PLATELIA CANDIDA Ag ER EN IMMUNENZYMATISK MIKROPLATEANALYSE AV SANDWICH-TYPEN TIL PÅVISNING AV CANDIDA MANNAN-ANTIGEN I SERUM.

Transkript

1 PLATELIA CANDIDA Ag 96 ANALYSER PLATELIA CANDIDA Ag ER EN IMMUNENZYMATISK MIKROPLATEANALYSE AV SANDWICH-TYPEN TIL PÅVISNING AV CANDIDA MANNAN-ANTIGEN I SERUM. 1 ANVENDELSESOMRÅDE Platelia Candida Ag er en immunenzymatisk mikroplateanalyse av sandwich-typen til påvisning av sirkulerende Candida mannan-antigen i serumprøver. 2 INDIKASJONER Platelia Candida Ag (kat.nr ) er en analyse som når den brukes i kombinasjon med Platelia Candida Ab/Ac/Ak (kat.nr ), muliggjør tidligere diagnostisering og en mer sensitiv diagnostisering av invasiv candidiasis som en del av en komplett diagnostisk tilnærming som omfatter både kliniske og mykologiske data og en evaluering av intrinsiske og iatrogene risikofaktorer 12. Denne kombinasjonen er et hjelpemiddel når avgjørelser om behandling skal tas, i tillegg til at den er en integrert del av et klinisk og laboratoriemessig pasientovervåkingssystem. 3 OPPSUMMERING OG FORKLARING Candida-infeksjoner er den hyppigste formen for nosokomiale soppinfeksjoner 2. Invasive infeksjoner er de alvorligste formene med en mortalitetsrate på % hos immunsupprimerte pasienter 10. Invasive Candida-infeksjoner er vanskelige å diagnostisere fordi de kliniske symptomene er lite spesifikke, og fordi dyrkningen har lav sensitivitet, til tross for de betydelige fremskrittene som nylig er gjort på dette området. Diagnostiseringen av invasiv candidiasis, som fører til at egnet behandling initieres, er vanligvis basert på en kombinasjon av kliniske og mykologiske evalueringer samt en evaluering av risikofaktorer 7. I lys av dette må diagnostiseringen av systemisk candidiasis alltid omfatte serologiske teknikker samt direkte mykologiske metoder. Påvisning av sirkulerende antigener i serum synes å bedre diagnostiseringen av Candida-infeksjon, spesielt hos immunsupprimerte pasienter. Mannan, et av flere Candida-antigener, er et polysakkarid som er ikke-kovalent bundet til gjærsoppens cellevegg, og utgjør mer enn 7 % av tørrvekten til C. albicans 3. Dette antigenet synes å være en av hovedmarkørene for invasiv candidiasis 6. 4 PROSEDYREPRINSIPP Platelia Candida Ag er en ettrinns immunenzymatisk mikroplateanalyse av sandwich-typen som muliggjør kvantitativ eller kvalitativ påvisning av sirkulerende mannan-antigen i humant serum. Analysen bruker det monoklonale antistoffet EBCA-1 fra rotte, som er rettet mot Candida α 1-5 oligomannosider, og som er blitt karakterisert i tidligere studier 1, 5, 11. Det monoklonale antistoffet brukes til å: Belegge brønnene på mikroplaten og binde mannan-antigenet. Påvise antigenet som er bundet til den sensibiliserte mikroplaten (konjugatreagens: peroksidasemerket monoklonalt antistoff). Serumprøvene varmebehandles med EDTA til stede for å skille immunkomplekser og utfelle serumproteiner som potensielt kan interferere med analysen. De behandlede serumprøvene og konjugatet tilsettes i brønnene som er belagt med monoklonalt antistoff, og inkuberes. Et monoklonalt antistoff mannan monoklonalt antistoff/ peroksidasekompleks dannes ved tilstedeværelse av mannan-antigen. Stripsene vaskes for å fjerne eventuelt ubundet materiale. Deretter tilsettes substratløsningen, som reagerer med kompleksene som er bundet til brønnene, og denne reaksjonen gir en blå farge. Enzymreaksjonen stoppes ved tilsetting av syre, og blåfargen endres til gul. 1

