QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet

Transkript

1 QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde QUANTA Lite β 2 GPI IgG er en enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) for semikvantitativ påvisning av β 2 GPI IgG antistoffer i humant serum. Tilstedeværelse av β 2 GPI IgG antistoffer kan brukes sammen med kliniske resultater og andre laboratorietester som en hjelp til å bedømme risikoen for trombose hos individer med systemisk lupus erythematosus (SLE) eller lupuslignende forstyrrelser. Sammendrag og forklaring av testen Antikardiolipinantistoffer (ACA) har blitt sterkt assosiert med venøs og arteriell trombose. 1-5 Disse funn ble først observert under studier av systemisk lupus erythematosus, en sykdom hvis én av flere symptomer inkluderer trombose. 6,7 Nylige studier 8-12 har vist at en 50kD serumkofaktor er nødvendig for kardiolipinantistoffer, indusert hos SLE-pasienter, for å binde seg til kardiolipin som er coatet på plastikkplater. Kofaktoren har blitt identifisert som β 2 -glykoprotein I også kalt apolipoprotein H. 8,12,13,14 Mens β 2 GPI har blitt kjent som en in vitro-inhibitor av den indre blodkoagulasjonsbane-, 15 ADP-avhengig aggregasjons-, 16 og protrombinase-aktivitet av aktiverte blodplater, 17 er dens fysiologiske funksjon fremdeles uklar. Det er blitt klart at antikardiolipinantistoff fra pasienter med antifosfolipid syndrom (APS) gjenkjenner en modifisert β 2 GPI-struktur og ikke kardiolipin, naturlig β 2 GPI eller en epitop strukturelt definert av både kardiolipin og β 2 GPI Galli et al. 9 og Viard et al. 18 rapporterte hver for seg at antikardiolipinantistoff fra autoimmune pasienter (dvs. SLE og/eller APS) ble rettet mot β 2 GPI-molekylet coatet polystyrenplatene. Koike 11 og Matsuura 12 viste videre at β 2 GPI virkelig er antigenet som mange antikardiolipinantistoffpasienter har antistoff som bindes til og de viste videre at fosfolipid bare brukes til å forbinde β 2 GPI til faststoffasen. Det eksisterer en velkjent mulighet for at tradisjonelle antikardiolipinantistofftester kan gi feilaktige positive resultater grunnet fosfolipidenes kryssreaksjon med bestemte infeksjonssykdomsprøver, spesielt syfilis, og også med bestemte andre autoantistoffer som dobbelttråd DNA. 2,3 Ved å eliminere fosfolipid fra faststoffasen og ved bare å bruke β 2 GPI blir testen enda mer spesifikk for påvisning av mulige koagulasjonsproblemer. Denne forbedrede spesifisiteten har blitt vist på av flere grupper. 11,12,16,17,19,20,21,22 β 2 GPI-autoantistofftesten er en nyttig og mer spesifikk analyse for bruk sammen med de tradisjonelt brukte antikardiolipinantistoff og lupus antikoagulanttestene for støtte til diagnostikk av trombose hos risikopasienter. IgG-klasse β 2 GPI-antistoffer ble funnet hos 17 av 47 SLE-pasienter (36%). 18 Ni av disse 47 pasientene med SLE hadde trombose og 8 av disse (89%) hadde β 2 GPI antistoff. Hisham et al. 20 fant IgG-klasse β 2 GPI-antistoffer hos alle fem pasientene (100%) med minst to dokumenterte kliniske symptomer på APS. Alle fem pasientene hadde høye nivåer av β 2 GPIantistoffer. 8 av 14 pasienter (57%) klassifisert med lave nivåer av β 2 GPI-antistoffer hadde i det minste én tromboseforekomst. Tsutsumi, et al. 22 fant IgG og IgM-antistoffer mot β 2 GPI hos 10,1% og 5,8% henholdsvis av 308 tilfeldig utvalgte japanske SLE-pasienter. IgG β 2 GPI-antistoffer var vanligere hos pasienter som tidligere hadde hatt trombose. Denne gruppen rapporterte også at av 15 pasienter med gjentatte fostertap, var 20% IgG β 2 GPI-positive. De viste også at pasienter som hadde hatt trombose hadde større sannsynlighet for å være positive for IgM β 2 GPI og at nivåene av IgM β 2 GPI var høyere i grupper med trombose enn i gruppene uten. Av 15 pasienter uten tidligere fostertap var ingen IgM β 2 GPI-positive. Cabiedes, et al. 23 undersøkte 94 patienter med SLE og 39 hadde kliniske symptomer på APS. Det var sterkere assosiasjon mellom β 2 GPI-antistoffer enn med konvensjonell positiv ACA-test og kliniske symptomer på APS. IgG β 2 GPI-antistoffer forekom i sera fra 16 av 18 pasienter (89%) med APS. Av 22 pasienter positive for ACA, fremdeles uten kliniske symptomer på APS, var ingen β 2 GPI positive. Cerrato, et al. 24 fant IgG anti-β 2 GPI hos 87,5% av en gruppe på 32 pasienter som hadde hatt trombose (APS). IgM anti-β 2 GPI ble funnet hos 71,9% i denne samme gruppen av 32 pasienter. Sebastiani, et al. 25 påviste IgG anti-β 2 GPI hos 110 pasienter (20,3%) og IgM hos 109 pasienter (20,1%) av totalt 542 pasienter med SLE. Forekomst av anti-β 2 GPI var sterkt assosiert med ACA (p < 10-5 ). De viste videre at IgG og IgM β 2 GPI-antistoffer var assosiert med både venøs og arteriell trombose

