Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2

Transkript

1 Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 1 plate plater KOMBINERT SCREENINGKITT FOR ANTI-HCV ANTISTOFFER OG VIRUSANTIGEN FOR HEPATITT C VIRUS I SERUM ELLER HUMANT PLASMA MED EN ENZYM IMMUNOASSAYTEKNIKK /09

2 INNHOLD 1. TILTENKT BRUK SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN PROSEDYREPRINSIPP REAGENSER ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER PRØVER PROSEDYRE TESTBEGRENSNINGER YTELSESEGENSKAPER REFERANSER [NO]

3 1. TILTENKT BRUK Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 er en kvalitativ enzym immunoassay for påvisning av infeksjon av hepatitt C virus (HCV) basert på påvisning av anti-hcv-antistoffer og kapsidantigen i serum eller humant plasma. Denne hepatitt C screeningtesten kan brukes av diagnostiske laboratorier og blodbanker. 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN Hepatitt C virus (HCV) er et innpakket RNA positiv-sens virus (9,5 kb) som tilhører Flaviviridae-familien, av hvilken seks hovedgenotyper ble identifisert. HCV kjennetegnes ved å være hovedårsaken til non-a og non- B virushepatitt. HCV-infeksjon kjennetegnes av en akutt og kronisk form som kan føre til cirrhosis og hepatocellulært karsinom. Serologisk påvisning av HCV-infeksjon kan gjøres ved blodanalyser ved å screene for HCV-antigener og/eller antistoffer og/eller RNA. Sammenlignet med en test for å screene for anti-hcv antistoffer alene, kan bruk av en kombinert screeningtest for både anti-hcv-antistoffer og HCV kapsidantigen redusere den serologiske vindusperioden og bedre påvisning av infeksjonen. 3. PROSEDYREPRINSIPP Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 er basert på bruk av fast fase fremstilt med rensede antigener: to rekombinante proteiner fra den ikke-strukturelle regionen (NS3 og NS4) og et peptid fra den strukturelle regionen (kapsid) av hepatitt C virus, og et monoklonalt antistoff mot hepatitt C kapsidet. Væskefasen omfatter to konjugater. Det først konjugatet (R6) består av et biotinylert monoklonalt musantistoff mot hepatitt C kapsidet. Dette monoklonale antistoffet reagerer ikke mot kapsidpeptidet som brukes i den faste fasen. Det andre konjugatet (R7) er en blanding av peroksidasemerkede mus anti-humane IgG antistoffer og peroksidasemerket streptavidin. Analyseprosedyren inkluderer følgende reaksjonstrinn: 1) Konjugatet 1 og prøver som skal testes og kontrollserum blir fordelt i mikroplatenes brønner. Hvis antistoffer mot HCV finnes, vil de bindes til antigenene som er festet på den faste fasen. Hvis hepatitt C kapsidantigen finnes, vil dette antigenet bindes av de monoklonale antistoffene belagt på den faste fasen og de biotinylerte monoklonale antistoffene mot hepatitt C kapsidantigen (konjugat 1). 2) Etter inkubasjon ved 37 C i 90 minutter og et vasketrinn, tilsettes konjugat 2 som inneholder peroksidasemerket anti-humane IgG antistoffer og peroksidasemerket streptavidin til hver av mikroplatens brønner. Hvis humant IgG finnes, og har reagert med den faste fasen, bindes det antihumane IgG konjugatet til de humane antistoffene. Det konjugerte peroksidase/streptavidin bindes til biotinet på konjugat 1 hvis et HCV-kapsid antigen finnes i prøven. 3) Etter 30 minutters inkubasjon ved 37 C, fjernes det ubundne enzymatiske konjugatet ved vasketrinn og nærværet av antigen-antistoff-peroksidasekomplekser påvises ved å tilsette substratet. 4) Etter 30 minutters inkubasjon ved laboratorietemperatur (18-30 C) og straks reaksjonen er stoppet, tas spektrofotometrisk avlesning ved 450/ nm. Den målte absorbansen for en prøve gir påvisning av nærværet eller fraværet av HCV antistoffer og/eller kapsidantigener av hepatitt C i prøven. Fargeintensiteten er proporsjonal med mengden HCV-antistoffer og/eller hepatitt C kapsidantigen bundet på den faste fasen. 3 [NO]

