PASTOREX CRYPTO PLUS PÅVISNING AV LØSELIGE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS ANTIGENER I BIOLOGISKE VÆSKER (SERUM, CSF, BAL, URIN)

Transkript

1 PASTOREX CRYPTO PLUS PÅVISNING AV LØSELIGE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS ANTIGENER I BIOLOGISKE VÆSKER (SERUM, CSF, BAL, URIN) /07 1. KLINISK INFORMASJON Kryptokokkose er en opportunistisk infeksjon som forekommer hos pasienter med svekket immunforsvar, først og fremst hos pasienter med AIDS. Kryptokokkose er i dag hovedårsaken til infeksjonsrelaterte dødsfall hos AIDS pasienter. Forekomsten av kryptokokkose varierer fra 2-10% i Vest-Europa og i USA, men overstiger 15% i noen deler av Afrika (3). Etter det første stadiet av infeksjonen som finner sted i lungene (1) sprer infeksjonen seg raskt til sentralnervesystemet (hjernehinnene) og til andre organer hos immunsvekkede pasienter. Løselige antigener kan allerede på et tidlig stadium påvises i serum, cerebrospinalvæske (CSF), bronkoalveolær lavage (BAL) og urin. Det er identifiseringen av den innkapslede gjærsoppen i mikroskop, påvisningen av vekst av Cryptococcus neoformans i kultur og identifiseringen av innkapslede antigener i biologiske væsker (2) som legges til grunn for diagnosen kryptokokkose. 2. PRINSIPP Pastorex Crypto Plus er en kvalitativ og semi-kvantitativ test som bruker en enkel agglutinasjonsteknikk for å påvise den kapsulære polysakkariden til Cryptococcus neoformans, glucuronoxylomannan (GXM), i biologiske væsker (serum, CSF, BAL, urin). Denne testen bruker partikler som er belagt med et anti-glucuronoxylomannant monoklonalt antistoff da glucuronoxylomannan er hovedkomponenten i kapselen til Cryptococcus neoformans (4). Agglutinatet som oppstår som følge av reaksjonen mellom partiklene og GXM er synlige med det blotte øye. Sensitivitetsgrensen er på 50 ng/ml for serum. Testen kan gjennomføres med varme-inaktiverte prøver (30 minutter ved 56 C) for å kunne utelukke risikoen for HIV-smitte. Foregående enzymatisk behandling av alle slags prøver, med unntak av prøver tatt fra urin, er nødvendig for å kunne utelukke interferens og for å øke sensitivitet for påvisning (5, 6, 7). De positive prøvene blir så titrert ved seriefortynning i en bufferløsning. Mengden av antigener i løsningen (antigen-titeret) indikerer stadium og spredning av infeksjonen Bestemmelsen av antigenets kinetikk i sykdommens videre forløp kan brukes til å evaluere behandlingens effekt (2). 3. INNHOLD I SETTET Sett for 60 tester - kode som inneholder: Lateks Cryptococcus: 1 dråpeflaske med 1 ml Cryptococcus lateks: latekspartikler sensibilisert med et antiglycuronoxylomannant antistoff (mus) i en glycin-buffer. Positiv antigen kontroll: 1 dråpeflaske med 0,5 ml positiv kontroll: renset Cryptococcus neoformans kapsulær polyosid. Diluent (Fortynningsbuffer): 1 dråpeflaske med 10 ml glycin-albumin-buffer. Pronase: 2 ampuller med frysetørrede enzymer (pronase) som skal rekonstitueres i 1 ml destillert eller demineralisert vann. Stopp-løsning: 1 dråpeflaske med 2 ml stopp-løsning (enzymatisk hemmer) 15 engangskort for agglutinasjon 100 små engangspinner (disposable sticks) Alle reagensene inneholder 0,02 % thiomersal og mindre enn 0.1% natriumazid. 4. OPPBEVARING Alle reagensene er holdbare til utløpsdatoen som er angitt på etiketten hvis de oppbevares ved +2-8 C og bakteriell kontaminering unngås (selv en gangs åpning er nok til å forårsake dette). Rekonstituert pronase er holdbart i fire uker ved +2-8 C eller flere måneder ved -20 C. Lateksreagensflaskene skal oppbevares loddrett. LATEKSREAGENSENE MÅ IKKE FRYSES. 5. PÅKREVD MATERIALE SOM IKKE FØLGER MED Presisjonspipetter Tett lukkede mikrorør Vannrett roterende rister (160 rpm) Vortex- blander 1