2 Prosedyreprinsipper Renset β 2 GPI-antigen er bundet til brønnene til en mikrotiterplate av polystyren under betingelsene som vil konservere antigenet i naturlig tilstand. Forhåndsfortynnede kontroller og fortynnet pasientserum blandes i separate brønner slik at tilstedeværende β 2 GPI IgG antistoffer bindes til det immobiliserte antigenet. Ubundet prøve vaskes vekk og et enzym-merket antihuman IgG-konjugat tilsettes hver brønn. En andre inkubasjon gjør det mulig for det enzymmerkede anti-humane IgG-antistoffet å binde seg til pasientens antistoff som har festet seg på mikrobrønnene. Analysen kan avleses spektrofotometrisk ved å måle og sammenlikne fargeintensiteten som utvikles i pasientbrønnene mot en fem punktkalibreringskurve. Standarden som brukes til å konstruere denne kurven er referert til referansekalibratorene for IgG β 2 - glykoprotein I, tilgjengelig fra Rheumatology Lab, Seton Hall University, St. Joseph's Hospital and Medical Center. 26 Resultater rapporteres semikvantitativt i standard IgG anti-β 2 GPI-enheter (SGU). Reagenser 1. En ELISA-mikrotiterplate av polystyren dekket med renset β 2 GPI antigen (12-1 x 8 brønner), med holder i foliepakning inneholdende tørkemidler. 2. ELISA negativ kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum utenhumane IgG antistoffer mot β 2 GPI, forhåndsfortynnet, 1,2mL 3. β 2 GPI IgG ELISA kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant IgG serum med antistoff mot β 2 GPI, forhåndsfortynnet, 1,2mL 4. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrator A, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og 5. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrator B, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og 6. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrator C, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og 7. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrator D, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og 8. β 2 GPI IgG ELISA Kalibrator E, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og 9. HRP prøvediluent prøve, 1 ampulle rosafarget som inneholder fosfatbufret saltvann, Tween 20, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 50 ml 10. HRP vaskekonsentrat, 1 ampulle med 40x konsentrat rødfarget som inneholder fosfatbufret saltvann og Tween 20, 25 ml. Se metodeavsnittet for veiledning om fortynning. 11. β 2 HRP IgG-konjugat, (goat), anti-humant IgG, 1 ampulle blåfarget som inneholder buffer, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 10mL 12. TMB-kromogen, 1 ampulle som inneholder stabilisatorer, 10mL 13. HRP stoppløsning, 0,344M svovelsyre, 1 ampulle fargeløs, 10mL Advarsler 1. ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie (0,02% kloramfenikol) i prøvediluenten, kontrollene og konjugat antatt som kreftfremkallende i staten California. 2. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Derfor skal β 2 GPI IgG ELISA kontroll, β 2 GPI IgG kalibrator og ELISA negativ kontroll behandles på samme vis som potensielt infisert materiale Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med bly- eller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 4. HRP-konjugatet inneholder et fortynnet giftig/korrosivt kjemikalie som kan være giftig ved svelging av store mengder. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 5. TMB-kromogenet inneholder et kjemikalie som kan være skadelig ved inhalering, svelging eller opptak gjennom huden. Unngå inhalering, svelging eller hud- og øyenkontakt for å forhindre skader. 6. HRP-stoppløsningen inneholder en fortynnet svovelsyreoppløsning. Unngå eksponering av baser, metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer. Svovelsyre er giftig og korrosiv og kan være giftig ved svelging. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning

3 7. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 8. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking og utilstrekkelig væskefjerning fra ELISAbrønnremsene vil forårsake dårlig presisjon og/eller høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, lufttemperaturen, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske fra brønnen til ELISA-remsen, fotometeret som er brukt til å måle resultatene og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Det anbefales at man holder seg strengt innenfor rammene til protokollen. 7. Ufullstendig forsegling av glidelåsen til posen som inneholder mikrobrønnremsene og tørkemidlene vil resultere i degradasjon av antigen og dårlig presisjon. 8. Uakseptabelt lave sbsorbanser kan observeres etter to eller flere bruk fra én enkel flaske med HRP-konjugat over en tidsperiode. Det er viktig å følge alle anbefalte behandlingsprosedyrer for HRP-konjugatet for å forhindre at dette oppstår. 9. Kjemisk kontaminasjon av HRP-konjugatet kan forårsakes av ufullstendig rengjøring eller skylling av utstyr eller instrumenter. Avfall fra vanlige laboratoriekjemikalier slik som formalin, blekemiddel, etanol eller vaskemiddel vil forårsake degradasjon av HRPkonjugatet over tid. Skyll alt utstyret og alle instrumentene grundig etter bruk av kjemiske rengjørings- og desinfeksjonsmidler. Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Ubrukte antigen-dekkede mikrobrønnremser skal forsvarlig forsegles på ny i folieposen som inneholder tørkemidlene og oppbevares ved 2-8 C. 3. Fortynnet vaskebuffer er stabil i én uke ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene negativt. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer 1 β 2 GPI ELISA-mikrotiterplate (12-1 x 8 brønner), med holder 1 1,2mL forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator A 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator B 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator C 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator D 1 1,2mL forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator E 1 50mL HRP-prøvediluent 1 25mL HRP-vaskekonsentrat, 40x konsentrat - 3 -

4 1 10mL β 2 HRP IgG-konjugat, (goat), anti-humant IgG 1 10mL TMB-kromogen 1 10mL HRP-stoppløsning, 0,334M svovelsyre Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 5, 100, og 500µL Engangs mikropipettetips Testrør for pasientprøvefortynninger, 4mL volum Destillert eller deionisert vann 1L beholder for fortynnet HRP-vaskekonsentrat Mikrotiterplateleser som er i stand til å måle OD ved 450nm (og 620nm for dobbel bølgelengdeavlesninger). Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Fortynn HRP-vaskekonsentrat ut (1:40) ved å blande innholdet av HRP-vaskekonsentrat med 975mL destillert eller deionisert vann. Hvis hele platen ikke skal kjøres i denne perioden, kan du forberede en mindre mengde ved å blande 2,0mL av konsentratet med 78mL destillert eller deionisert vann for hver 16 brønner som skal brukes. 3. Gjør klar en oppløsning (1:101) for hver pasientprøve ved å blande 5µL fra prøven med 500µL av HRP-prøvediluent. Fortynnede prøver må brukes innen 8 timer etter klargjøring. IKKE FORTYNN β 2 GPI IgG ELISA Kalibratorer, β 2 GPI IgG ELISA Kontroll og ELISA Negativ Kontroll. 4. Bestemmelse av forekomst eller fravær av ved hjelp av arbitrære enheter krever to brønner for hver av de tre kontrollene og én eller to brønner for hver pasientprøve. Det anbefales at prøvene kjøres i duplikat. 5. Forberedelse til standardkurve: Bruk FORHÅNDSFORTYNNET β 2 GPI IgG kalibratorer fra A til E direkte fra ampullen for punktene A til og med E på fempunktsstandardkurven. Fempunktsstandardkurven har følgende verdier: Punkt Standard IgG β 2 GPI Enheter (SGU) A Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator A 150,0 B Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator B 75,0 C Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator C 37,5 D Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator D 18,8 eller 18,75 E Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG Kalibrator E 9,4 eller 9,375 Analyseprosedyre 1. ALLE REAGENSER MÅ BRINGES OPP TIL ROMTEMPERATUR (20-26 C) FØR DU BEGYNNER ANALYSEN. Plasser påkrevd antall av mikrobrønner/remser i holderen. Legg straks tilbake remser som du ikke skal bruke tilbake i posen med tørkemidler og forsegl forsvarlig for å minimalisere eksponering for vanndamp. 