4 4. REAGENSER 4.1. Beskrivelse Identifikasjon på etikett Beskrivelse Presentasjon Klargjøring Presentasjon Klargjøring R1 MICROPLATE Mikroplate 12 strimler med 8 brønner på hver, belagt med monoklonalt antikapsidantistoff av HCV, rensede rekombinante hepatitt C antigener (NS3, NS4) og et HCV kapsidpeptid. Spesifikt ID nummer = 93 1 plate 5 plater R2 CONCENTRATED WASHING SOLUTION (20X) Konsentrert vaskeløsning (20X) Tris NaCl buffer ph 7,4 Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,04 %) 70 ml Skal fortynnes 235 ml Skal fortynnes R3 NEGATIVE CONTROL Negativ kontroll Tris HCI buffer som inneholder BSA (bovint serumalbumin); Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,1 %) 1 ml 1 ml R4 POSITIVE CONTROL Positiv kontroll Humant serum med antistoffer mot HCV, negativ for HBs antigen og for anti HIV-1 og anti HIV-2 antistoffer fortynnet i en Tris HCI buffer med BSA, og fotokjemisk inaktivert. Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,1 %) 1,5 ml 3 ml R5a ANTIGEN POSITIVE CONTROL Antigenpositiv kontroll Syntetisk antigenpositiv kontroll som inneholder et lyofilisert kapsidpeptid. q.s. ad 1 ml Skal rekonstitueres q.s. ad 1 ml Skal rekonstitueres R5b ANTIGEN DILUENT Diluent for R5a Destillert vann med et konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,5 %) 1 ml Skal rekonstitueres 1 ml Skal rekonstitueres R6 CONJUGATE 1 Konjugat 1 Mus biotinilerte monoklonale antistoffer mot kapsid HCV-antigen. Purpur farge Konserveringsmiddel: Natriumazid (< 0,1 %), Cosmocil CQ (0,025 %) 15 ml 2 flasker 2 x 30 ml R7 CONJUGATE 2 Konjugat 2 Museantistoffer rettet mot human IgG/peroksidase og streptavidin/peroksidase. Grønn farge. Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,5 %) 15 ml 2 flasker 2 x 30 ml R8 SUBSTRATE BUFFER Substrat Sitronsyre og natriumacetatløsning, ph 4,0, med H 2 O 2 (0,015 %) og dimetylsulfoksid (DMSO) 4 % 60 ml Skal rekonstitueres 2 flasker 2 x 60 ml Skal rekonstitueres 4 [NO]

5 R9 CHROMOGEN: TMB SOLUTION (11X) Kromogen: TMB-løsning Løsning med 3,3, 5,5 tetrametylbenzidin (TMB) 5 ml Skal fortynnes 2 flasker 2 x 5 ml Skal fortynnes R10 STOPPING SOLUTION Stoppløsning Svovelsyreløsning (H 2 SO 4 1N) 28 ml 3 flasker 3 x 28 ml 4.2. Betingelser for oppbevaring og håndtering Kittet må oppbevares ved +2-8 C. Hver artikkel i kitt som er oppbevart ved +2-8 C kan brukes til utløpsdatoen som er trykket på emballasjen (dersom ikke annet er indikert). Etter åpning og hvis ikke kontaminert, kan R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 og R10 reagenser oppbevart ved 2-8 C brukes til utløpsdatoen som er vist på etiketten. Identifikasjon R1 R2 R5a + R5b R8 + R9 Oppbevaring Etter at den vakuumforseglede posen er åpnet, kan mikrobrønnstrimlene oppbevart ved +2-8 C brukes i 1 måned i den omhyggelig lukkede originale posen med tape. Den fortynnede vaskeløsningen kan oppbevares ved C i 2 uker. Den konsentrete vaskeløsningen (R2) kan oppbevares ved C. Etter rekonstituering kan antigenpositiv kontroll (R5) arbeidsløsning oppbevares i 1 måned ved +2-8 C og 2 måneder ved -20 C (opp til 5 fryse/tinesykluser etter frysing ved -20 C). Etter rekonstitusjon kan reagensene oppbevart i mørke brukes i 6 timer ved romtemperatur (18-30 C). 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER For in vitro diagnostisk bruk av helsepersonell Helse og sikkerhetsforanstaltninger Dette testkittet må kun bli brukt av kvalifisert personell opplært i laboratorieprosedyrer og kjent med deres potensielle farer. Bruk egnede beskyttelsesklær, hansker, øye/ansiktsmaske og håndter egnet i overensstemmelse med god laboratoriepraksis. Testkittet inneholder humane blodkomponenter. Humant kildemateriale som er brukt i tillagingen av R4-reagens (Positiv kontroll) har blitt testet og funnet ikke-reaktivt for hepatitt B overflateantigen (HBs Ag) og antistoffer mot humant immunsviktvirus (HIV-1 og HIV-2 Ab) og positiv for anti-hcvantistoffer. Positiv kontroll R4 er inaktivert ved varming. Ingen kjent testmetode kan gi fullstendig forsikring om at smittsomme midler ikke er tilstede. Derfor må alle humane blodderivater, reagenser og humane prøver håndteres som om de kan overføre smittsom sykdom, ved å følge anbefalte universelle foranstaltninger for blodoverførte patogener som definert av lokale, regionale eller nasjonale retningslinjer Biologisk søl: Humant kildemateriale må behandles som potensielt smittsomt. Søl som ikke inneholder syre må umiddelbart dekontamineres, inkludert det tilsølte området, materialer og alle forurensede overflater eller utstyr og med egnet kjemisk desinfiseringsmiddel som er effektivt mot den potensielle biologiske faren fra prøvene det gjelder (vanligvis en 1:10 fortynning av blekemiddel, % etanol eller isopropanol, en jodofor slik som 0,5 % Wescodyne Plus, osv) og tørket tørt. Søl som inneholder syre må absorberes tilstrekkelig (tørket pop) eller nøytraliseres, området skyllet med vann og tørket tørt. Materialer anvendt til å absorbere sølet kan kreve avhending som farlig biologisk avfall. Området må deretter dekontamineres med et kjemisk desinfiseringsmiddel. MERK: Ikke plasser løsninger som inneholder blekemiddel i autoklaven! 5 [NO]