2 56 C vannbad 100 C vannbad Desinfeksjonskar 6. FORHOLDSREGLER Resultatenes kvalitet avhenger av at reglene for god laboratoriepraksis overholdes strengt. Alle reagenser og prøver skal brukes ved romtemperatur (18-30 C). Ikke berør reaksjonsoverflaten på agglutinasjonskortene. Bytt pipette eller engangsspiss for hver prøve som testes. Ryst flaskene med lateks før bruk. Tørk av spissen på reagensdråpeflasken for å få til velkalibrerte dråper. Hold reagensflasken loddrett når dråpene dispenseres. Skift ut blandepinnen mellom hver reaksjon. Kasser alt brukt engangsmateriale i en autoklaverbar avfallsbeholder eller i et desinfeksjonsbad. INSTRUKSJONER FOR HYGIENE OG SIKKERHET Overhold alltid gjeldende teknikker og forholdsregler med henblikk på beskyttelse mot mikrobiologiske farer. Når det gjelder fare- og forsiktighetsanbefalinger i forhold til enkelte kjemiske komponenter i dette testsettet, kan du se piktogrammet(-ene) nevnt på etikettene og informasjonen angitt på slutten av bruksanvisningen. Sikkerhetsdatabladet er tilgjengelig på 7. BRUKSANVISNING 1. KLARGJØRING AV ENZYMET PRONASE Rekonstituer en ampulle med pronase med 1 ml destillert eller demineralisert vann. Unngå skumdannelse ved rekonstitueringen og forsikre deg om at det frysetørrede (lyophilisate) er fullstendig oppløst. Hvis det gjennomføres mellom 30 og 40 tester hver måned kan pronasen oppbevares ved +2-8 C (forblir holdbar i 4 uker). For mindre gjennomføringer kan delprøver med 20 μl klargjøres i separate rør og lagres ved -20 C. 2. PRØVER Lagring Prøvene bør testes så snart som mulig etter at de er blitt tatt. Hvis dette ikke er mulig kan de lagres et par timer ved +2-8 C. ADVARSEL: bruk kun tørre rør med serumprøver. Interferens på grunn av for store mengder albumin, lipider, hemoglobin og bilirubin har ikke blitt testet ut. Fremgangsmåte a) Serum, BAL Ha 120 μl av prøven som skal undersøkes i et rør med en tett propp og tilsett 20 μl pronase. Rist kraftig og varm opp til 56 C i 30 minutter. Fjern røret fra vannbadet og tilsett 1 dråpe stopp-løsning (enzymatisk hemmer). Bland grundig. ADVARSEL: ved bruk av vannbad må det sørges for at vann ikke kommer inn i rørene dette kan føre til et falskt resultat. b) CSF Dersom cerebrospinalvæsken er veldig uklar eller inneholder røde blodlegemer bør den sentrifugeres i 5 minutter ved 350g (2000 omdreininger/min) og saml opp supernatanten (det øvre laget av væsken). Ha 120 μl av prøven som skal undersøkes i et rør med en tett propp og tilsett 20 μl pronase. Rist kraftig og varm opp til 56 C i 30 minutter. Fjern røret fra det 56 C varme vannbadet. Stopp pronasens enzymatiske aktivitet ved å varme opp i et 100 C vannbad i 5 minutter. Bland grundig. Avkjøl 3-4 minutter før agglutinasjonsreaksjonen utføres. ADVARSEL: ved bruk av vannbad må det sørges for at vann ikke kommer inn i rørene dette kan føre til et falskt resultat. c) Urin Fortynn 1:2 i glycin-bufferen. 2