2. Bland 100 µl fra hver av de fem kalibratorene, fortynnede pasientprøver, ELISA negativ kontroll og β 2 GPI IgG kontroll i brønnene. MERKNAD: Både β 2 GPI IgG kontroll og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet og klare til bruk. Verdien og angitte grenser til β 2 GPI IgG ELISA kontroll er skrevet på ampulleetiketten. Hvis kontrollen ikke faller innenfor de angitte grensene skrevet på etiketten, skal du gjenta undersøkelsen. Hvis kontrollen faller utenfor oppgitt grense ved gjentatt testing, ring INOVA teknisk service for assistanse. Det anbefales å kjøre alle prøvene i duplikat. 3. Dekk brønnene og sørg for 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur på en vannrett overflate. Inkubasjonstiden begynner etter at siste prøve tilsettes. 4. Vasketrinn: Aspirer innholdet av hver brønn grundig. Tilsett µL av fortynnet HRP-buffer til alle brønnene og deretter aspirer. Gjenta denne sekvensen to ganger til (totalt tre vasker). Inverter platen og bank på absorberende materiale for å fjerne resterende væske etter siste vask. Det er viktig å tømme hver brønn fullstendig etter hvert vasketrinn. Du opprettholder den samme sekvensen for aspirasjon som den som ble brukt for prøvetilsetning. 5. Tilsett 100μl av β 2 HRP-IgG-konjugatet til hver brønn. Konjugatet skal fjernes fra flaskene under standard aseptiske forhold og gode laboratorieteknikker. Bare fjern den koblingsmengden fra flasken som er nødvendig for analysen. DU SKAL ALDRI RETURNERE UBRUKT KONJUGAT TIL FLASKEN FOR Å UNNGÅ POTENSIELL MIKROBIELL OG/ELLER KJEMISK KONTAMINERING. Som i trinn 2, sørg for 30 minutters inkubasjon av brønnene

5 6. Vasketrinn: Gjenta trinn Tilsett 100µL av TMB-kromogenet til hver brønn og sørg for 30 minutters inkubasjon i mørke ved romtemperatur. 8. Tilsett 100µL av HRP-stoppløsningen til hver brønn. Du opprettholder den samme sekvensen og timing ved tilsetting av HRP-stoppløsning som den som ble brukt for TMBkromogenet. Bank forsiktig på platen med en finger for å blande brønnene grundig. 9. Avles absorbans (OD) fra hver brønn ved 450nm innen én time etter å ha stoppet reaksjonen. Hvis du ønsker bikromatiske målinger, kan du bruke 620nm som referansebølgelengde. Kvalitetskontroll 1. β 2 GPI IgG ELISA kalibratorer, β 2 GPI IgG ELISA kontroll og ELISA negativ kontroll skal kjøres med hvert oppsett for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer som de skal. 2. Merk at da β 2 GPI IgG kalibratorer, β 2 GPI IgG ELISA kontroll og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet, kontrollerer de ikke for prosedyremessige metoder tilknyttet fortynning av prøver. 3. Tilleggskontroller kan utføres i henhold til veiledninger eller krav fra lokale, statlige og/eller kommunale myndigheter eller akkrediterte organisasjoner. Egnet tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver og oppbevaring ved < -20 C. 4. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testen betraktes som ugyldig og analysen må gjentas. a. Absorbansen av forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG ELISA Kalibrator A og β 2 GPI IgG ELISA kontroll må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet, og denne må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll. b. Forhåndsfortynnet β 2 GPI IgG ELISA Kalibrator A må ha en høyere absorbans enn 1,0, mens absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll ikke kan være over 0,2. c. Absorbansen til β 2 GPI IgG ELISA kontroll må være mer enn doble av ELISA negativ kontroll eller over 0,25. d. β 2 GPI IgG ELISA kontrollkonsentrasjon må være innenfor de angitte grensene som er skrevet på etiketten. e. Bruker henvises til CLSI (NCCLS) dokument C24-A3 for videre veiledning for egnet kvalitetskontrollpraksis. Beregning av resultater 1. Bestem gjennomsnittsverdien for alle duplikatavlesningene. 