. Avles absorbans (OD) fra hver brønn ved 450nm innen én time etter å ha stoppet reaksjonen. Hvis du ønsker bikromatiske målinger, kan du bruke 620nm som referansebølgelengde. Kvalitetskontroll 1. Intrinsic Factor ELISA lav positiv, Intrinsic Factor ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll skal kjøres med hvert oppsetti for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer som de skal. 2. Merk at da Intrinsic Factor ELISA lav positiv, Intrinsic Factor ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet, kontrollerer de ikke for prosedyremessige metoder tilknyttet fortynning av prøver. 3. Tilleggskontroller kan utføres i henhold til veiledninger eller krav fra lokale, statlige og/eller kommunale myndigheter eller akkrediterte organisasjoner. Egnet tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver og oppbevaring ved < -20 C. 4. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testen betraktes som ugyldig og analysen må gjentas. a. Absorbansen av forhåndsfortynnet Intrinsic Factor ELISA høy positiv må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet Intrinsic Factor ELISA lav positiv, og denne må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll. b. Forhåndsfortynnet Intrinsic Factor ELISA høy positiv må ha en høyere absorbans enn 1,0, mens absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll ikke kan være over 0,2. c. Absorbansen til Intrinsic Factor ELISA lav positiv må være mer enn doble av ELISA negativ kontroll eller over 0,

5 d. ELISA negativ kontroll og Intrinsic Factor ELISA høy positiv er ment for å kontrollere for substansiell reagensfeiling. Intrinsic Factor ELISA høy positiv vil ikke sikre presisjon ved analysens cut-off. e. Bruker henvises til CLSI (NCCLS) dokument C24-A3 for videre veiledning for egnet kvalitetskontrollpraksis. 12 Beregning av resultater OD-middelverdien for hvert sett av duplikater bestemmes først. Reaksjonen for hver prøve kan deretter beregnes ved å dele prøvens OD-middelverdi med OD-middelverdien for Intrinsic Factor ELISA lav positiv. Resultatet multipliseres med antall tildelte Intrinsic Factor ELISA lav positiv enheter som står oppgitt på etiketten. Prøve OD Prøveresultat = x Intrinsic Factor ELISA lav positiv (enheter) Intrinsic Factor ELISA lav positiv OD (enheter) Reaksjon er relatert til antistoffmengde fremstilt på ikke-lineært vis. Selv om økninger og minskinger av pasientens antistoffkonsentrasjoner vil gjenspeiles i form av tilsvarende stigning eller fall i reaksjon, er endringen ikke proporsjonal (dvs. en fordobling av antistoffkonsentrasjon vil ikke fordoble reaksjonen). Hvis det påkreves en nøyaktigere kvantifisering av pasientens antistoff, skal serielle fortynninger av pasientprøven kjøres og den siste fortynningen som måles positiv i analysen, skal rapporteres som pasientens antistofftiter. Tolkning av resultater ELISA-analysen er meget følsom for teknikk og er i stand til å påvise selv små forskjeller i pasientpopulasjonen. Verdiene som vises nedenfor er bare foreslåtte verdier. Hvert laboratorium bør etablere eget referanseområde basert på egne teknikker, kontroller, utstyr og pasientpopulasjoner i henhold til deres etablerte prosedyrer. Prøven kan da klassifiseres som negativ, tvetydige eller positiv i henhold til tabellen nedenfor. Enheter Negative < 20 Tvetydige 20,1-24,9 Positiv > Et positivt resultat indikerer forekomst av antistoffer til Intrinsic Factor og antyder muligheten for pernisiøs anemi. 2. Et negativt resultat indikerer ingen forekomst av intrinsic-faktorantistoff eller nivåer under analysens negative grense. 3. Et negativt intrinsic-faktorresultat utelukker ikke diagnosen av pernisiøs anemi da bare 60% av pasientene med pernisiøs anemi har dette antistoffet En prøve med tvetydige nivåer av Intrinsic Factor-antistoffer kan ikke bedømmes for antistoffstatus. Hvis resultatene forblir tvetydige etter gjentatt testing, bør resultatet rapporteres som tvetydig og/eller bør det tas ny prøve for testing. 5. Forekomsten av antigastriske parietalcelle antistoffer kan muligens eller kanskje ikke være overensstemmende med den til intrinsic faktorantistoffer og målingen av disse, og kan, i tillegg til, eller sammen med målingen av intrinsic faktorantistoffer, hjelpe til i evalueringen av pasienter som er mistenkt for å lide pernisiøs anemi Det foreslås at resultatene som rapporteres av laboratoriet skal inneholde uttalelsen: Følgende resultater ble fremstilt med INOVA QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. Intrinsic Factor-verdier fremstilt med forskjellige fabrikanters analysemetoder kan ikke brukes om hverandre. Størrelsen av rapportert IgG-nivåer kan ikke korreleres til et endepunkttiter

6 Prosedyrebegrensninger 1. Forekomsten av immunkomplekser eller andre immunglobulinaggregater i pasientprøven kan forårsake et forhøyet nivå av ikke-spesifikk binding og produsere feilaktige positive analyseresultater. 2. Resultatene til denne analysen bør brukes sammen med kliniske resultater og andre serologiske tester. Pasienter med pernisiøs anemi kan ha antistoffer mot intrinsic faktor og/eller gastriske parietalcelle antistoffer. Mens forekomsten av begge antistoffene øker tilliten til diagnosen av pernisiøs anemi, er det mulig at pasienter med pernisiøs anemi bare har ett av de to antistoffene. 1,9 3. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Forventede verdier Normalområde Et panel av 476 prøver innhentet fra asymptomatiske, friske individer ble testet med QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA-settet. Alder varierte fra (median, 43). Av de 276 prøvene med informasjon om alders- og kjønnfordeling var 150 prøver fra menn og 126 fra kvinner. Av de 476 prøvene var én sterkt positiv på 103,2 enheter, 1 var positiv på 25,5 enheter, bare så vidt over grensen og én var et tvetydig grensetilfelle på 20,2 enheter. Spesifisiteten til analysen var på 99,4% (473/476). Prevalensen til pernisiøs anemi har blitt estimert til 0,1-0,2%. Hvis vi ekskluderer det ene sterkt avvikende positive resultatet, var middel- og medianverdiene for den friske kontrollgruppen henholdsvis 5,7 og 5,0 enheter. Spesifikke Prestasjoner Karakteristikker Totalt 177 prøver fra pasienter mistenkt, antatt eller bekreftet for pernisiøs anemi som beskrevet nedenfor i kliniske studier og 499 prøver fra kontrollgrupper av friske (476) og syke (23) ble analysert med QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA for å vurdere testens sensitivitet og spesifisitet. Middel- og medianverdiene av ikke-pernisiøs anemigruppe var henholdsvis 5,9 og 4,9 enheter. Kliniske Studier Prøvene ble inndelt i tre kategorier for å gjenspeile tillitsgraden ved diagnose av pernisiøs anemi: 1) Mistenkt for pernisiøs anemi gastrisk parietalcelleantistoff positivt og/eller lav vitamin B 12 -verdi, men resultatene for intrinsic faktorantistoff var uoverensstemmende; 2) Antatt pernisiøs anemi laboratoriemålinger konsistente med pernisiøs anemi, inkludert positiv for gastrisk parietalcelleantistoff, lave vitamin B 12 -nivåer og gjennomsnittlig økt korpuskulært volum (typisk for pernisiøs anemi); 3) "Bekreftet eller pernisiøs anemi" - laboratoriemålinger konsistente med pernisiøs anemi inkludert positiv for gastrisk parietalcelleantistoff, lave vitamin B 12 -nivåer og gjennomsnittlig økt korpuskulært volum (typisk for pernisiøs anemi) og hematologisk bekreftelse på megaloblastisk anemi. Sensitivitet ble beregnet: 1) Ved å regne prøvene for bekreftet eller antatt pernisiøs anemi som sykdomspositive og mistenkt for pernisiøs anemi som sykdomsnegative, og 2) Ved å regne prøvene for bekreftet, antatt og mistenkt pernisiøs anemi som sykdomspositive. Ingen av prøvene for mistenkt anemi viste seg å være positive for intrinsic faktorantistoffer. Tabell 1: Sensitivitet og Spesifisitet av QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA n= pos eq neg Bekreftet (n=43) og antatt (n=55) pernisiøs anemi* Alle prøvene med pernisiøs anemi** Mistenkt (n=79), antatt (n=55) og bekreftet pernisiøs anemi (n=43) Ikke-pernisiøs anemi (friske og syke kontrollgrupper) * Prøver som var mistenkt for pernisiøs anemi ble regnet som sykdomstilfelle negative ** Prøver som var mistenkt for pernisiøs anemi ble regnet som sykdomstilfelle positive - 6 -