3 3) AGGLUTINASJONSREAKSJON Ha 40 μl av den forhåndsbehandlede prøven oppå en av sirklene på agglutinasjonskortet. Tilsett en dråpe Cryptococcus lateks ved siden av. Bruk en blandepinne for å blande grundig. Utfør en negativ kontroll ved å blande 40 μl fortynningsbufferen med en dråpe lateks. Plasser agglutinasjonskortet på risteren i 5 minutter (160 r/pm) ved romtemperatur ( C). 8. TOLKNING AV RESULTATER Tolkning En positiv reaksjon kjennetegnes av at latekspartiklene agglutinerer med prøven men ikke med den negative kontrollen (lateks + fortynningsbuffer). Titrering Fortynningene i glycin-bufferen kan klargjøres slik: Fortynning 1:10 1:100 1:1000 1:10000 Forhåndsbehandlet prøve 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Buffer-løsning 450 µl 450 µl 450 µl 450 µl Nøyaktig titrering gjøres så ved hjelp av 2-gangers seriefortynninger, begynnende med den siste positive prøven: 50 μl + 50 μl av bufferen. MERK: Tolkningen av agglutineringen ved høye fortynninger kan variere avhengig av operatøren; når en ny prøve fra samme pasient blir titrert rådes det derfor til å bekrefte titeret til den tidligere prøven. 9. KVALITETSKONTROLL AV TESTEN Lateksens sensitivitet kan kontrolleres periodevis ved hjelp av den positive kontrollen i settet. GXM-nivået i den positive kontrollen er på 200 ng/ml. 10. PRODUSENTENS KVALITETSKONTROLL Alle produserte reagenser fremstilles i henhold til vårt kvalitatssikringssystem, helt fra vi mottar råstoffene til produktet kommer på markedet. Hver lot sendes til kvalitetskontroll og blir ikke sendt ut på markedet før det oppfyller forhåndsdefinerte kriterier for godkjenning. Dokumentasjonen for produksjon og kontroll for hvert parti oppbevares hos Bio-Rad. 11. YTELSE Det monoklonale antistoffet E1 som blir brukt i denne agglutinasjonstesten ble karakterisert av Dromer et al. (4). Tidligere studier med en agglutinasjonstest som bruker hvite partikler bekreftet de gode ytelseskarakteristikkene til dette antistoffet. En av disse studiene (8) ble gjennomført med 84 sera fra pasienter med kryptokokkose og 47 kontrollsera. Behandling med pronase ble funnet å øke sensitiviteten og spesifisiteten når det gjelder påvisning av GXM. I en annen evaluering (9) ble det vist at antigentiteret ikke var identisk/stabilt med forskjellige batcher av reagensene, og at reversering til negativ Pastorex TM Crypto Plus kan gjenspeile virkningen av behandling. Ved bruk av røde latekspartikler i stedet for hvite partikler forbedres synligheten av aggregatet. De følgende resultatene ble oppnådd ved en klinisk evaluering som ble gjennomført i et laboratorium tilknyttet et sykehus. SENSITIVITET Prøver fra 38 pasienter med kryptokokkose. Prøve Antall pasienter Pastorex Crypto Plus Type Samlet antall + - SERA CSF BAL URIN Sum * Den samlede sensitiviteten til Pastorex Crypto Plus anslås til 92% på grunnlag av disse 51 prøvene. * De fire positive prøvene som feilaktig ble bestemt som negative av Pastorex Crypto Plus ble også negative ved bruk av en annen agglutinasjonstest basert på et polyklonalt antigen. 3

