QUANTA Lite TM h-ttg IgA ELISA (Humant vevstransglutaminase) For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet

Transkript

1 QUANTA Lite TM h-ttg IgA ELISA (Humant vevstransglutaminase) For In Vitro-diagnostikk CLIA-klassifisering: Høy kompleksitet Anvendelsesområde QUANTA Lite TM h-ttg IgA er en enzymkoblet immunsorbent analyse (ELISA) for semikvantitativ påvisning av IgA-antistoffer mot vevstransglutaminase (ttg) i humant serum. Påvisning av disse antistoffene er en støtte i diagnosen av bestemte glutensensitive enteropatier slik som cøliakisykdommer og dermatitis herpetiformis. Sammendrag og forklaring av testen Cøliaki og dermatitis herpetiformis, de to kjente formene av glutensensitiv enteropati (GSE) kjennetegnes av kronisk betennelse av intestinal mukosa og utflating av epitelet eller positiv totteatrofi. 1,2 Intoleranse mot gluten, hveteproteinet, rug og bygg forårsaker GSE. Pasienter med cøliaki kan lide av diaré, gastrointestinale problemer, anemi, tretthet, psykiatriske problemer og andre diverse sekundæreffekter eller de kan være uten symptomer. 2 Dermatitis herpetiformis er en hudsykdom assosiert med GSE. Alle GSE-pasienter har økt risiko for lymfoma. 3 En glutenfri diett kontrollerer GSE og relaterte risikoer. Funn i 1950-årene om gluten forårsaker cøliaki gjorde behandling mulig ved å gi pasientene glutenfri diett. Etter utviklingen av en metode for å ta små tarmbiopsier oralt var legene i stand til å kontrollere for totteatrofi. Mens positiv totteatrofi kan forekomme ved andre forstyrrelser, kan GSE bevises ved å følge de opprinnelige kriteriene til Den europeiske barnegastroenterologforeningen (ESPGAN). Disse kriteriene krever cirka ett års iherdige studier med: a) en innledende positiv tarmbiopsi, b) 6 måneder på glutenfri diett, c) en negativ andre tarmbiopsi, d) glutenstimulasjon i 6 måneder og e) en positiv tredje tarmbiopsi. Utviklingen av serumtester for tre forskjellige antistoffer av IgA-isotypen 3 gjorde det mulig å generere raskere, reviderte ESPGAN-kriterier for cøliaki slik det ble rapportert i Disse testene inkluderer IgA endomysialantistoffer (EMA), 4 IgA antigliadinantistoffer (AGA) og R1 antiretikulinantistoffer (ARA). De reviderte ESPGAN-kriteriene krever: a) En eneste positiv tarmbiopsi og b) påvisning av minst to av de tre IgA-klasse antistoffene nevnt ovenfor. Flere studier har siden den gangen vist at IgA EMA-tester har over 99% spesifisitet for GSE og høyere sensitivitet enn ARA eller AGA-tester Da IgA EMA forsvinner når cøliakipasienter eller pasienter med dermatitis herpetiformis går over på glutenfri diett, hjelper testene for disse antistoffene å kontrollere om pasientene holder seg til dietten sin. 4,5,12 I den senere tid har endomysium-antigenet blitt identifisert som det tverrbindende proteinenzymet kjent som vevstransglutaminase(ttg). 14,15 Antigen spesifikke ELISA-prosedyrer som inkorporerer ttg gir et pålitelig, objektivt alternativ til de tradisjonelle immunfluorescens baserte analyser ved å inkorporere tynne snitt av spiserør fra primater som substrat ELISA-prosedyren kan tilpasse til både store og små antall pasientprøver. I løpet av de to siste årene har det humane ttg-antigenet blitt produsert ved rekombinant teknologi. Rekombinant humant antigen kan ha bestemte fordeler sammenliknet med det mer tradisjonelle marsvinsleverantigenet. 16,17,20 To nyvinninger i cøliakiserologien er bruken av naturlig humant vevstransglutaminase isolert fra røde blodceller og bruken av tester som er i stand til å påvise vevstransglutaminase av IgG-klassen. Bruken av naturlig human rød blodcelle ttg heller enn marsvin eller rekombinant fremstillet humant antigen gir fordelen med lettere rensing og resulterter i preparater som er fri fra bakterie-, insekt- eller andre 21, 22, 23, 24 kontaminerende proteiner. De humant antigen ttg ELISA-analysene som presenteres i faglitteraturen synes å fungere godt i sammenlikning med de mer tradisjonelle marsvinantigenbaserte 16, 17, testene. IgG-klasse gliadinantistoff-settet har vært i bruk i god stund nå, hovedsakelig som støtte for å vurdere IgA-mangel hos individer. Flere forskere har påvist den kliniske nytten ved å påvise IgG-klasse antistoffer mot ttg. 17,20,21 I én av disse studiene ble testsensitiviten økt fra 91,5% for IgA-antistoff alene til 98,5% når man vurderte både IgA og IgG-resultatene. 