6 Kast alle prøver og materialer som er brukt til å utføre testen som om de inneholder et smittsomt middel. Laboratorieavfall, kjemisk eller biologisk farlig avfall må håndteres og avhendes i overensstemmelse med alle lokale, regionale og nasjonale retningslinjer. For fare- og forholdsregelsanbefalinger relatert til alle kjemiske komponenter i dette testkittet, se piktogram(mer) angitt på etikettene og informasjon tilføyd på slutten av bruksanvisningen. Sikkerhetsdatabladet er tilgjengelig på Forholdsregler som gjelder prosedyren Fremstilling Resultatenes pålitelighet avhenger av korrekt implementering av følgende gode laboratoriepraksiser: Ikke bruk utløpte reagenser. Ikke bland eller foren reagenser fra forskjellige lotter i en analysering. Vent 30 minutter før bruk for at reagensene skal stabiliseres ved romtemperatur (18-30 C). Analysens navn, samt et spesifikt identifikasjonsnummer for analysen, er skrevet på rammen til hver mikroplate. Dette spesifikke identifikasjonsnummeret er også angitt på hver strimmel. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2: Spesifikt ID nummer = 93 Verifiser det spesifikke identifikasjonsnummeret før bruk. Hvis identifikasjonsnummeret mangler, eller er forskjellig fra det angitte nummer tilsvarende analysen som skal testes, må ikke strimmelen brukes. MERK: For vaskeløsning (R2, etikettidentifikasjon: 20X farget grønn), peroksidasesubstratbuffer (R8, etikettidentifikasjon: TMB-buffer, farget blå), kromogen (R9, etikettidentifikasjon: TMB 11X, farget purpur) og stoppløsning (R10, etikettidentifikasjon: 1N farget rød), er det mulig å bruke andre lotter enn de som finnes i kittet, gitt at samme lot er brukt innen en gitt analysering. Disse reagensene kan brukes sammen med noen andre produkter fra vårt firma. Kontakt vår tekniske service for detaljert informasjon. Rekonstituer reagensene forsiktig for å unngå kontaminasjon. Bruk glass som er grundig vasket og renset med deionisert vann eller foretrukket, engangsartikler. Ikke la mikroplaten tørke mellom slutten av vaskingen og reagensfordelingen. Enzymreaksjonen er svært sensitiv for metallioner. La derfor aldri noen metallelementer komme i kontakt med de forskjellige konjugatene eller substratløsningene. Utviklingsløsningen (substratbuffer + kromogen) må bli farget rosa. Forandringen av denne rosa fargen i løpet av noen får minutter etter rekonstitusjon indikerer at reagenset ikke kan brukes og må byttes ut. Fremstilling av utviklingsløsningen kan utføres i en ren engangs plastboks eller glassbeholder som først har blitt forvasket med 1N HCl og renset grundig med destillert vann og tørket. Dette reagenset må oppbevares i mørke. Bruk aldri samme beholder til å fordele konjugat og utviklingsløning Behandling Ikke endre analyseprosedyren. Ikke utfør analysen i nærværet av reaktive damper (syre, alkalie, aldehyddamper) eller støv som kan endre den enzymatiske aktiviteten for konjugatet. Bruk en ny fordelingsspiss for hver prøve. Brønnvasking er et kritisk trinn i denne prosedyren: Følg anbefalt antall vaskesykluser og sørg for at alle brønner er fullstendig fylt og så fullstendig tømt. Feil vasking kan føre til feil resultater. Følg omhyggelig de beskrevne vaskeprosedyrene for å oppnå maksimal testytelse. Med noen instrumenter kan det være nødvendig å optimalisere vaskeprosedyren (øke antall sykluser vasketrinn og/eller volum av vaskebuffer for hver syklus) for å oppnå et akseptabelt nivå av ODbakgrunn (optisk tetthet) for den negative prøven. Kontakt vårt firma for tilpasninger og spesialprosedyrer. 6. PRØVER Ta en blodprøve i henhold til aktuell praksis. Testen må utføres på ufortynnet serum eller plasma (tatt på EDTA, natriumcitrat eller ACD). Det anbefales ikke å bruke prøve fra rør som inneholder litiumheparin. Et lavere signal ble observert på prøvene som testet positive for HCV-antigen. Prøver med aggregater må klares ved sentrifugering før analysen. Svevende fibrinpartikler eller aggregater kan gi falsk positive resultater. 6 [NO]