2 Absorbansen (optisk densitet OD) til prøvene, kontrollene og kalibreringspunktene bestemmes med et spektrofotometer innstilt på bølgelengden 450 og 620 nm. Analysen kan utføres på to måter: Kvantitativ modus: Ved å etablere en kalibreringskurve med 4 kalibreringspunkter: 2,0, 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml. Resultatene av testprøvene uttrykkes i ng mannan per ml serum. Kvalitativ modus: Kun kalibreringspunktene 0,25 ng/ml og 0,5 ng/ml brukes. En sammenligning av absorbansen (OD) til testprøvene og absorbansen til de to kalibreringspunktene gjør det mulig å uttrykke resultatet som negativt, intermedierende eller positivt. 5 REAGENSER Platelia Candida Ag: produktnr (96 analyser) Kitet skal oppbevares ved +2 8 C. La alle reagensene nå romtemperatur ( C) før bruk. Alle reagensene må tilbakeføres til +2 8 C rett etter bruk. Legg ubrukte strips/plater tilbake i posen og lukk den. Tørkemiddelet må ikke fjernes. Stripsene må brukes innen 5 uker etter åpning og lukking av posen. Etter fortynning kan vaskeløsningen oppbevares i 14 dager ved +2 8 C. Etter åpning er alle andre reagenser stabile frem til utløpsdatoen. Det er tilstrekkelig mengde reagenser til å utføre 96 analyser i maksimalt 6 batcher. Komponent Innhold Mengde/antall - 96 brønner (12 strips med 8 brønner hver) belagt med 1 plate/ monoklonalt EBCA-1 anti-mannan-antistoff. 12 x 8 brønner R1 Microwell Strip Plate R2 Concentrated Washing Solution (10X) R3 Negative Control Serum R4 Calibrator Serum R5 Positive Control Serum R6 Conjugate (bruksklar) - Tris-NaCl-buffer (ph 7,4). - 1 % Tween Konserveringsmiddel: 0,01 % timerosal. - Humant mannan-negativt kontrollserum brukes som negativ kontroll og fortynning for standardserumet når kalibreringspunktene 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml i den kvantitative analysen skal lages, og til tillaging av kalibratorserumet i den kvalitative analysen (se punkt 10 Prosedyre). - Negativt for anti-hiv-1-, anti-hiv-2-, anti-hcv-antistoffer og HBs-antigen. - Konserveringsmiddel: < 0,1 % natriumazid. - Humant serum som inneholder 2,0 ng/ml mannan brukes når kalibreringspunktene 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml i den kvantitative analysen skal lages, og til tillaging av kalibratorserumet i den kvalitative analysen (se punkt 10 Prosedyre). - Negativt for anti-hiv-1-, anti-hiv-2-, anti-hcv-antistoffer og HBs-antigen. - Konserveringsmiddel: < 0,1 % natriumazid. - Humant serum som inneholder mellom 0,5 og 1,5 ng mannan. - Negativt for anti-hiv-1-, anti-hiv-2-, anti-hcv-antistoffer og HBs-antigen. - Konserveringsmiddel: < 0,1 % natriumazid. - Monoklonalt anti-mannan-antistoff/peroksidasemerket - Konserveringsmiddel: 0,01 % timerosal. 1 x 100 ml 1 x 10 ml 2 x 2 ml 1 x 2 ml 1 x 8 ml R7 Serum Treatment Solution (bruksklar) R8 TMB Substrate Buffer (bruksklar) -EDTA-løsning, uten konserveringsmiddel. - Sitronsyre- og natriumacetatløsning, ph 5,2. - 0,009 % hydrogenperoksid. - 4 % dimetylsulfoksid (DMSO). 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 2