17 Prosedyreprinsipper Naturlig humant vevstransglutaminase (h-ttg) antigen isolert fra friske røde blodceller bindes til brønnene på en polystyren mikrotiterplate under betingelsene som vil konservere antigenet i naturlig tilstand. Forhåndsfortynnede kontroller og fortynnet pasientserum tilsettes i separate brønner slik at tilstedeværende h-ttg IgA-antistoff bindes til det immobiliserte antigenet. Ubundet prøve vaskes vekk og et enzym-merket anti-human IgA-konjugat tilsettes hver brønn. En andre inkubasjon gjør det mulig for det enzym-merkede anti-humane IgA-antistoffet å binde seg til pasientens antistoff som har festet seg på mikrobrønnene. Etter å ha vasket bort enzym-merket anti-humant IgA-antistoff som ikke har festet seg, måles gjenværende enzymaktivtet ved å tilsette et substrat og fargeutviklingen måles. Analysen kan avleses spektrofotometrisk ved å måle og sammenlikne fargeintensiteten som utvikles i pasientbrønnene med fargen i kontrollbrønnene

2 Reagenser 1. Mikrotiter ELISA-plate av polystyren dekket med renset h-ttg-antigen (12-1 x 8 brønner), med holder i foliepakning inneholdende tørkemidler 2. ELISA negativ kontroll, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant serum uten humane IgA antistoffer mot h-ttg, forhåndsfortynnet, 1,2mL 3. h-ttg IgA ELISA lav positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant IgA-serum med ikke-humane antistoff mot h-ttg, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 4. h-ttg IgA ELISA høy positiv, 1 bufret ampulle som inneholder konserveringsmiddel og humant IgA serum med antistoff mot h-ttg, forhåndsfortynnet, 1,2 ml 5. HRP prøvediluent prøve, 1 ampulle rosafarget som inneholder fosfatbufret saltvann, Tween 20, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 50 ml 6. HRP vaskekonsentrat, 1 ampulle med 40x konsentrat rødfarget som inneholder fosfatbufret saltvann og Tween 20, 25 ml. Se metodeavsnittet for veiledning om fortynning. 7. HRP IgA-konjugat, (geit), anti-humant IgA, 1 ampulle gulfarget som inneholder buffer, proteinstabilisatorer og konserveringsmiddel, 10 ml 8. TMB-kromogen, 1 ampulle som inneholder stabilisatorer, 10 ml 9. HRP stoppløsning, 0,344M svovelsyre, 1 ampulle fargeløs, 10 ml Advarsler 1. ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie (0,02% kloramfenikol) i prøvediluenten, kontrollene og konjugat antatt som kreftfremkallende i staten California. 2. Alt materiale fra menneskekilder brukt i preparatet til kontroller for dette produktet har blitt testet og funnet negativ for antistoff mot HIV, HBsAg og HCV av metoder klarert av det amerikanske helsetilsynet (FDA). Imidlertid kan ingen testmetode gi fullstendig sikkerhet om at HIV, HBV, HCV eller andre smittsomme agens er fraværende. Derfor skal h-ttg IgA ELISA lav positiv, h-ttg IgA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll behandles på samme måte som potensielt smittefarlig materiale Natriumazid brukes som konserveringsmiddel. Natriumazid er en gift og kan være giftig ved svelging eller ved opptak gjennom huden eller via øynene. Natriumazid kan reagere med blyeller kobberrør og danne potensielt eksplosive metallazider. Bruk rikelig med vann i vaskene, hvis de brukes for avfallshåndtering av reagenser, for å forhindre oppsamling av azider. 4. HRP-konjugatet inneholder et fortynnet giftig/korrosivt kjemikalie som kan være giftig ved svelging av store mengder. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 5. TMB-kromogenet inneholder et kjemikalie som kan være skadelig ved inhalering, svelging eller opptak gjennom huden. Unngå inhalering, svelging eller hud- og øyenkontakt for å forhindre skader. 6. HRP-stoppløsningen inneholder en fortynnet svovelsyreoppløsning. Unngå eksponering av baser, metaller eller andre forbindelser som kan reagere med syrer. Svovelsyre er giftig og korrosiv og kan være giftig ved svelging. Unngå hud- og øyenkontakt for å forhindre mulig kjemisk forbrenning. 7. Bruk egnet personlig verneutstyr når du arbeider med reagensene som er levert. 8. Dersom du søler reagenser skal disse straks vaskes bort. Du skal være oppmerksom på alle kommunale, statlige og lokale miljøbestemmelser ved avfallsbehandling. Forholdsregler 1. Dette produktet brukes for in vitro-diagnostikk. 2. Utbytting av komponenter andre enn de som leveres med dette systemet kan føre til inkonsistente resultater. 3. Ufullstendig eller ineffektiv vasking og utilstrekkelig væskefjerning fra ELISA-brønnremsene vil forårsake dårlig presisjon og/eller høy bakgrunn. 4. Tilpassing av denne analysen for bruk sammen med, helt eller delvis, automatiske prøveprosessorer eller andre væskebehandlingsapparater, kan gi avvikende testresultater i forhold til de som utføres ved hjelp av manuell prosedyre. Det er hvert enkelt laboratoriums ansvar å stadfeste at deres automatiske prosedyre gir testresultater innenfor akseptable grenser. 5. En rekke faktorer påvirker analyseprestasjonene. Herunder inkluderes starttemperaturen til reagensene, lufttemperaturen, pipetteteknikkens nøyaktighet og reproduserbarhet, hvor grundig det er vasket og fjernet væske fra brønnen til ELISA-remsen, fotometeret som er brukt til å måle resultatene og inkubasjonstidenes varighet under analysen. Det er nødvendig med konsistens konsistens for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. 6. Det anbefales at man holder seg strengt innenfor rammene til protokollen. 7. Ufullstendig forsegling av glidelåsen til posen som inneholder mikrobrønnremsene og tørkemidlene vil resultere i degradasjon av antigen og dårlig presisjon. 8. Uakseptabelt lave sbsorbanser kan observeres etter to eller flere bruk fra én enkel flaske med HRP-konjugat over en tidsperiode. Det er viktig å følge alle anbefalte behandlingsprosedyrer for HRP-konjugatet for å forhindre at dette oppstår. 9. Kjemisk kontaminasjon av HRP-konjugatet kan forårsakes av ufullstendig rengjøring eller skylling av utstyr eller instrumenter. Avfall fra vanlige laboratoriekjemikalier slik som formalin, blekemiddel, etanol eller vaskemiddel vil forårsake degradasjon av HRP-konjugatet over tid. Skyll alt utstyret og alle instrumentene grundig etter bruk av kjemiske rengjørings- og desinfeksjonsmidler

3 Oppbevaringsbetingelser 1. Lagre alle reagensene i kitet ved 2-8 C. Ikke frys. Reagensene er stabile helt til de går ut på dato hvis de oppbevares og behandles på foreskriftsmessig vis. 2. Ubrukte antigen-dekkede mikrobrønnremser skal forsvarlig forsegles på ny i folieposen som inneholder tørkemidlene og oppbevares ved 2-8 C. 3. Fortynnet vaskebuffer er stabil i én uke ved 2-8 C. Innhenting av prøver Denne prosedyren skal utføres med en serumprøve. Tilsetting av azid eller andre konserveringsmidler til testprøvene kan påvirke resultatene. Mikrobielt kontaminerte, varmebehandlede prøver eller prøver som inneholder synlige partikler skal ikke brukes. Sterkt hemolysert eller lipemisk serum eller prøver skal unngås. Etter innhenting skal serumet skilles fra blodklumpen. CLSI (NCCLS) dokument H18-A3 anbefaler følgende oppbevaringsbetingelser for prøver: 1) Ikke oppbevar prøver i romtemperatur lenger enn i 8 timer. 