7 Prøvene oppbevares ved +2-8 C hvis analysen utføres innen 7 dager eller de kan være dypfryst ved -20 C. Ikke gjenta mer enn 3 fryse/tinesykluser. Prøvene må tines ved romtemperatur (18-30 C). Det anbefales å homogenisere dem ved å vende dem for bruk. Prøver med opp til 120 g/l albumin, 50 µg/l biotin og 200 mg/l bilirubin, prøver med opp til 33 g/l triolein og prøver med opp til 2 g/l hemoglobin påvirker ikke resultatene. Det er imidlertid ikke anbefalt å bruke kontaminerte hyperlipemiske og hyperhemolyserte prøver. Det anbefales ikke å varme prøvene fordi dette kan redusere påvisningen av HCV-antigenet betydelig. Hvis prøvene må sendes, må de pakkes i henhold til retningslinjene som gjelder angående transport av etiologiske agenser og foretrukket transportert frosset. 7. PROSEDYRE 7.1. Nødvendige materialer som ikke er inkludert Destillert vann. Natriumhypoklorit (husholdningsblekemiddel) og natriumbikarbonat. Absorberende papir. Klebende film. Engangshansker. Vernebriller. Engangsglass. Automatisk eller semiautomatisk, justerbare eller forhåndsinnstilte pipetter eller multipipetter for å måle og dispensere 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl og 1 ml. Graderte sylindre på 10 ml, 200 ml og 1000 ml. Vortexmikser. Automatisk, semiautomatisk eller manuelt mikroplatevaskesystem. Vannbad eller lignende mikroplateinkubator, termostatisk innstilt på 37 C ± 1 C (*). Beholder for biologisk farlig avfall. Mikroplateleser utstyrt med 450, 490 nm og nm filtere (*). (*) Kontakt oss for detaljert informasjon om anbefalt utstyr fra vår tekniske avdeling Reagensfremstilling Reagenser klar for bruk Reagens 1 (R1): Mikroplate Hver rammestøtte som inneholder 12 strimler er pakket i en forseglet pose. Åpne posen med en saks eller en skalpell 0,5 til 1 cm over forseglingen. Åpne posen og ta ut rammen. Legg de ubrukte strimlene tilbake i posen. Lukk posen godt med teip og legg den tilbake til oppbevaring ved +2-8 C. Reagens 6 (R6): Konjugat 1 Homogeniser ved å vende før bruk. Reagens 7 (R7): Konjugat 2 Homogeniser ved å vende før bruk Reagenser som skal rekonstitueres Reagens 2 (R2): Konsentrert vaskeløsning (20X) Fortynn 1:20 i destillert vann for oppnå bruksklar vaskeløsning. Fremstill 800 ml for en plate med 12 strimler. Reagens 8 (R8) + Reagens 9 (R9): Enzymutviklingsløsning Fortynn 1:11 kromogenet (R9) i substratbufferen (f.eks. 1 ml reagens R ml R8 reagens) gitt at 10 ml er nødvendig og egnet for å behandle 12 strimler. Homogeniser. Reagens 5a (R5a) + Reagens 5b (R5b): Arbeidsløsning (R5). Hell innholdet for R5b-diluent i den lyofiliserte Ag R5 flasken. Lukk flasken og la den stå i 10 minutter ved romtemperatur (18-30 C) med risting og vending en gang i blant for å lette oppløsningen Analyseprosedyre Følg prosedyren nøye. Bruk negative og positive kontrollsera for hver analyse for å validere analysekvaliteten. Følg følgende god labortatoriepraksis: 7 [NO]