3 R9 Chromogen: TMB Solution (konsentrert) R10 Stopping Solution - 90 % dimetylsulfoksidløsning (DMSO) som inneholder 0,6 % tetrametylbenzidin (TMB)*. 1 x 1 ml - 1,5 N svovelsyre (H2SO4). 1 x 12 ml (bruksklar) Plate sealers - Klebende film for mikroplater. 1 x 4 filmer *Merk: TMB (tetrametylbenzidin) er et ikke-karsinogent og ikke-mutagent kromogen for peroksidase. 6 ADVARSLER FOR BRUKERNE 1. Kun til in vitro-diagnostikk. 2. Kun til profesjonell bruk. 3. Bruk av dette analysekitet med andre prøver enn humant serum anbefales ikke. 4. Det humane materialet som brukes til tillaging av reagensene, er testet og funnet å være negativt for anti-hiv-1-, anti-hiv-2- og anti-hcv-antistoffer samt HBs-antigen. Ingen metode kan imidlertid gi en absolutt garanti for fravær av smittefarlige stoffer, og alle reagenser og alle pasientprøver må derfor håndteres som potensielt smittefarlig materiale. Alle analysene må utføres i henhold til forsiktighetsreglene som gjelder for blodbårne patogener. 5. Bruk vernetøy og engangshansker ved håndtering av reagensene i kitet og pasientprøvene. Vask hendene grundig når analysen er utført. 6. Munnpipettering må ikke brukes. 7. Det må ikke røykes, spises eller drikkes på steder der prøver eller reagensene i kitet håndteres. 8. Unngå å søle prøver eller løsninger som inneholder prøver. 9. Søl av biologisk materiale som ikke inneholder syre, må tørkes grundig opp med et effektivt desinfiseringsmiddel. Desinfiseringsmidler som kan brukes, omfatter (men er ikke begrenset til) en løsning med 10 % blekemiddel (0,5 % natriumhypoklorittløsning), 70 % etanol eller 0,5 % Wescodyne. Søl av syreholdig materiale må tørkes tørt eller nøytraliseres med natriumbikarbonat og deretter vaskes opp med et av de kjemiske desinfiseringsmidlene. Materiale som er brukt til å tørke opp søl, må kasseres som biologisk farlig avfall. FORSIKTIG: Løsninger som inneholder blekemidler, må ikke plasseres i autoklav. 10. Alle prøver og alt materiale som er brukt til å utføre analysen, må kasseres som potensielt smittefarlig avfall. Alle gjeldende bestemmelser om kassering av avfall må overholdes. 11. Noen reagenser inneholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid kan danne blyog kobberazider i laboratoriets rørsystem. Disse azidene er eksplosjonsfarlige. For å unngå opphopning av azider i rørsystemet må det skylles med store mengder vann når azidholdige løsninger helles ut i vasken etter inaktivering. 12. FORSIKTIG: Svovelsyre (H 2 SO 4 ) 1,5 N og DMSO (dimetylsulfoksid) 90 % R36/38: Irriterer øynene og huden. S: : Oppbevares utilgjengelig for barn. Får man stoffet i øynene, skyll straks grundig med store mengder vann, og kontakt lege. Vann må ikke tilsettes. 13. Unngå at substratbuffer (TMB), kromogen (TMB-løsning) og stoppløsning kommer i kontakt med øynene, huden og slimhinnene (fare for toksisitet, irritasjon og forbrenninger). 14. Materialsikkerhetsdataarket (MSDS) kan fås på forespørsel. 7 FORSIKTIGHETSREGLER FOR BRUKERNE 1. FRYSTE SERUMPRØVER SOM ER OPPBEVART UNDER UKJENTE FORHOLD, KAN GI FALSKT POSITIVE RESULTATER PÅ GRUNN AV SOPP- OG/ELLER BAKTERIEKONTAMINERING. 2. Kitet eller reagensene i kitet må ikke brukes etter den angitte utløpsdatoen. 3. Med unntak av den konsentrerte vaskeløsningen (R2) og stoppløsningen (R10), må reagenser fra andre kit med andre lotnumre ikke blandes. 4. Alle reagensene må nå romtemperatur minst 15 minutter før bruk. 5. Reagensene må blandes grundig ved rekonstituering, og mikrobiologisk kontaminering må unngås. 6. Analysen må ikke utføres hvis det er reaktive damper (syrer, alkalier, aldehyder) eller støv i omgivelsene dette kan påvirke konjugatets enzymatiske aktivitet. 3

4 7. Bruk rene engangsplastbeholdere av polypropylen til tillaging av substrat-kromogenreaksjonsløsningen. Hvis materiale av glass må brukes, må det først vaskes i 1N hydrokloridsyre, skylles med destillert vann og tørkes. 8. Ved manuell pipettering av kontroller og prøver må individuelle pipettespisser brukes for å hindre kontaminering av prøvene. 9. For å sikre adekvat vasking av brønnene må anbefalt antall vaskesykluser brukes. Alle brønnene må fylles helt opp og deretter tømmes helt. Vasking må ikke utføres manuelt med klemflaske. 10. Mikroplaten må ikke tørke mellom slutten av vaskesyklusen og tilsetting av reagenser. 11. Ikke bruk samme beholder til konjugatet og substratløsningen. 12. Ikke la konjugatet eller substrat-kromogen-reaksjonsløsningen komme i kontakt med metall eller metallioner. 13. Unngå å eksponere kromogenet (TMB-løsning) eller substrat-kromogen-reaksjonsløsningen for sterkt lys under oppbevaring eller inkubering. Ikke la kromogenløsningene komme i kontakt med oksiderende stoffer. 14. Ikke la stoppløsningen komme i kontakt med oksiderende stoffer, metall eller metallioner. 15. Begrens løsningenes (serum, serumbehandlingsløsning, konjugat) og de åpne beholdernes (plater, rør, pipetter) eksponering for luft. 16. Ikke hell ubrukt konjugat tilbake i originalbeholderen. 17. Substrat-kromogen-reaksjonsløsningen må være fargeløs. Hvis løsningen er blåfarget etter fortynning, tyder dette på at reagenset er kontaminert, og det må ikke brukes. Kasser reagenset og lag et nytt. 8 TILLAGING OG OPPBEVARING AV REAGENSER Microwell-stripsplate (R1) Etter at posen med platen er åpnet, er Microwell-stripsene stabile i 5 uker når de oppbevares ved +2 8 C i den lukkede originalposen med det medfølgende tørkemiddelet. Vaskeløsning (R2) Vaskeløsningen tillages ved å tilsette 1 del konsentrert vaskeløsning i 9 deler sterilt avionisert eller destillert vann. Lag tilstrekkelig mengde vaskeløsning (80 ml for én strips: 8 ml R ml destillert vann). Vaskeløsningen kan oppbevares i 14 dager ved +2 8 C. Etter åpning er den konsentrerte vaskeløsningen (når den oppbevares ved C og når den ikke er kontaminert) stabil til utløpsdatoen som er angitt på etiketten. Substrat-kromogen-reaksjonsløsning (R8+R9) Lag substrat-kromogen-reaksjonsløsningen ved å tilsette 1 del konsentrert kromogen (R9) i 50 deler substratbuffer (R8). Lag 2 ml substrat-kromogen-reaksjonsløsning per strips: 40 µl R9 + 2 ml R8. Løsningen er stabil i 6 timer når den oppbevares mørkt ved romtemperatur ( C). Etter åpning er reagensene R8 og R9 (når de oppbevares ved +2 8 C og ikke er kontaminert) stabile til utløpsdatoen som er angitt på etiketten. Negativt kontrollserum (R3), kalibratorserum (R4), positivt kontrollserum (R5), konjugat (R6), serumbehandlingsløsning (R7) og stoppløsning (R10) Etter åpning er disse reagensene (når de oppbevares ved +2 8 C og ikke er kontaminert) stabile til utløpsdatoen som er angitt på etiketten. 9 PRØVETAKING Blodprøvene tas i henhold til standard laboratoriepraksis. Analysen utføres på serum. Serumprøver må ikke være kontaminert med soppsporer og/eller bakterier. Prøvene må transporteres og oppbevares i lukkede rør (ikke eksponert for luft). Prøvene kan oppbevares ved +2 8 C i 24 timer før analysering. Hvis prøvene skal oppbevares i lengre tid, må de oppbevares ved -70 C. Serumprøver kan fryses/tines maksimalt 3 ganger. Før analysering må prøver som har vært fryst og er tint, blandes grundig. Resultatene påvirkes ikke av prøver som inneholder 90 g/l albumin, 200 mg/l bilirubin, lipemiske prøver som inneholder tilsvarende 360 g/l triolein (triglycerid) eller hemolyserte prøver som inneholder 200 g/l hemoglobin. Serum må ikke dekomponeres. 4

5 10 PROSEDYRE Medfølgende materiale Se REAGENSER. Nødvendig materiale som ikke medfølger 1. Sterilt destillert eller avionisert vann til fortynning av konsentrert vaskeløsning. 2. Absorberende papir. 3. Engangshansker. 4. Vernebriller. 5. Natriumhypokloritt (blekemiddel) og natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter (justerbare eller ikke-justerbare) til oppmåling og pipettering av 50 µl, 100 µl, 300 µl og 1000 µl. 7. 1,5 ml mikrosentrifugerør av polypropylen med lufttette propper som tåler oppvarming til 120 C (varmeelement) eller 100 C (kokende vannbad): Rør med skrukork: 1,5 ml koniske rør, Bio-Rad kat.nr eller tilsvarende. ELLER Rør med trykkork: EZ Micro Test Tubes, 1,5 ml, Bio-Rad kat.nr eller tilsvarende. Korklås for mikrorør: VWR kat-nr eller tilsvarende. Disse låsene sørger for sikker lukking av rør med trykkork og hindrer at korkene åpnes under temperatur- og trykkforandringer. De gjør det også enkelt å løfte rørene ut av et varmeelement eller et kokende vannbad. 8. Benksentrifuge for 1,5 ml polypropylenrør som kan nå g. 9. Hvis det brukes varmeelement til behandling av serum: Varmeelement. Følgende varmeelementmodeller anbefales: - Modell med 1 element: Grant kat.nr. QBD1 (VWR kat.nr ) - Modell med 2 elementer: Grant kat.nr. QBD2 (VWR kat.nr ) Element for varmeelement: Begge varmeelementer (QBD1 og QBD2) må brukes med Grant element kat.nr. QB-E1 (VWR kat.nr ) Hvis det brukes kokene vannbad til behandling av serum: Rundt, flytende mikrosentrifugestativ for 1L beger. Kokende vannbad (100 C). 10. Blandeapparat (Vortex). 11. Mikroplateinkubator (37 ± 1 C). 12. Halvautomatisk eller automatisk mikroplatevasker. 13. Mikroplateavleser med 450 nm og 620 nm filtre. 14. Beholder for kontaminert avfall. Kommentarer om prosedyren Negative kontroller, positive kontroller og kalibreringspunkter må analyseres i hver serie for å validere analyseresultatene. Tillaging av kalibreringspunktene Kvantitativ modus: R3 Negativt kontrollserum For 1 serie For 6 serier (*) R4 R3 2 ng/ml Negativt kalibratorserum kontrollserum R4 2 ng/ml kalibratorserum 2 ng/ml µl µl 1 ng/ml 150 µl 150 µl 1000 µl 1000 µl 0,5 ng/ml 225 µl 75 µl 1500 µl 500 µl 0,25 ng/ml 262,5 µl 37,5 µl 1750 µl 250 µl (*) Et reagensvolum tilsvarende 6 serier kan tillages på forhånd: For hvert kalibreringspunkt: del opp i alikvoter på 300 µl og oppbevar ved -20 C. La reagensene nå romtemperatur (18 25 C) før bruk. Kvalitativ modus: Lag kalibreringspunktene 0,5 ng/ml (kalibratorserum) og 0,25 ng/ml som angitt i forrige tabell. 5

6 Behandling av serum Alt kontrollserum: Negativt (R3), positivt (R5) og kalibreringspunktene 2,0, 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml må behandles samtidig som testprøvene: 1. Pipetter 300 µl av hvert testserum, kontroll og kalibreringspunkt i individuelle 1,5 ml plastrør av polypropylen. 2. Tilsett 100 µl serumbehandlingsløsning (R7) i hvert rør. 3. Bland innholdet i rørene grundig ved kraftig blanding eller risting. Lukk rørene godt for å unngå at de åpner seg under oppvarming. Ikke stikk hull i proppen. 4. Varmeelement: Varm rørene i 6 minutter med varmeelement ved 120 C. Rørene må ikke plasseres i varmeelementet før den foreskrevne temperaturen er nådd. (*) ELLER Vannbad: Kokende vannbad: Varm opp rørene i 3 minutter ved 100 C. Rørene må ikke plasseres i vannbadet før den foreskrevne temperaturen er nådd. (*) 5. Ta rørene forsiktig ut av varmeelementet eller det kokende vannbadet, og plasser dem i en sentrifuge. Sentrifuger rørene ved x g i 10 minutter. Supernatanten brukes til påvisning av mannan-antigen. 6. Analyser supernatanten ved hjelp av følgende prosedyre. Etter at serumet er behandlet, må analysen utføres så snart som mulig. Hvis analysering av resultatene tilsier at ny analysering er nødvendig, må en annen alikvot av serum behandles for analysering. (*) Nøyaktig overholdelse av den foreskrevne temperaturen og den foreskrevne omløpstiden samt bruk av anbefalt materiale er av avgjørende betydning for om analysen lykkes eller ikke. Ikke stol på temperaturen som vises på apparaturen, men kontroller at temperaturen samsvarer med spesifikasjonene ved å bruke et kalibrert termometer som plasseres inne i et rør som inneholder mineralolje: 120 C må nås på innsiden av røret i et varmeelement og 100 C i et kokende vannbad. NB: - Alle serumprøver som behandles i henhold til denne prosedyren, kan brukes til å utføre Platelia Aspergillus EIA-analysen, siden prosedyrene for behandling av serum er identiske for de to analysene. - Serum (kontroller, kalibreringspunkter og testprøver) må ikke settes til oppbevaring etter behandling. EIA-prosedyre Den foreslåtte protokollen må følges nøye. Følg god laboratoriepraksis. 1. La reagensene nå romtemperatur (18 25 C) minst 15 minutter før bruk. 2. Tillag vaskeløsning, substrat-kromogen-reaksjonsløsning, negative og positive kontroller og kalibreringspunkter. 3. Lag et diagram for å identifisere testserum, kontroller og kalibreringspunkter i mikroplaten. Kvantitativ modus: Kontrollserum og kalibreringspunkter (0,25, 0,50, 1,0 og 2,0 ng/ml) kan plasseres i henhold til følgende skjema: - A1: Negativt kontrollserum (R3) - B1: Kalibreringspunktet 0,25 ng/ml - C1: Kalibreringspunktet 0,50 ng/ml - D1: Kalibreringspunktet 1,0 ng/ml - E1: Kalibreringspunktet (R4) 2,0 ng/ml - F1: Positivt kontrollserum (R5) - G1: Positivt kontrollserum (R5) Kvalitativ modus: Kontrollserum og kalibreringspunkter (0,5 ng/ml og 0,25 ng/ml) kan plasseres i henhold til følgende skjema: - A1: Negativt kontrollserum (R3) - B1: Kalibreringspunktet 0,25 ng/ml - C1: Kalibreringspunktet (kalibratorserum) 0,5 ng/ml - D1: Kalibreringspunktet (kalibratorserum) 0,5 ng/ml - E1: Positivt kontrollserum (R5) 6

7 4. Ta plateholderen og Microwell-stripsene (R1) ut av posen. Legg strips som ikke skal brukes, tilbake i posen (med tørkemiddel), og lukk den. 5. Bland innholdet i konjugatflasken (R6) ved å vende den opp ned før bruk. Tilsett 50 µl konjugat i hver brønn. Tilsett deretter 50 µl supernatant av behandlet serum i hver brønn, som angitt over. Ikke tilsett serumprøver i brønnene før konjugatet. 6. Dekk platen med den klebende filmen eller annet materiale for å hindre fordamping, og sørg for at hele overflaten er dekket og vanntett. 7. Inkuber mikroplaten i en tørr mikroplateinkubator i 90 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Fjern den klebende filmen. Aspirer innholdet i alle brønnene over i en avfallsbeholder (som inneholder natriumhypokloritt). Vask platen 5 ganger, bruk minst 370 µl vaskeløsning. Etter siste vask snus mikroplaten opp ned og bankes forsiktig mot absorberende papir for å fjerne gjenværende væske. 9. Tilsett 200 µl substrat-kromogen-reaksjonsløsning (R8 + R9) raskt i hver brønn, unngå at løsningen eksponeres for sterkt lys. 10. Inkuber mikroplaten mørkt ved romtemperatur (18 25 C) i 30 ± 5 minutter. Ikke bruk klebende film i dette inkubasjonstrinnet. 11. Tilsett 100 µl stoppløsning (R10) i hver brønn, bruk samme rekkefølge for tilsetting av substratkromogen-reaksjonsløsning. Bland godt. 12. Tørk godt av bunnen av hver plate. 13. Les av absorbansen (OD) for hver brønn ved 450 nm (referansefilter 620/630 nm). Mikroplater må avleses innen 30 minutter etter tilsetting av stoppløsning. 11 KVALITETSKONTROLL (VALIDITETSKRITERIER) Kvantitativ modus Bruk kontrollserum og kalibreringspunkter på hver mikroplate for hver analyse. Følgende kriterier må oppfylles for å validere analyseprosedyren: OD-verdi (optisk densitet/absorbans): 0,300 < OD for kalibreringspunktet 0,5 ng/ml < 1,100 Ratioer: OD (kalibreringspunktet 2,0 ng/ml) / OD (kalibreringspunktet 0,5 ng/ml) > 2,1 OD (kalibreringspunktet 1,0 ng/ml) / OD (kalibreringspunktet 0,5 ng/ml) > 1,25 OD (kalibreringspunktet 0,25 ng/ml) / OD (kalibreringspunktet 0,5 ng/ml) < 0,85 OD (R3) / OD (kalibreringspunktet 0,25 ng/ml) 0,80 Mannan-konsentrasjon: Konsentrasjon av R5 tilsvarende konsentrasjonen angitt på hetteglasset ± 20 %. Kvalitativ modus Kalkulering av cutoff-verdi (CO) Legg til OD-verdiene for hver brønn som inneholder kalibreringspunktet 0,5 ng/ml, og del på 2. Validitetskriterier 0,300 < CO < 1,100 OD R5 > CO OD R3 < 0,7 CO OD for kalibreringspunktet 0,25 ng/ml < 0,85 CO 12 TOLKNING AV RESULTATENE Kvantitativ modus Etablere standardkurven Standardkurven plottes med de 4 kalibreringspunktene 2,0, 1,0, 0,5 og 0,25 ng/ml som er laget av kalibratorserumet (R4). Positive (R5) og negative (R3) kontroller er ikke inkludert i kurven. For å oppnå maksimal presisjon plottes en sigmoid kurve med ekstrapolering ved å plotte mannan-konsentrasjonen i ng/ml på X-aksen (logaritmisk skala) og OD (optisk densitet/absorbans) på Y-aksen (lineær skala). Hvis plateavleseren ikke tillater en slik type fremstilling, plottes en kurve som kobler sammen de forskjellige kalibreringspunktene. 7

8 Bestemmelse av mannan-konsentrasjonen i testserum Kalibreringskurven kan brukes til å bestemme konsentrasjonen av mannan-antigen, uttrykt i ng/ml, for hver testprøve. Tolkning av resultatene Serum med en mannan-konsentrasjon som er klart under 0,25 ng/ml (C < 0,25), anses for å være "negativt" for mannan-antigen. Serum med en mannan-konsentrasjon på mellom 0,25 og 0,5 ng/ml (0,25 C < 0,5) anses for å være "intermedierende" for mannan-antigen. Serum med en mannan-konsentrasjon over eller lik 0,5 ng/ml (C 0,5) anses for å være "positivt" for mannan-antigen. Kalibreringspunktene som brukes til plotting av kalibreringskurven, gjør det ikke mulig nøyaktig å bestemme konsentrasjoner over 2,5 ng/ml. Analysen må gjentas etter fortynning av serumet til 1/5 i negativt serum (R3) for å oppnå en mer nøyaktig bestemmelse av konsentrasjonen i klart positivt serum. Merk: Platelia Candida Ag skal brukes som et hjelpemiddel ved diagnostisering av invasiv candidiasis. Positive resultater som oppnås med Platelia Candida Ag, må vurderes sammen med andre diagnostiske prosedyrer, for eksempel mikrobiologisk dyrkning, histologisk undersøkelse av biopsiprøver og radiografiske funn. For å øke analysens sensitivitet og bidra til tidlig påvisning anbefales regelmessig screening av høyrisikopasienter. Kvalitativ modus Tolkning av resultatene Prøvens OD < OD for kalibreringspunktet 0,25 ng/ml: serumet anses som "negativt" for mannan-antigen. OD for kalibreringspunktet 0,25 ng/ml prøvens OD < CO: serumet anses som "intermedierende" for mannan-antigen. Prøvens OD CO: serumet anses som "positivt" for mannan-antigen. Merk: Platelia Candida Ag skal brukes som et hjelpemiddel ved diagnostisering av invasiv candidiasis. Positive resultater som oppnås med Platelia Candida Ag, må vurderes sammen med andre diagnostiske prosedyrer, for eksempel mikrobiologisk dyrkning, histologisk undersøkelse av biopsiprøver og radiografiske funn. For å øke analysens sensitivitet og bidra til tidlig påvisning anbefales regelmessig screening av høyrisikopasienter. NB: For å bestemme intensiteten til positive resultater er det mulig å kalkulere en indeks (I): I= OD for positivt serum / CO Denne indeksen gjør det mulig å uttrykke resultatene i semikvantitativ modus. 13 BEGRENSNINGER VED PROSEDYREN 1. Et negativt resultat utelukker ikke diagnosen invasiv candidiasis. Dette skyldes den svært lave konsentrasjonen og raske elimineringen av mannan under en infeksjon. 2. Et negativt mannan-antigen-resultat må også tolkes sammen med resultatene av anti-mannanantistoffanalyser: Selv ved invasiv candidiasis er antigenet vanskeligere å påvise hos pasienter som har testet positivt for anti-mannan-antistoffer (se punkt 14 Spesifikke ytelsesegenskaper). 3. Påvisningen av mannan-antigen i serum er relatert til hvor ofte pasienten testes 4. For å øke analysens sensitivitet og bidra til tidlig påvisning anbefales regelmessig overvåkning av høyrisikopasienter og screening med tanke på anti-mannan-antistoffer. 4. Platelia Candida Ag-prosedyren og retningslinjene for tolkning av resultatene må overholdes ved analysering av prøver for mannan-antigen. Den som bruker kitet, bør lese pakningsvedlegget nøye før analysering. Analyseprosedyren må spesielt følges nøye når det gjelder pipettering av prøver og reagenser, vasking av plate og inkubering. 5. Hvis ikke prøver eller reagenser tilsettes i henhold til prosedyren, kan det føre til falskt negative resultater. Gjentatt analysering av tilleggsprøver må vurderes når det er klinisk mistanke om invasiv candidiasis eller prosedyrefeil. 8