7 Sensitivitet 1) Grupper med antatt og bekreftet pernisiøs anemi inkludert som sykdomstilfelle positive: 93,9% (92/98); 95% Konfidensintervall (Cl): 87,1% - 97,7% Merknad: Tvetydige resultater betraktes som negative i analysen 2) Grupper med mistenkt, antatt eller bekreftet pernisiøs anemi inkludert som sykdomstilfelle positive: 52,0% (92/177); 95% Konfidensintervall (Cl): 44,4% - 59,5% Merknad: Tvetydige resultater betraktes som negative i analysen Spesifisitet 99,6% (497/499); 95% Konfidensintervall (Cl): 98,8% - 100% Merknad: Tvetydige resultater betraktes som negative i analysen Effektivitet 1) Grupper med antatt og bekreftet pernisiøs anemi inkludert som sykdomstilfelle positive: 98,7% 2) Grupper med mistenkt, antatt eller bekreftet pernisiøs anemi inkludert som sykdomstilfelle positive: 87,1% Sammenlikningsstudier QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA ble sammenliknet med en gastrisk parietalcelleantistoff (GPA) ELISA, klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA), og med en intrinsic faktor (IF) antistoff RIAanalyse. Negativ prosentoverensstemmelse var på mellom 97,5 til 100% for alle tre analysene. Positiv prosentoverensstemmelse mellom QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISAog IF RIA utført på sted 1 var 93,3%, men 30,3% på sted 2. Alle positive RIA-resultater på sted 1 var fra individer med hematologisk bevis på pernisiøs anemi. Klinisk informasjon var ikke tilgjengelig for prøvene fra sted 2. Tabell 2: Overensstemmelse mellom QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. GPA ELISA og Intrinsic Factor RIA Predikitive GPA Predikitive Intrinsic Predikitive Intrinsic ELISA Faktor RIA Sted 1 Faktor RIA Sted 2 QUANTA Lite TM Positive % Enighet 29,7% (22/74) 93,2% (41/44) 30,3% (24/79) Intrinsic Factor Negative % Enighet 97,5% (193/198) 100% (25/25) 100% (26/26) Antisoff ELISA I alt Enighet 49,1% (220/278) 95,6 (66/69) 63,3% (50/79) Kryssreaksjoner Sera fra 23 pasienter med autoimmune eller infeksjonssykdomsantistoffer inkludert H. Pylori, mitokondriell M2, cytomegalovirus, herpes simpleks virus, ASCA, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, dsdna, vevstransglutaminase og glomerulus basalmembran ble testet for kryssreaktivitet med QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. Ingen av prøvene viste seg å være positive ved bruk av QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. Presisjon og reproduserbarhet Intra-assay presisjon ble vurdert ved å kjøre syv prøver og settets høy positiv kontroll (HPC) totalt fem ganger hver. Tabell 3: Intra-assay presisjon av QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Spec.A (HPC) Spec. B Spec.C Spec.D Spec. E Spec. F Spec. G Spec. H Middelenheter 108,1 45,4 115,2 108,7 21,3 17,1 10,6 13,4 SD 2,1 0,8 2,5 3,4 1,7 0,8 0,4 0,7 CV % 1,9 1,8 2,2 3,2 8,0 5,0 4,0 5,3 Inter-assay presisjon ble vurdert ved å teste fem prøver i duplikat med settets høy positiv kontroll (HPC) og negativ kontroll (NC) to ganger daglig (én om morgenen og én om ettermiddagen) i tre dager

8 Tabell 4: Inter-analysprestasjon av QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA (HPC) NC Spec.1 Spec.2 Spec. 3 Spec. 4 Spec. 5 Middelenheter 109,1 1,1 107,9 47,4 13,9 108,0 29,2 SD 6,0 0,2 4,8 1,7 0,7 5,4 2,4 CV % 5,5 14,4 4,5 3,6 5,0 5,0 8,2 Referanser 1. Toh, B. H. & Alderuccio, F. Pernicious anaemia. Autoimmunity 37, (2004). 2. Gleeson, P. A. & Toh, B. H. Molecular targets in pernicious anaemia. Immunol Today 12, (1991). 3. Toh, B. H., van Driel, I. R. & Gleeson, P. A. Pernicious anemia. N Engl J Med 337, 1448 (1997). 4. Tefferi, A. Anemia in adults: a contemporary approach to diagnosis. Mayo Clin Proc 78, (2003). 5. Ye, W. & Nyren, O. Risk of cancers of the oesophagus and stomach by histology or subsite in patients hospitalised for pernicious anaemia. Gut 52, (2003). 6. Hsing, A. W. et al. Pernicious anemia and subsequent cancer. A population-based cohort study. Cancer 71, (1993). 7. Mellemkjaer, L. et al. Pernicious anaemia and cancer risk in Denmark. Br J Cancer 73, (1996). 8. Waters, H. M., Smith, C., Howarth, J. E., Dawson, D. W. & Delamore, I. W. New enzyme immunoassay for detecting total, type I, and type II intrinsic factor antibodies. J Clin Pathol 42, (1989). 9. ASCIA. (Australian Society of Clinical Immunology and Allergy in conjunction with the Royal Australian College of Pathologists); November, Consensus Guidelines on Anti-Intrinsic Factor Antibody Testing. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Feb Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline-3 rd edition C24-A3, Vol. 26, No. 25. Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service NOR November 2007 Rev