8 1) Etabler nøye prøvefordelings- og identifikasjonsplanen. 2) Klargjør den fortynnede vaskeløsningen R2 og den antigenpositive kontrollens arbeidsløsning (R5a + R5b) (se punkt 7.2). 3) Ta støtterammen og de nødvendige strimlene (R1) ut fra den beskyttende pakningen. Legg de ubrukte strimlene tilbake i pakningen. Lukk pakningen og legg den tilbake til +2-8 C. 4) Fordel i brønnen i følgende rekkefølge (anbefalt platefordeling): 100 µl konjugat 1 (R6) i hver brønn, 50 µl negativ kontroll (R3) i brønn A1, 50 µl positiv kontroll (R4) i brønnene B1, C1, D1, 50 µl av den antigenpositive kontrollens arbeidsløsning (R5a + R5b) i brønn E1, 50 µl av første prøve i brønn F1, 50 µl av andre prøve i G1 osv. Homogeniser blandingen med minst 3 aspirasjoner eller med en mikroplaterister i 5 sekunder. Hvis prøvefordelingen tar mer enn 10 minutter, må man fordele negative og positive kontroller etter prøvene som skal analyseres. Avhengig av hvilket system som brukes er det mulig å endre kontrollenes posisjon eller fordelingsrekkefølgen. MERK: Etter prøvefordelingen blir brønnen som inneholder prøve (eller kontroller) purpur til blå. Det er mulig å verifisere nærværet av (prøve + konjugat 1) i brønnene ved spektrofotometrisk avlesning ved 620 nm (se pkt. 7.7). 5) Dekk, om mulig, platen med ny klebende film. 6) Inkuber mikroplaten i 90 minutter (± 5 min.) ved 37 C ± 1 C. 7) Fjern, om nødvendig, den klebende filmen. Aspirer innholdet fra alle brønnene i en beholder for flytende avfall og tilsett minimum 370 µl vaskeløsning i hver brønn. Aspirer på nytt og gjenta vaskingen minst 5 ganger. Restvolumet må være mindre enn 10 µl (tørk, om nødvendig, strimlene ved å snu dem opp-ned på absorberende papir). Hvis du har en automatisk vasker, må du følge samme operasjonssyklus. 8) Fordel raskt 100 µl av løsningen av konjugat 2 (R7) i hver av platens brønner. Konjugatet må ristes forsiktig for bruk. Dekk, om mulig, med en ny klebende film og inkuber i 30 minutter (± 5 min.) ved 37 C ± 1 C. MERK: Konjugatet farges grønt. Det er mulig å verifisere nærværet av konjugat i brønnene ved spektrofotometrisk avlesning ved 620 nm (se pkt. 7.7). 9) Fjern den klebende filmen, tøm alle brønnene ved aspirering og vask minst 5 ganger som beskrevet over. 10) Klargjør enzymatisk utviklingsløsning (reagens R8 + R9). 11) Fordel raskt 80 µl av klargjort enzymatisk utviklingsløsning (R8 + R9) i alle brønnene. La reaksjonen utvikles i mørke i 30 minutter (± 5 min) ved romtemperatur (18-30 C). Ikke bruk klebende film under denne inkubasjonen. MERK: Fordelingen av utviklingsløsningen, som blir farget rosa, kan kontrolleres visuelt ved dette manipulasjonssteget. Det er en tydelig fargeforskjell mellom en tom brønn og en brønn som inneholder den rosa substratløsningen (se pkt 7.7). 12) Tilsett 100 µl stoppløsning (R10) med samme sekvens og samme hastighet på fordelingen som utviklingsløsningen. MERK: Fordelingen av den fargeløse stoppløsningen kan kontrolleres visuelt på dette håndteringstrinnet. Substratfargen, rosa (for negative prøver) eller blå (for positive prøver), blekner i brønnene, som blir fargeløse (for negative prøver) eller gul (for positive prøver) etter tilsetting av stoppløsning. 13) Tørk forsiktig hver platebunn. Vent minst 4 minutter etter tilsettingen av stoppløsning og innen 30 minutter etter at reaksjonen er stoppet, leses den optiske tettheten ved 450/ nm med en plateleser. 14) Sjekk samsvaret mellom de spektrofotometriske og visuelle avlesningene og mot platen og prøvefordeling og identifikasjonsplan. 8 [NO]