9 6. Kontaminering av negative pasientprøvebrønner med positive kontroll-/pasientprøvebrønner er mulig hvis innholdet i en brønn søles over i en annen på grunn av uvøren håndtering av mikroplaten eller dårlig pipetteringsteknikk under tilsetting av reagenser. 7. Det er rapportert om kryssreaksjon hos pasienter som fikk en infusjon med visse batcher av plasmautvidere med hydroksyetylstivelse (for eksempel Hesteril 6 %), som brukes til behandling av sirkulasjonssvikt: Hypovolemi, hemorragisk sjokk, septisk sjokk. 14 SPESIFIKKE YTELSESEGENSKAPER 14.1 Kvantitativ modus A Studier av reproduserbarhet Intraanalysevariasjon: Fire serumprøver (en negativ, en intermedierende på 0,48 ng/ml og to positive med konsentrasjoner på 0,69 ng/ml og 1,39 ng/ml) ble analysert i 30 replikater. Variasjonskoeffisientene var henholdsvis 3,1 %, 6,9 %, 9,1 % og 7,0 %. Interanalysevariasjon: Åtte negative og fire positive serumprøver ble analysert på fem serier som ble utført i løpet av fem uker. Variasjonskoeffisientene var < 20 % for konsentrasjonene av positivt serum og < 13 % for de med en absorbans (OD) tilhørende negativt serum. B Klinisk testing SPESIFISITET Spesifisitetsresultatene er oppsummert i følgende tabell: Konsentrasjon (ng/ml) Pasientkategori Antall pasienter C 0,5 C < 0,25 0,25 C < 0,5 (ant. serumprøver) Ikke hospitalisert 184 (184) 183 (99,5 %) 1 (0,5 %) Hospitalisert, 151 (200) 140 (92,8 %) 7 (4,6 %) 4 (2,6 %) ikke kolonisert, med: - Crohns sykdom 52 (52) 49 (98,1 %) 3 (1,9 %) - Ulcerøs kolitt 43 (43) 41 (95,4 %) 1 (2,3 %) 1 (2,3 %) - Aspergillose 26 (35) 23 (88,5 %) 1 (3,8 %) 2 (7,7 %) - Pneumocystose 4 (4) 4 (100 %) - Kryptokokkose 13 (13) 12 (92,3 %) 1 (7,7 %) Hospitalisert, kolonisert med Candida: 41 (160) 35 (85,3 %) 4 (9,8 %) 2 (4,9 %) SENSITIVITET Klinisk testing for å evaluere sensitiviteten til Platelia Candida Ag er utført på tre universitetssykehus i Frankrike. Studien ble utført retrospektivt, og det ble brukt totalt 366 serumprøver fra 106 pasienter på forskjellige sykehusavdelinger: Kirurgiske og hematologiske avdelinger, intensivavdelinger, brannskadeavdelinger osv. Candida-gjærsopp ble isolert fra blodkulturer eller invasive prøver fra disse pasientene 8, 9. I denne pasientpopulasjonen hadde Platelia Candida Ag en total sensitivitet på 51,5 % (unntatt serum med en konsentrasjon av mannan-antigen på mellom 0,25 og 0,5 ng/ml, som anses for å være intermedierende med tanke på tilstedeværelse av mannan-antigen: 6,6 % av pasientene). 9