2) Hvis analysen ikke fullføres innen 8 timer, kjøl prøven ned til 2-8 C. 3) Hvis analysen ikke fullføres innen 48 timer, eller ved forsendelse av prøven, frys den ned til -20 C eller lavere. Nedfryste prøver må blandes godt etter tining og før testing. Prosedyre Leverte materialer 1 h-ttg IgA ELISA-mikrotiter (12-1 x 8 brønner), med holder 1 1,2mL forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll 1 1,2mL forhåndsfortynnet h-ttg IgA ELISA lav positiv 1 1,2mL forhåndsfortynnet h-ttg IgA ELISA høy positiv 1 50mL HRP-prøvediluent 1 25mL HRP-vaskekonsentrat, 40x konsentrat 1 10mL HRP IgA-konjugat, (geit), anti-humant IgA 1 10mL TMB-kromogen 1 10mL HRP-stoppløsning, 0,334M svovelsyre Påkrevd tilleggsutstyr (ikke levert) Mikropipetter for å forsyne 5, 100, og 500µL Engangs mikropipettetips Testrør for pasientprøvefortynninger, 4mL volum Destillert eller deionisert vann 1L beholder for fortynnet HRP-vaskekonsentrat Mikrotiterplateleser som er i stand til å måle OD ved 450nm (og 620nm for dobbel bølgelengdeavlesninger). Metode Før du starter 1. Bring alle reagenser og prøver opp til romtemperatur (20-26 o C) og bland godt. 2. Fortynn HRP-vaskekonsentratet ut (1:40) ved å blande innholdet av HRP-vaskekonsentratflasken med 975mL destillert eller deionisert vann. Hvis hele platen ikke skal kjøres i denne perioden, kan du forberede en mindre mengde ved å blande 2,0mL av konsentratet med 78mL destillert eller deionisert vann for hver 16 brønner som skal brukes. Den fortynnede bufferen er stabil i én uke ved 2-8 o C. 3. Gjør klar en oppløsning (1:101) for hver pasientprøve ved å blande 5µL fra prøven med 500µL av HRP-prøvediluent. Fortynnede prøver må brukes innen 8 timer etter klargjøring. IKKE FORTYNN h-ttg IgA ELISA lav positiv, h-ttg IgA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll. 4. Bestemmelse av forekomst eller fravær av h-ttg IgA ved hjelp av arbitrære enheter krever to brønner for hver av de tre kontrollene og én eller to brønner for hver pasientprøve. Det anbefales at prøvene kjøres i duplikat. Analyseprosedyre 1. ALLE REAGENSER MÅ BRINGES TIL ROMTEMPERATUR (20-26 C) FØR DU BEGYNNER ANALYSEN. Plasser påkrevd antall av mikrobrønner/remser i holderen. Legg straks tilbake remser som du ikke skal bruke tilbake i posen med tørkemidler og forsegl forsvarlig for å minimalisere eksponering for vanndamp. 2. Tilsett 100µL av forhåndsfortynnet h-ttg IgA ELISA lav positiv, h-ttg IgA ELISA høy positiv, ELISA negativ kontroll og de fortynnede pasientprøvene til brønnene. Dekk brønnene og sørg for 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur på en vannrett overflate. Inkubasjonstiden begynner etter at siste prøve tilsettes. 3. Vasketrinn: Aspirer innholdet av hver brønn grundig. Tilsett µL av fortynnet HRPvaskebuffer til alle brønnene og deretter aspirer. Gjenta denne sekvensen to ganger til (totalt tre vasker). Inverter platen og bank på absorberende materiale for å fjerne resterende væske etter siste vask. Det er viktig å tømme hver brønn fullstendig etter hvert vasketrinn. Du opprettholder den samme sekvensen for aspirasjon som den som ble brukt for prøvetilsetning

4 4. Tilsett 100μL av HRP-IgA-konjugatet til hver brønn. Konjugatet skal fjernes fra flaskene under standard aseptiske forhold og gode laboratorieteknikker. Bare fjern den koblingsmengden fra flasken som er nødvendig for analysen. DU SKAL ALDRI RETURNERE UBRUKT KONJUGAT TIL FLASKEN FOR Å UNNGÅ POTENSIELL MIKROBIELL OG/ELLER KJEMISK KONTAMINERING. Som i trinn 2, sørg for 30 minutters inkubasjon av brønnene. 5. Vasketrinn: Gjenta trinn Tilsett 100µL av TMB-kromogenet til hver brønn og sørg for 30 minutters inkubasjon i mørke ved romtemperatur. 7. Tilsett 100µL av HRP-stoppløsningen til hver brønn. Du opprettholder den samme sekvensen og timing ved tilsetting av HRP-stoppløsning som den som ble brukt for TMB-kromogenet. Bank forsiktig på platen med en finger for å blande brønnene grundig. 