9 7.4. Kvalitetskontroll Bruk positive kontroller (R4 og R5) og den negative kontrollen (R3) i hver analysering for å validere analysen (se pkt. 7.5) Kriterier for testvalidering Denne testen er validert hvis det tas hensyn til betingelsene under: 1) For den negative kontrollen R3: Den målte absorbansverdien må være mindre enn 60 % av cutoff: O.D. < cutoff x 0,6 2) For den antistoffpositive kontrollen R4: 0,800 gjennomsnittlig O.D. R4 2,700 Hvis en av den positive kontrollens R4 individuelle verdier avviker med mer enn 30 % fra gjennomsnittsverdien, oversees verdien og beregningen utføres på nytt med de to gjenværende positive kontrollverdiene. 3) For arbeidsløsningen R5: O.D. > 0, Beregning/tolking av resultater Cutoff blir bestemt med R4 positiv kontroll: Beregn den gjennomsnittlig målte absorbansverdien for positiv kontroll R4. Beregn cutoff-verdi: Gjennomsnittlig OD R4 CO = Nærværet eller fraværet av anti-hcv antistoffer og/eller HCV kapsidantigen blir bestemt ved å sammenligne den registrerte absorbansen med den beregnede cutoff-verdien for hver prøve. Følgende forhold blir beregnet for hver prøve: Forhold = OD for prøven / CO-verdi Prøver med en optisk tetthet mindre enn cutoff-verdien blir betraktet å være negativ (forhold < 1) av Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2. Resultater rett under cutoff-verdien (CO-10 % < O.D. < CO, forhold mellom 0,9 og 1) må imidlertid tolkes med varsomhet. Det er anbefalt å analysere på nytt i duplikat de tilsvarende prøvene når system- og laboratorieprosedyrene tillater det. Prøver med optisk tetthet større eller lik cutoff (forhold 1) betraktes i utgangspunktet av Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 å være positive. De må analyseres på nytt i duplikat før endelig tolking. Hvis forholdsverdiene for minst en av de to duplikatene er lik eller større enn 1 etter ny analysering, er det opprinnelige resultatet repeterbart og prøven erklæres å være positiv med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2. Forholdsverdien for de 2 duplikatene er mindre enn 1, det opprinnelige resultatet er ikke repeterbart og prøven erklæres å være negativ. Prøvene som har blitt testet på nytt to ganger og funnet negative med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2, men med en verdi nær cutoff-verdien (forhold mellom 0,9 og 1) må betraktes med forsiktighet. Det anbefales å teste pasienten på nytt med en annen metode eller en annen prøve. Ved svært lav optisk tetthet for analyserte prøver (negativ OD) og når nærværet av prøver samt av reagens blir kontrollert, kan resultatene tolkes som negative. Det anbefales å bekrefte de positive prøvene etter de aktuelle nasjonale anbefalingene og algoritmene. 9 [NO]

