Kap.14 Det prokaryote kromosom: Genetisk analyse i bakterier

Transkript

1 Kap.14 Det prokaryote kromosom: Genetisk analyse i bakterier

2 Oversikt over kapittel 14 Generell oversikt over bakterier Variasjon i størrelser Metabolsk aktivitet Hvordan dyrke dem for å studere dem Det bakterielle genom Struktur Organisering Transkripsjon Replikasjon Evolusjon av store, sirkulære kromosomer Struktur og funksjon av små sirkulære plasmider Gen overføring i bakterier Transformasjon Konjugasjon Transduksjon Et omfattende eksempel Genetiske egenskaper brukes for å forstå bakteriell kjemotaxis

3 Et familietre over levende organismer Fig. 14.1

4 Styrken til bakteriegenetikk er potensialet til å studere sjeldne hendelser Bakterier formerer seg raskt Flytende media E. coli vokser til konsentrasjoner på 10 9 celler per milliliter i løpet av en dag De fleste studier fokuserer på E. coli Finnes i tynntarmen hos varmblodige dyr Vokser uten oksygen Laboratoriestammer er ikke patogene Prototrofe lager selv alle enzymer de trenger for aminosyre- og nukleotidsyntese Vokser på minimalmedium inneholdende glukose som eneste karbonkilde Deler seg omkring en gang hver time på minimalmedium og hvert 20 minutt i rike media Rask formering gjør det mulig å observere veldig sjeldne genetiske henselser

5 Hvordan finne mutasjoner i bakteriegener Mutasjoner påvirker kolonimorfologi Mutasjoner overfører resistens overfor antibiotika eller bakteriofager Mutasjoner som skaper auxotrofer Mutasjoner påvirker muligheten for celler til å bryte ned og bruke kompliserte kjemikalier i omgivelsene Mutasjoner er viktige i gener dersom deres proteinprodukt er nødvendig under alle vekstforhold

6 Hvordan identifisere mutasjoner ved genetisk screening Genetiske screeninger gir en mulighet til å observere mutasjoner som skjer veldig sjelden slik som spontane mutasjoner (1 av 10 6 til en av 10 8 celler) Replika plating simultan overføring av tusenvis av kolonier fra en plate til en annen Behandling med mutagener øker mutasjonsfrekvensen Anrikningsprosedyrer øker andelen mutant celler ved å drepe villtypeceller Testing for synlige mutanter på petriskål

7 Bakterie nomenklatur Villtype + Mutant gen - Tre små bokstaver i kursiv et gen (eks., leu+ er villtype for leucine genet) Fenotypen for en bacterie ved et spesielt gen blir skrevet med stor forbokstav og ikke kursiv (eks., Leu+ er en bakterie som ikke trenger leucine for å gro, og Leu- er en bakterie som trenger leucine for å gro)

8 Struktur og organisering av E. coli kromosomet 4.6 millioner basepar åpne leserammer (ORFs) 90% av genomet koder for proteiner (sammenlign det med mennesker) 4288 gener, 40% som vi ikke vet hva gjør nesten ikke noe repetert DNA 427 gener har en transport funksjon, andre klasser er også identifisert bakteriofagsekvenser funnet på 8 steder (må ha blitt invadert av virus minst 8 ganger i løpet av historien

9 Genoverføring i bakterier Fig. 14.9

10 Transformasjon Fragmenter av donor DNA tas opp av resipienten og forandrer dens genotype Naturlig transformasjon resipient celler har enzymatisk maskineri for DNA import Kunstig transformasjon ødeleggelse av resipient cellevegger tillater donor DNA å tas opp av cellene» Behandle cellene ved å suspendere dem i kalsium ved lave temperaturer» Elektroporering bland donor DNA med resipient bakterier og utsett dem for kortvarig høyspennings sjokk

11 Mekanisme for naturlig transformasjon Fig

12 Konjugasjon En type genoverføring som krever celle-til-celle kontakt Fig

13 Plasmidkonjugering Fig a

14 Konjugasjonsprosessen

15 F-plasmidet integreres av og til inn i E. coli kromosomet Hfr celler har integrert deler av kromosomet Episomer plasmider som kan integreres inn i vertskromosomet Ekskonjugat resipient celle med integrert DNA Et integrert plasmid kan initiere DNA overføring, men ofte tas noe av det bakterielle kromosomet med også Fig

16 Genover-føring i en konjugasjonskrysning mellom Hfr donor og F - resipient Fig

17 Kartlegging av gener ved Hfr og F- krysninger ved avbrutte konjugasjonseksperimenter

18 Avbrutte konjugasjonsstudier beviser at bakteriekromosomet er sirkulært Krysning mellom Hfr og F- F plasmidet integreres inn på ulike steder i ulike retninger i det sirukulære donor kromosomet Fig a, b