8. Avles absorbans (OD) fra hver brønn ved 450nm innen én time etter å ha stoppet reaksjonen. Hvis du ønsker bikromatiske målinger, kan du bruke 620nm som referansebølgelengde. Kvalitetskontroll 1. h-ttg IgA ELISA lav positiv, h-ttg IgA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll skal kjøres med hvert oppsetti for å sikre at alle reagenser og prosedyrer fungerer som de skal. 2. Merk at da h-ttg IgA ELISA lav positiv, h-ttg IgA ELISA høy positiv og ELISA negativ kontroll er forhåndsfortynnet, kontrollerer de ikke for prosedyremessige metoder tilknyttet fortynning av prøver. 3. Tilleggskontroller kan utføres i henhold til veiledninger eller krav fra lokale, statlige og/eller kommunale myndigheter eller akkrediterte organisasjoner. Egnet tilleggskontrollsera kan forberedes ved å aliquotere innsamlede humane serumprøver og oppbevaring ved < -20 C. 4. Alle kriteriene oppgitt nedenfor må oppfylles for å betrakte testresultatene som gyldige. Hvis noen av disse kravene ikke oppfylles, skal testen betraktes som ugyldig og analysen må gjentas. a. Absorbansen av forhåndsfortynnet h-ttg IgA ELISA høy positiv må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet h-ttg IgA ELISA lav positiv, og denne må være høyere enn absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll. b. Forhåndsfortynnet h-ttg IgA ELISA høy positiv må ha en høyere absorbans enn 1,0, mens absorbansen til forhåndsfortynnet ELISA negativ kontroll ikke kan være over 0,2. c. Absorbansen til h-ttg IgA ELISA lav positiv må være mer enn doble av ELISA negativ kontroll eller over 0,25. d. ELISA negativ kontroll og h-ttg IgA ELISA høy positiv er ment for å kontrollere for substansiell reagensfeiling. h-ttg IgA ELISA høy positiv vil ikke sikre presisjon ved analysens cut-off. e. Bruker henvises til CLSI (NCCLS) dokument C24-A3 for videre veiledning for egnet kvalitetskontrollpraksis. Beregning av resultater OD-middelverdien for hvert sett av duplikater bestemmes først. Reaksjonen for hver prøve kan deretter beregnes ved å dele prøvens OD-middelverdi med OD-middelverdien for h-ttg IgA ELISA lav positiv. Resultatet multipliseres med antall tildelte h-ttg IgA ELISA lav positiv enheter som står oppgitt på etiketten. Prøve OD Prøveresultat = x h-ttg IgA ELISA lav positiv (enheter) h-ttg IgA ELISA lav positiv OD (enheter) Reaktiviteten er relatert til antistoffmengde fremstilt på ikke-lineært vis. Selv om økninger og minskinger av pasientens antistoffkonsentrasjoner vil gjenspeiles i form av tilsvarende stigning eller fall i reaktiviteten, er endringen ikke proporsjonal (dvs. en fordobling av antistoffkonsentrasjon vil ikke fordoble reaktiviteten). Hvis det er påkrevet med en nøyaktigere kvantifisering av pasientens antistoff, bør serielle fortynninger av pasientprøven kjøres og den siste fortynnningen som måles positiv i analysen, skal rapporteres som pasientens antistofftiter. Tolkning av resultater ELISA-analysen er meget følsom for teknikk og er i stand til å påvise selv små forskjeller i pasientpopulasjonen. Verdiene som vises nedenfor er bare foreslåtte verdier. Hvert laboratorium bør etablere eget normalområde basert på egne teknikker, kontroller, utstyr og pasientpopulasjoner i henhold til deres etablerte prosedyrer. Prøven kan da klassifiseres som negativ, svakt positiv, moderat positiv eller sterkt positiv i henhold til tabellen nedenfor. Enheter Negative <20 Svakt positiv Moderat til Sterkt positiv >30-4 -