10 7.7. Spektrofotometrisk verifisering av pipettering av prøve og konjugat (valgfri) Pipetteringsverifisering av prøve og konjugat 1 (R6) Det er mulig å verifisere nærværet av konjugat 1 (R6) + prøve i brønnen ved automatisk avlesning ved 620 nm. Hver brønn som inneholder prøve og konjugat 1 (R6) må ha en OD større enn 0,800. MERK: Etter prøvetilsetting, blir konjugat 1 (R6) purpur til blå. Pipetteringsverifisering av konjugat 2 (R7) Konjugatet 2 (R7) farges grønt. Nærværet av konjugat 2 (R7) i brønnene kan kontrolleres ved automatisk avlesning ved 620 nm: OD-verdien for hver brønn må være større enn 0,300 (en verdi lavere enn denne indikerer normalt en dårlig dispensering av konjugatet). Pipetteringsverifisering av utviklingsløsningen Det er mulig å verifisere nærværet av rosa utviklingsløsning i brønnen ved automatisk avlesning ved 490 nm. En brønn med utviklingsløsning må ha en optisk tetthet større enn 0,100 (en lavere OD indikerer en dårlig dispensering av utviklingsløsningen). Det blir en betydelig fargeendring for de tomme brønnene fra ufarget til rosa etter tilsetting av klargjort kromogen substratløsning. 8. TESTBEGRENSNINGER På grunn av de forskjellige immunologiske responsene for pasienter infisert av hepatitt C-viruset (spesielt under serokonversjoner), kan litt forskjell i påvisning observeres mellom tester avhengig av typene antigeniske proteiner som brukes. Et negativt resultat under en screeningtest ekskluderer derfor ikke muligheten for eksponering mot eller infeksjon av hepatitt C-virus. Ifølge litteraturen kan HCV-bærere som gjennomgår immunsuppresjonsbehandling eller er koinfisert med HIV-HCV ha spesielt lave antistoffnivåer, under HCV-testenes påvisningsgrense. Enhver ELISA-teknikk kan gi falske positive reaksjoner. Det anbefales å sjekke spesifisiteten for reaksjonen for enhver prøve som er funnet gjentakende positiv, ifølge tolkingskriteriet for Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-kittet, med en egnet metode: med en ELISA anti-hcv antistoffscreeningtest på sine egne eller med en immunblot anti-hcv antistoffpåvisningstest for å bevise nærværet av anti-hcv-antistoffer. Bruk, om nødvendig, en molekylærbiologisk test for å screene for HCV-genom. Den kolorimetriske metoden for å sjekke avsetningene for prøver og/eller konjugater og/eller utviklingsløsningen tillater ikke at nøyaktigheten av de fordelte volumene kan sjekkes og viser kun nærværet av prøven og/eller konjugatene og/eller utviklingsløsningen. Forholdet av feil svar med denne metoden er nær linket til det brukte systemets nøyaktighet (kumulert variasjonskoeffisient for dispensering og avlesning over 10 % signifikant kvalitetsfall for verifiseringen). Bruk av Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 test er ikke godkjent for blandede eller fortynnede prøver. Fine partikler kunne eksepsjonelt sees i Konjugat 1 (R6), men deres nærvær endrer ikke i noe tilfelle reagensets kvalitet. 9. YTELSESEGENSKAPER 9.1. Presisjonsmåling Reproduserbarheten og intermediat pressisjon har blitt vist med prøver med forskjellige konsentrasjoner anti- HCV antistoffer og HCV-antigener. Prøvene ble testet 30 ganger under den samme analyseserien for å bestemme repeterbarheten. Intermediat presisjon har blitt evaluert ved å teste prøvene i duplikat under 20 dager på 2 uavhengige analyseringer hver dag. Gjennomsnittlig forhold, standard avvik og variasjonskoeffisienter (CV) ble beregnet. 10 [NO]

11 Repeterbarhet Prøver N Gjennomsnittlige forhold Standardavvik Variasjonskoeffisient (CV) (%) Negativ S1 30 0,23 0,024 10,4 HCVantigen, positiv Anti-HCV antistoffer, positive CVer oppnådd på 6 positive prøver er <10 % Intermediat presisjon Prøver N S2 30 1,21 0,048 4,0 S3 30 1,43 0,053 3,7 S6 30 7,18 0,166 2,3 S4 30 1,42 0,046 3,2 S5 30 1,35 0,083 6,1 S7 30 6,73 0,153 2,3 Gjennomsnittlige forhold Innen analyse Mellom analyse/bruker Mellom dager SD CV % SD CV % SD CV % SD CV % Negativ S1 80 0,22 0,017 7,5 0,028 12,5 0,029 12,7 0,043 19,4 Total reproduserbarhet HCVantigen, positiv Anti-HCV antistoffer, positive S2bis 80 2,80 0,143 5,1 0,277 9,9 0,283 10,1 0,421 15,0 S3 80 1,56 0,124 7,9 0,129 8,2 0, ,197 12,6 S6 68 6,69 0,500 7,5 0,621 9,3 0,557 8,3 0,973 14,5 S4 80 1,57 0,062 3,9 0,125 8,0 0* I/A 0,140 8,9 S5 80 1,75 0,075 4,3 0,164 9,3 0* I/A 0,181 10,3 S7 80 7,69 0,285 3,7 0,531 6,9 0* I/A 0,603 7,8 *: Den negative variansverdien er estimert til 0. CVer oppnådd på 6 positive prøver er ikke mer enn 15 % Klinisk ytelse Ytelsene for Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 har blitt bestemt ved å teste prøver fra tilfeldige blodgivere, innlagte pasienter, pasienter med akutte og kroniske infeksjoner av hepatitt C-virus, og pasienter med kliniske tegn som ikke er relatert mot infeksjon av hepatitt C-virus. Studiene ble utført på 2 blodgiversteder, på et sykehus og på et Bio-Rad-sted Diagnostisk spesifisitet Studien ble utført på serum- og EDTA-plasmaprøver tatt ved 2 giversteder av tilfeldige givere. En spesifisitetsstudie ble også utført på prøver fra sykehusinnlagte pasienter. Alle prøvene ble analysert med en CE-merket anti-hcv-analyse. Populasjon Sted Prøvetype Nummer Blodgivere #1 Repeterte reaktive prøver (RR) Spesifisitet (%) serum /537 plasma /2002 #2 serum /2638 Konfidensintervall 95 % #1 + # ,94 % 5174/ ,83 % 99,99 % Sykehusinnlagte pasienter #3 serum ,80 % 501/502 98,92 % 100,00 % *: 3 donorer som ble funnet å være usikre med referansetesten ble fjernet fra beregningene 11 [NO]