2. Plott gjennomsnittsabsorbans til kalibratorkurven for IgG-analysen mot logaritmen til konsentrasjonene deres. Bruk en linje som best tilpasses kurveplottet. Du kan alternativt bruke et log/log plot. SGU-enhetene som tildeles kalibratorene står på kalibratorampullen. 3. Bestem den ukjente β 2 GPI IgG-konsentrasjonen i standard β 2 GPI IgG enheter (SGU) fra X-aksen ved å lese av tilhørende absorbans på Y-aksen. Kalibratorer og kontroll for dette settet viser til IgG β 2 Glycoprotien I referansestandarder. 4. Negative verdier fra 0-20 enheter. Positive resultater er høyere enn 20 SGU. Tolkning av resultater ELISA-analysen er meget følsom for teknikk og er i stand til å påvise selv små forskjeller i pasientpopulasjonen. Verdiene som vises nedenfor er bare foreslåtte verdier. Hvert laboratorium bør etablere eget referanseområde basert på egne teknikker, kontroller, utstyr og pasientpopulasjoner i henhold til deres etablerte prosedyrer. 1. Et positivt resultat indikerer forekomst av β 2 GPI IgG-antistoffer og antyder muligheten for bestemte autoimmune troboemboliske forstyrrelser som for eksempel de sekundære forstyrrelsene til systemisk lupus erythematosus eller andre lupusaktige trombose sykdommer. 2. Et negativt resultat indikerer ingen forekomst av β 2 GPI IgG-antistoff eller nivåer under analysens cut-off. 3. Det foreslås at resultatene som rapporteres av laboratoriet skal inneholde uttalelsen: Følgende resultater ble fremstilt med INOVA QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA. β 2 GPI IgG-verdier fremstilt med forskjellige fabrikanters analysemetoder kan ikke brukes om hverandre. Størrelsen av rapportert IgG-nivåer kan ikke korreleres til et endepunkttiter

6 Prosedyrebegrensninger 1. Den kliniske betydningen av β 2 GPI antisoffer i sykdommer andre enn SLE er i dag tema for forskning. 2. Når det blir funnet negative anti-β 2 -titere sammen med kliniske indikasjoner, kan en lupus antikoagulant, antikardiolipin eller annen tilleggstesting være nødvendig. 3. Diagnose kan ikke gjøres på grunnlag av anti β 2 -GPI resultatene alene. Disse resultatene må tolkes sammen med resultater fra legeundersøke. 4. Behandling må ikke begynne bare på grunnlag av et positiv β 2 -GPI titer alene. Underbyggende kliniske symptomer må også forekomme. 5. Det forventes at noen prøver kan være antikardiolipin-positive selv om de er anti- β 2 GPInegative. Anti-β 2 GPI-testen er en mer spesifikk markør for troboembolisk risiko. Antikardiolipintesten kan produsere feilaktige positive resultater grunnet kryssreaksjon med dsdna eller bestemte infeksjonssykdomsantistoffer. 6. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Forventede verdier Normalområde Seminarprøver Det Syvende internasjonale symposiet om antifosfolipidantistoffer New Orleans Som en del av det syvende antifosfolipid-møtet som ble holdt oktober , 1996, ble det arrangert et arbeidsseminar for å vurdere ytelse på flere forskningsbaserte og kommersielle antikaridolipintester. QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA-settet ble testet med disse prøvene. Panelet inkluderte 10 prøver fra pasienter med dokumentert antifosfolipid syndrom (APS), 7 prøver fra pasienter med infeksjonssykdommer som for eksempel syfilis og q-feber, 2 prøver fra pasienter med revmatisk autoimmun sykdom og 11 normale prøver. Prøvene ble også testet med en tradisjonell antikardiolipin-analyse. Resultatene oppsummeres nedenfor. Gruppe No. No.+ No.+ Prøver β 2 GPI Kardiolipin APS Infeksjonssykdommer Revmatisk sykdom Normalprøver Alle de 10 APS-pasientene ble testet positive med både β 2 GPI- og kardiolipin antistoffanalyser. Av de tre andre pasientgruppene var alle prøvene negative i β 2 GPI-testen med unntak av én revmatisk sykdomsprøve. Fire av infeksjonssykdomsprøvene, begge de revmatiske prøvene og én av de elleve normalprøvene var positive i den tradisjonelle kardiolipinantistofftesten. Spesifikke Prestasjoner Karakteristikker Oppsummering av kliniske studier Prestasjonen til QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA-testen ble evaluert i ett internt og fire eksterne kliniske studier. Resultatene oppsummeres i tabellen nedenfor. Pasientgruppe Ant. Ant. positive (%) APS * sekundært til SLE (97,2) Primært APS (93,3) SLE 34 2 (5,8) Revmatisk artritt 17 0 (0) Polyhypergamma-globulinemia 7 0 (0) Infeksjonssykdommer** 81 0 (0) Normalprøver (0,4) * APS = Antifosfolipid syndrom ** Flesteparten av disse hadde positiv syfilis serologi β 2 GPI-testen har en klinisk sensitivitet på 96,2% og klinisk spesifisitet på 99,6% basert på testresultatene ovenfor

7 Relativ sensitivitet og spesifisitet Konkordans med antikardiolipin-analyse 40 sera tilfeldig utvalgt fra prøvene tilsendt et stort referanselaboratorium for kardiolipinantistofftesting ble testet for IgG-antistoffer mot både kardiolipin og β 2 GPI. Resultatene oppsummeres nedenfor. β 2 GPI Relativ sensitivitet 20,8% Kardiolipin Relativ spesifisitet 100,0% Relativ effektivitet 52,5% Fem prøver var positive med begge analysene og 16 prøver var negative i begge. Ingen prøver ble funnet positive for β 2 GPI og negative for kardiolipinantistoffer. 19 prøver ble funnet å være antikardiolipin-positive og negative for IgG-antistoffer mot β 2 GPI. I dette sammenlikningsstudiet i liten skala med tilfeldig utvalgte prøver uten tidligere klinisk sykdomsforløp, fremtrer den relative sensitiviteten til IgG β 2 GPI-resultatene som lav, sammenliknet med resultatene for IgG antikardiolipin-analysen. Dette er ikke uventet. Tradisjonelle antikardiolipin-analyser påviser antistoffer mot β 2 GPI og antistoffer som reagerer med selve fosfolipidet. Som vist i dataene ovenfor fra New Orleans seminareet og fra oppsummeringen av kliniske studier, viser β 2 GPIanalysen sammenlignbar sensitivitet og høyere spesifisitet ved sammenligning med antikardiolipin-resultater på dokumenterte APS-pasienter. Presisjon og reproduserbarhet Presisjons- og reproduserbarhetsdata ble beregnet ved å kjøre en negativ, høy og moderat positiv prøve seks ganger om morgenen og om ettermiddagen i løpet av tre dager etter hverandre. Middelverdien til den negative prøven var 18,9, til den moderat positive prøven, 44,3 og den sterkt positive, 82,4. Resultatene innen og mellom seriene oppsummeres i tabellen nedenfor. Negative Moderat positiv Sterk positiv SD CV SD CV SD CV Samlet 0,86 4,5% 2,48 5,6% 2,79 3,4% Innen serien 0,75 4,0% 2,34 5,3% 2,66 3,2% Mellom serier 0,82 4,3% 2,41 5,4% 2,87 3,5% QUANTA Lite er et registrert varemerke for INOVA Diagnostics, Inc

8 Referanser 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: , Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: , Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: , Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: , McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: , Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: , Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: , McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 -glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: , Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: , Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: , Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 -GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 -GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: , Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: , Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: , Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: , Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: , Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: , Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: , Roubey, RA. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: , Tsutsumi A, et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: , Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899, Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β 2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516, Sebastiani, G.D., et al. Anti β 2 GPI and acl in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5: 519, Erickson, E., S. Najmey, L. Keil, H. EL-Kadi, and V. DeBari. Reference calibrators for IgG antibodies to β 2 -glycoprotein I: preparation, properties and availability to investigators. Clinical Chemistry, 42: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Teknisk Service (Utenfor USA): support@inovadx.com Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service NOR September 2010 Rev