5 1. Et positivt resultat indikerer forekomsten av h-ttg IgA-antistoffer og antyder muligheten for bestemte glutensensitive enteropatier slik som cøliaki og dermatitis herpetiformis. 2. Et negativt resultat indikerer ingen forekomst av h-ttg IgA-antistoff eller nivåer under analysens cut-off. 3. Det foreslås at resultatene som rapporteres av laboratoriet skal inneholde uttalelsen: Følgende resultater ble fremstilt med INOVA QUANTA Lite TM h-ttg IgA ELISA. h-ttg IgA-verdier fremstilt med forskjellige fabrikanters analysemetoder kan ikke brukes om hverandre. Størrelsen av rapportert IgA-nivåer kan ikke korreleres til et endepunktiter. Prosedyrebegrensninger 1. Forekomsten av immunkomplekser eller andre immunglobulinaggregater i pasientprøven kan forårsake et forhøyet nivå av ikke-spesifikk binding og gi feilaktige positive analyseresultater. 2. Et negativt h-ttg IgA-resultat hos en ubehandlet pasient utelukker ikke glutensensitiv enteropati. Resultatene kan ofte forklares ved selektiv IgA-mangel, en relativt hyppig resultat hos cøliakipasienter. INOVA tilbyr et h-ttg IgG-sett for å teste disse pasientene. (QUANTA Lite h- ttg IgG). 3. Resultatene til denne analysen bør brukes sammen med kliniske resultater og andre serologiske tester. 4. Prestasjonsegenskapene til analysen har ikke blitt etablert for annet prøvemateriale enn serum. Forventede verdier Evnen til QUANTA Lite TM h-ttg ELISA (humant vevstransglutaminase) IgA til å oppdage IgA vevstransglutaminase antistoffer ble evaluert ved sammenlikning med en annen test for påvisning av IgA ttg antistoff og ved å sammenligne resultater fra cliniske diagnoser fra to eksterne kliniske evalueringer og en intern studie. Normalområde Normalområdestudiet ble utført i forskningslaboratoriet ved INOVA Diagnostics. Totalt 185 prøver ble testet. Totalt 102 menn ble testet. Alder varierte fra 6-60 år med gjennomsnittsalder på 34. Totalt 83 kvinner ble testet i aldersgruppen fra 7-63 år med gjennomsnittsalder på 31. Når disse 185 prøvene ble testet med QUANTA Lite h-ttg IgA-settet, var bare én prøve (0,5%) positiv. Denne ene prøven ble registrert med 20 enheter, rett over grensen. Av andre enn denne ene svakt positive prøven, hadde den nest høyeste reaktive prøven en verdi på 11,5 enheter. Middelverdien for denne gruppen av normalprøver var 4,4 enheter. Relativ sensitivitet og spesifisitet For å bestemme sensitiviteten og spesifisiteten til analysen ble totalt 257 prøver testet av både QUANTA Lite h-ttg IgA og en annen kommersielt tilgjengelig test for ttg-antistoff. Resultatene er sammenfattet under: h-ttg * Relativ sensitivitet 92,7% marsvin Relativ spesifisitet 91,6% lever ttg - 17** 185 Relativ effektivitet 91,8% * To av disse var endomysium og gliadin IgA-negative. ** Flesteparten av disse var kjent eller mistenkt cøliakipasienter som ved tidligere testing hadde svake eller negative serologier. Klinisk sensitivitet og spesifisitet QUANTA Lite TM h-ttg IgA-antistoffsettet ble evaluert i en ekstern klinisk studie og i en intern klinisk studie. Følgende tabell oppsummerer resultatene både fra den kliniske eksterne og interne studien. Pasientgruppe No. No. Pos (%) Normalprøver 185 1* (0,5) Cøliaki (100) Cøliaki (barne-) (91) Cøliakere IgA-mangelfull 16 0 Ulcerøs tykktarmbetennelse 14 0 Crohns sykdom 6 1** (17) Pernisiøs anemi 6 0 Kronisk aktiv hepatitt 9 0 Forsk. bindevevsautoantistoff positive 55 0 * Denne ene prøven var svakt positiv med 20 enheter. ** Denne ene prøven var svakt positiv ved 23 enheter og var også svakt positiv ved 22 enheter ved bruk av marsvinlever-antigenet

6 Kryssreaksjon Totalt 90 pasienter med andre gastrointestinale problemer og pasienter med en rekke høytiter bindevevssykdomsassosierte autoantistoffer ble testet for å vurdere spesifisiteten til QUANTA Lite h- ttg IgA nærmere. Totalt 14 sera fra pasienter med ulcerøs tykktarmbetennelse, 6 med Crohns sykdom, 6 med pernisiøs anemi, 9 med kronisk aktiv hepatitt ble testet. En gruppe sera fra en samling av sera brukt til å produsere andre INOVA-autoantistoff ELISA-sett ble testet. Totalt 55 sera ble testet, inkludert 8 positive for SS-A, 6 positive for SS-B, 9 positive for Sm, 11 positive for RNP, 13 positive for Scl-70 og 8 positive for Jo-1. Av disse 90 prøvene var bare en prøve fra en pasient med Crohns sykdom positiv. Denne pasienten var bare svakt positiv ved 23 enheter for IgA h-ttg. Denne sammen prøven når testet på det marsvinleverbaserte ttg-settet viste seg også å være positiv ved 22 enheter. Ingen av de andre prøvene var over 8 enheter, bortsett fra denne ene, svakt positive prøven. Presisjon og reproduserbarhet Presisjonen og reproduserbarheten til analysen ble målt ved å kjøre seks duplikater hver av en sterkt positiv, svakt positiv og negative prøve i seks separate analyser. Gjennomsnittsreaksjonen til den sterkt positive prøven var 132,6 enheter, mens middelverdien for den svakt positive prøven var 25,0 enheter mens det betyr verdi for negativen var 13,4. Standardavviket og variasjonskoeffisienten for hver prøve oppsummeres nedenfor. Negative Sterkt positivsvakt positiv SD CV SD CV SD CV Samlet 1,05 7,8% 3,76 2,8% 0,66 2,6% Innen serien 0,65 4,8% 3,01 2,3% 0,69 2,8% Mellom serier 0,78 5,8% 3,21 2,4% 0,44 1,8% - 6 -

7 Referanser 1. Meuweisse GW. Diagnostic criteria in celiac disease. Acta Paediatr Scand 59: 461, Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, Shmerling DH, Visakorpi JK. Revised criteria for diagnosis of celiac disease: Report of working group of Euorpean Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood 65: , Chorzelski TP, Beutner EH, Zalewski TK, et al. editors. Serologic diagnosis of celiac disease. Boca Raton (FL): CRC Press; Chorzelski TP, Sulej J, Tcherzewska H, et al. IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and celiac disease. Ann NY Acad Sci 420: , Volta U, Molinar N, De Franchis R, et al. Correlation between IgA antiendomysial antibodies and subtotal villous atrophy in dermatitis herpetiformis. J Clin Gastroenterol 14: , Valdimarsson T, Franzen L, Grodzinsky E, Skogh T, Strom M. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science 41: 83-87, Unsworth FJ. Serologic diagnosis of gluten sensitive enteropathy. J Clin Path 49: , Volta U, Molinaro M, Fusconi M, Cassani F, Bianchi FB. IgA antiendomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases and Science 36: , Wilfang S, Knauss M, Stern M. IgA endomysiumantikorper. Montsschr Kinderkeilkd 140: , Muscart-Lemone F, Van den Broek J, Cadranel S, Colombel JF. Serologic aspects of celiac disease. Acta Gastro-Enterologica Belgica 55: , Grodzinsky E, Hed J, Skogh T. IgA antiendomysium antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy 49: , Sategna-Guidetti C, Pulitano R, Grosso S, Ferfoglia G. Serum IgA antiendomysium antibody titers as a marker of intestinal involvement and diet compliance in adult celiac sprue. J Clin Gastroenterol 17: , Catassi C. Screening of coeliac disease. In: Maki M, Collin P, Visakorpi JK. editors. Coeliac disease. Tampere (Finland): Coeliac Disease Study Group; p , Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: , Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al. Autoantibodies in coeliac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: , Sardy M, et al. Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of gluten-sensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, Sblattero D, et al. Human recombinant tissue transglutaminase ELISA : an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, Sugai E, et al. Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: , Lampasona V, et al. Tissue transglutaminase and combined screening for coeliac disease and type 1 diabetes-associated autoantibodies. Lancet 352: , Hansson T, et al. Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, Andersson AS, et al. Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Axiö-Frekricksson UB, et al. Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, Signorini M, et al. Human erythriocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 Fabrikkert av: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (Domestic) : Technical Service (International) : info@inovadx.com Autorisert representant i EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: NOR January 2010 Rev