12 Diagnostisk sensitivitet Den diagnostiske sensitiviteten ble undersøkt på 575 prøver fra pasienter infisert av hepatitt C-virus. Blant disse prøvene, kom 25 fra pasienter der prøven var tatt 24 timer før analysering. 481 forskjellige genotypede prøver (1; 2; 3; 4; 5; 6) ble testet. Tabell 1: Testede genotyper Genotyper (1, 1a, 1b, 1a/b) (2 2a/c, 2a, 2b, 2b/3 (3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r) (5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n) Totalt N Den diagnostiske sensitiviteten for alle de testede prøvene er 100 % (575/575) med et konfidensintervall på 95 % av [99,4-100,0]. Prøver fra pasienter med en akutt infeksjon: 39 paneler av serokonversjon (10 kapside profiler, 10 NS3 profiler og 19 multiple profiler) ble testet med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-analysen og sammenlignet med en kombinert antigen/antistoff-analyse og med en anti-hcv-antistoffanalyse, begge CE-merket. Tidlig modenhet for påvisning ble målt for alle paneler. Over disse 39 panelene, ble et panel ikke påvist av Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 og tre ble ikke påvist av kombinert Ag-Ab-analyse den ble sammenlignet med. På de 38 panelene påvist av Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2, hadde 5 en tidligere påvisning, 27 hadde en lik påvisning og 6 hadde en senere påvisning sammenlignet med kombinert Ag-Ab-analyse. Sammenlignet med en anti-hcv-antistofftest, hadde 28 paneler en tidligere påvisning, 9 hadde en lik påvisning og 1 hadde en senere påvisning. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 mot kombinert Ag-Ab HCV-analyse Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 mot Anti-HCV-analyse Antall paneler Tidligere påvisning 5 28 Lik påvisning 27 9 Senere påvisning Analytisk spesifisitet / kryssreaktivitetsstudie 365 potensielt interfererende prøver som inneholder antistoffer mot patogener som kan føre til smittsomme sykdommer (Cytomegalovirus, Epstein Barr-virus, VZV, meslingevirus, rubellavirus, kusmavirus, herpesvirus, influensavirus, hepatitt A-virus, hepatitt B-virus, HIV 1/2, HTLV 1/2, syfilis, Toxoplasma gondii, denguefeber), prøver fra risikogruppen (dialysepasienter, lidende ikke-hepatisk cirrhose, gravide kvinner, multipareøse kvinner) eller prøver fra pasienter med forstyrrelser i immunsystemet (autoantistoffer, reumatoid faktor, antimus-antistoffer, og myelomer) ble testet med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-analysen. To prøver ble funnet gjentatt positive med Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2-analysen. Spesifisiteten som ble observert på denne målpopulasjonen på 99,45 % (363/365) var lik spesifisiteten for kliniske prøver Hook-effekt Forekomsten av en mulig hook-effekt ble studert ved å teste 5 prøver med høy titer ved forskjellige fortynninger. Samsvaret av resultater som ble observert blant ikke-fortynnede og fortynnede prøver indikerer fraværet av hook-effekten. 12 [NO]

13 10. REFERANSER Bhartia A.R., Letendrea S.L., Wolfsona T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52 : Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, 36 : Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby A., Barp P.J., Weiner A.J., Bradley D.W., Kuo G. and Houghton M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2): Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT for HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43: Lambert N. Value of HCV Antigen-Antibody Combined HCV Assay in Hepatitis C Diagnosis. Dev. Biol. (Basel), 2007, 127: Laperche S., Le Marrec N., Girault A., Bouchardeau F., Servant-Delmas A., Maniez-Montreuil M., Gallian P., Levayer T., Morel P., Simon N. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-hcv antibodies improves the early detection of HCV infection. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(8): Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion : Rider P.J. and Liu F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32. Schnuriger A., Dominguez S., Valantin M.A., Tubiana R., Duvivier C., Ghosn J., Simon A., Katlama C. and Thibault V. Early Detection of Hepatitis C Virus Infection by Use of a New Combined Antigen-Antibody Detection Assay : Potential Use for High-Risk Individuals. J. Clin. Microbiol. 2006, Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : Widell A., Busch M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: [NO]

14 14 [NO]

15 15 [NO]

16 16 [NO]

17 17 [NO]

18 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - Frankrike Tlf.: +33 (0) /09 Faks: +33 (0) [NO]