10 Avhengig av de isolerte Candida-artene varierer sensitiviteten som vist i tabellen nedenfor: Antall Sensitivitet pasienter Isolerte C 0,5 C 0,5 og 0,25 C < 0,5 (ant. Candida-arter serumprøv er) C. tropicalis 10 (72) 70,0 % 70,0 % C. glabrata 12 (31) 58,3 % 58,3 % C. albicans 64 (208) 52,5 % 60,3 % C. kefyr 2 (5) 50,0 % 50,0 % C. parapsilosis 10 (29) 37,5 % 57,5 % C. krusei 8 (21) 20,0 % 20,0 % Sensitiviteten avhenger av antall prøver og hvor ofte prøvene tas 13. Disse kliniske studiene viste også verdien av å kombinere påvisningen av mannan-antigen med Platelia Candida Ag og anti-mannan-antistoffer med Platelia Candida Ab/Ac/Ak. Pasientene kan klassifiseres i 2 signifikant forskjellige populasjoner (Kji-kvadrattest, p < 0,0005), som illustreres av resultatene i følgende tabell: Pasienter som er negative for anti-mannan-antistoff: Sensitiviteten til Platelia Candida Ag er 78,8 % ved tilstedeværelse av C. albicans-infeksjoner og 66,6 % for kombinerte Candida-arter. Pasienter som er positive for anti-mannan-antistoff: Mannan-antigen er vanskeligere å påvise. Infiserende arter (ant. pasienter) Kombinerte Candidaarter (106) C. albicans (64) Sensitivitet for Platelia Candida Ag Anti-mannan-antistoffnegative pasienter Anti-mannan-antistoffpositive pasienter Alle pasienter 66,6 % 17,5 % 51,5 % 78,8 % 16,1 % 52,5 % Tolkningen av Platelia Candida Ag-analysen må derfor inkludere informasjon om pasientens immunstatus overfor Candida mannan. Den kombinerte serologiske påvisningen av mannan-antigen og anti-mannan-antistoffer viser en sensitivitet på 84,8 % (unntatt de 6,6 % av pasientene med en intermedierende konsentrasjon av mannan-antigen). Noen pasienter viser imidlertid positiv respons på de to markørene på forskjellige tidspunkt i samme infeksjonsepisode. Infeksjonens prognose kan være koblet til balansen mellom mannanemia og antimannan-antistoffrespons Kvalitativ modus A Studier av reproduserbarhet Intraanalysevariasjon: Fire serumprøver (en negativ, en intermedierende på 0,95 ng/ml og to positive med konsentrasjoner på 1,24 ng/ml og 2,00 ng/ml) ble analysert i 30 replikater. Variasjonskoeffisientprosenten (%CV) var 3,1 %, 7,2 %, 5,9 % og 5,9 %. Interanalysevariasjon: Ti positive serumprøver og fire intermedierende ble analysert på seks serier. Variasjonskoeffisientprosenten (%CV) var < 15 % for det positive og intermedierende serumet. B Klinisk testing SPESIFISITET SENSITIVITET Konsentrasjonene 0,5 ng/ml eller < 0,25 ng/ml som oppnås i serum i kvantitativ modus, tilsvarer henholdsvis positivt og negativt serum i kvalitativ modus, og analysens ytelsesegenskaper i kvalitativ modus er derfor de samme som de som beskrives under Kvantitativ modus. 10

11 15 PRODUSENTENS KVALITETSKONTROLL Alle tilvirkede reagenser er tilvirket i henhold til vårt kvalitetssystem, som starter fra mottak av råmateriale til den endelige markedsføringen av produktet. Hver lot gjennomgår kvalitetskontrollvurderinger og sendes kun ut på markedet etter at de har oppfylt forhåndsdefinerte akseptkriterier. Dokumentasjonen om tilvirkning og kontroll av hver enkelt lot, oppbevares hos Bio-Rad. 16 REFERANSER 1. FAILLE, C., D. W. MACKENZIE, J. C. MICHALSKI, and D. POULAIN Evaluation of an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed from Candida albicans oligomannosides to define the specificity of anti- mannan antibodies. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: p FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: p FUKAZAWA, Y Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: p HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: p JACQUINOT, P. M., Y. PLANCKE, B. SENDID, G. STRECKER, and D. POULAIN Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species. FEMS Microbiol. Lett. 169: p PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS Non-Culture-Based Diagnostics, p In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 7. RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: p SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D. POULAIN Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: p TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI Deep Candida infections in the neutropenic and non-neutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: p TRINEL, P. A., C. FAILLE, P. M. JACQUINOT, J. C. CAILLIEZ, and D. POULAIN Mapping of Candida albicans oligomannosidic epitopes by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 60: p VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and J. PONTON Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: p YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: p

12

13

14 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette Frankrike Tlf.: +33 (0) /2008 Faks: +33 (0)