19 Delvis genetisk kart over E. coli kromosomet Fig c

20 Rekombinasjonsanalyse forbedrer nøyaktigheten av kartet Avbrutte konjugasjonseksperimenter gir en nøyaktighet på bare 2 minutter Rekombinasjonsfrekvens mellom gener er mere nøyaktig Start med å betrakte bare ekskonjugater som har alle gener som skal kartlegges (selekter for det sist overførte genet) Levende celler må ha et like tall overkrysniger Se på dette som en trepunktskrysning

21 Genkartlegging ved bruk av trepunkts-krysning Fig

22 Ulike klasser av overkryssere: firedoble overkryssere er minst vanlig Fig c

23 F plasmider kan brukes til komplementeringsstudier F plasmider replikerer som avgrensede sirkler av DNA inne i vertscellene. Overføres på samme måte som F plasmider Noen få kromosomale gener vil alltid overføres som deler av F plasmidet Kan danne delvise diploider Merizygoter delvise diploider hvor to genkopier er identiske Heterogenoter delvise dipoider som bærer forskjellige alleler av det samme genet

24 F plasmiddannelse og overføring Fig a, b

25 Komplementeringstesting ved bruk av F plasmider Fig c Dannelse av en heterogenote Fenotypen til en delvis diploid viser om mutasjonene komplementerer hverandre eller ikke

26

27 Transduksjon: Genoverføring via bakteriofager Bakteriofager Finnes godt spredd i naturen Infiserer, multipliserer og dreper bakterievertsceller Transduksjon kan innsette noe av det bakterielle kromosomet inn i dets eget kromosom og overføre det til andre celler Bakteriofagpartikler blir dannet ved en lytisk syklus Fag injiserer DNA inn i cellen Fag DNA uttrykker sine gener i vertscellen og replikerer Pakkes sammen til nye fagpartkler Cellene lyseres og fagen infiserer andre celler Lysatet er blitt en fagpopulasjon etter at den lytiske syklus er fullstendig

28 Generell transduksjon Fig

29 Kartlegging av gener ved generell transduksjon Rekombinasjonsfrekvens mellom gener P1 bakteriofag brukes ofte til kartlegging 90 kb kan konstransduseres og dette samsvarer med omkring 2% rekombination eller 2 minutter Finn først tilnærmet lokalisering av genet ved å krysse mutante stammer med ulike Hfr stammer P1 transduksjon brukes deretter til å kartlegge spesielle områder

30 Fig

31 Temperate fag kan integreres inn i bakteriegenomet gjennom en lysogen syklus og det dannes en profag Fig

32 Rekombinasjon mellom att seter hos fagen og bakteriekromosomet muliggjør integrasjon av profagen Fig b

33 Feilutskjæring av profag produserer spesialiserte transduserende fag Nærliggende gener følger med i det sirkulære fagdna som dannes etter utskjæring Fig c

34 Isolasjon av mutanter er genetikerens topp prioritet Transposoner skaper mutasjoner Innskudd i gener fører til inaktivering Brukt som mutagene agens Inneholder også antibiotikaresistente selekterbare gener Genetiske screeninger benytter transposoner Innsett transposoner inn i cellen ved transformasjon, transduksjon eller konjugasjon. Selekter for celler hvor transposisjon har skjedd Screen populasjoner av celler for mutante fenotyper Lokaliser posisjonen til transposonet på kromosomet

35 Kartlegging av mutasjoner Transposon innskudd kartlegging Identifiser mutanter indusert ved transposisjon PCR oppformering bruker primere for deler av transposonet og deler av DNA Sekvenser PCR produktet og sammenlign med E. coli genom databaser Hfr kartlegging av mutasjoner som ikke er indusert av transposoner Hfr stammer med overføringsorigo i forskjellige områder av kromosomet, og et Tn 10 transposon for tetracycline resistens Ekskonjugater screenes for tetracycline resistens Kartlegg området nær overføringsorigo i en stamme med tap av mutant fenotype

36 Fig Revers genetikk for å bestemme funksjon av et ukjent gen Knockout mutasjon av et mutant gen ved å bruke rekombinant DNA teknologi og homolog rekombiansjon

37 Bakterielle mutanter Flagellum mutanter Mer enn 20 fla gener kreves for å danne en flagelle. Mutasjoner hindrer produksjon av funksjonelle flageller Motor mutanter Mot gener kreves for å bevege flagellen. Mutanter er paralysert Signal transduksjon mutanter Che (chemotaxis) mutanter har flageller som beveger seg bare i en retning Mutanter hindrer riktig frigjøring av beskjeder fra celleoverflaten til motor hvor frekvens og retning av rotasjonen skjer Reseptor mutanter Mutanter i reseptorer som binder spesielle kjemikalier

38 Fremtiden for bakterie genetikere Sammenlignende genomanalyser kan brukes til å analysere den genetiske basis for bakteriell oppførsel Undersøkelse og sammenligning av ulike arters genomer Genomisk analyse kan kanskje brukes til beskyttelse av menneskets helse Identifisering av vaksinekandidater Oppdagelse av nye medisinmål Skaffe nye metoder for bakterieidentifikasjon