4 SPESIFISITET Prøver fra 92 pasienter uten kryptokokkose. Prøve Antall pasienter Pastorex Crypto Plus Type Samlet antall + - SERA CSF BAL URIN SUM Spesifisiteten til Pastorex Crypto Plus anslås til 98% på grunnlag av disse 96 prøvene. Komplementær intern evaluering som ble gjennomført ved bruk av 59 sera, derav 18 fra pasienter med dokumentert aspergillose eller candidiose oppnådde en spesifisitet på 100%. Påvisningsgrensen til GXM i serum ble estimert til 50 ng/ml. 12. PROSEDYRENS BEGRENSNINGER Agglutinasjon kan hemmes ved svært høye nivåer av GXM (hook-effekt/prosone-effekt). Hvis det hersker tvil når det gjelder tolkning av en reaksjon, gjentas derfor testen med en 1/100dels fortynning av prøven. Resultatene må videre tolkes i lys av sykdomsforløpet til pasienten. Dersom konsentrasjonen av antigenet i prøven er lavere enn den nedre påvisningsgrensen til Pastorex Crypto Plus kan dette føre til et feilaktig negativt resultat: i slike situasjoner bør testen gjentas på et senere tidspunkt. Dette diagnostiske verktøyet, hvor en påviser løselige antigener ved hjelp av agglutinasjon med latekspartikler, er raskere enn konvensjonelle dyrkningsmetoder. Klinisk og bibliografisk materiale når det gjelder påvisningen av GXM antigenet i BAL og urin ved hjelp av lateksreagenser er begrenset på det nåværende tidspunkt. Likheter mellom antigenet til Cryptococcus-kapselen og (celle)veggen til Trichosporon beigelii kan føre til feilaktig positive reaksjoner hos pasienter med trichosporose (4). Som når det gjelder all immunologisk teknikk, må en ta i betraktning mulighetene for kryssreaksjoner. Det er identifiseringen av den innkapslede gjærsoppen (Indian ink staining) i mikroskop, påvisningen av vekst av Cryptococcus neoformans i kultur og identifiseringen av innkapslede antigener i biologiske væsker (2) som legges til grunn for diagnosen kryptokokkose. Metoden som går ut på å påvise løselige antigener ved agglutinasjon av latekspartikler er et diagnostisk verktøy. Diagnosen kryptokokkose kan kun stilles etter at alle kliniske, radiologiske og biologiske (mikrobiologiske, histologiske, serologiske) aspekter har blitt vurdert hver for seg og satt i en sammenheng. 13. BIBLIOGRAFI 1. CAMERON M.L, BARTLETT J.A., GALLIS H.A., WASKIN H.A, Manifestations of Pulmonary Cryptococcocis in Patients with Acquired Immunodeficiency Syndrome, R.I.D., 1991, 13, p STAIB F., Cryptococcocis in Aids - Mycological-diagnostic and epidemiological observations, Aids-Forshung (AIFO), 1987, p DROMER F., MATHOULIN S., DUPONT B, LAPORTE A., and the French Cryptococcosis Study Group. Epidemiology of Cryptococcosis in France : A 9-Year Survey ( ). Clin. Inf. Dis.1996, 23, p DROMER F., SALAMERO J., CONTREPOIS A., CARBON C., YENI P. Production, Characterization and Antibody Specificity of a Mouse Monoclonal Antibody Reactive with Cryptococcus neoformans Capsular Polysaccharide. Infect. and Immun., 1987, 55, p GRAY L.D., ROBERTS G.D. Experience with the Use of Pronase to eliminate Interference Factors in the Latex Agglutination Test for Cryptococcal Antigen. J. Clin. Microbiol., 1988, 26, p HEELAN J.S., CORPUS L, KESSIMIAN N. False-positive reaction in the Latex Agglutination Test for Cryptococcus neoformans Antigen. J.Clin.MIcrobiol. 1991, 29, p HAMILTON J.R., NOBLE A., DENNING D.W., STEVENS D.A. Performance of Cryptococcus Antigen Latex Agglutination Kits on Serum and Cerebrospinal Fluid Specimens of Aids patients before and after Pronase treatment. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, p TEMSTET A., ROUX P., POIROT J.L., RONIN O., DROMER F. Evaluation of monoclonal antibody based latex test for the diagnosis of Cryptococcosis : Comparison with two tests Using Polyclonal Antibodies J. Clin. Microbiol. 1992, 30, p SWINNE D., MEULEMANS L., DE VROEY Ch. Detection of Cryptococcus antigen with a mononucleal antibody based latex test (abstract) Trends in the management of systemic fungal infections, Nijmegen, The Netherlands, 5-7 Sept

5 5

6 6

7 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /