OPPSUEING FOELESNINGE UKE 35 Kromaografisk separasjon bygger på soffers likeveksfordeling mellom en sasjonær fase og en mobil fase. A P Likevekskoeffisienen er: A SP K = [ A] [ ] SP A Likeveksfordelingen besemmes primær av mobilfasens egenskaper, sasjonærfasens egenskaper, emperauren og de inermolekylære krefer. De inermolekylære krefene omfaer:. Polare van der Waals krefer: hydrogenbindinger, orieneringskrefer, induksjonskrefer. Orieneringskrefer virker mellom permanene dipoler, induksjonskrefer oppsår når en permanen dipol induserer en dipol i e molekyl som i ugangspunke ikke har e dipolmomen.. Dispersjonskrefer (Londonkrefer) Dee er krefer som virker mellom o molekyler som ikke har permanene dipoler, men som under en kor periode induserer gjensidig dipoler i hverandre. 3. Svake kovalene bindinger (eks.: syre/base eller kompleksdannelse) Coulombs prinsipp: LIKE LØSE LIKE. Vi kan forvene a molekyler med like elekrosaiske egenskaper har sørs ineraksjon. To forhold genererer kromaogrammene våre:. Separasjon i id som skyldes forskjeller i soffenes likeveksfordelinger mellom SP og P.. Båndspredningsprosesser, som skyldes fysiske/mekaniske forhold. Båndspredningsprosessene er ikke besem av fordelingskoeffisienene. Båndspredning forårsakes av:. Eddy-diffusjon: I en pakke kolonne kan mobilfasen finne ulike srømmingsveier gjennom pakkemaeriale. Disse srømmingsveiene kan ha ulik srømningshasigheer og veilengder. olekyler av samme ype som følger forskjellige srømmingsveier vil komme u av kolonnen il li forskjellige ider.. asseransporbegrensninger i mobilfase: Innenfor en enkel mobilfasesrøm vil mobilfasen srømme langsommere nær kolonnevegger og nær de parikler er i pakkemaeriale. olekyler som befinner seg nær kolonnevegger og parikkeloverflaer vil dermed ha en lavere vandringshasighe enn molekyler som befinner seg mid i mobilfasesrømmen. Vi får en spredning i elueringsiden. 3. asseransporbegrensninger i sillesående mobilfase: I e porøs pakkemaeriale kan porene i pariklene fylles med sillesående mobilfase. olekyler som diffunderer inn i porene kan ha da ulik oppholdsid inne i parikkelporene. Dee resulerer i en spredning i vandringshasigheen. 4. asseransporbegrensninger i sasjonærfase: Innenfor den samme soffraksjonen kan diffusjonsveiene il molekylene variere inne i sasjonærfasen. Dee gir opphav il ulike oppholdsider i sasjonærfasen og ilhørende båndspredning. P
5. Longiudinal diffusjon: olekyler vil spre seg uover fra den høykonsenrere sonen i e bånd (enropien krever de) il områder med lavere konsenrasjon. Dee gir bredere bånd. Fire parameere brukes il å beskrive e kromaogram:. eensjonsid (-volum): eensjonsiden foreller oss hvor lang id de går mellom prøvepåseing og deeksjonsmaksimum: ns = (+k), k = eller k = n er nullreensjonsiden, k kalles reensjonsfakoren. Sørrelsen urykker forholde mellom anall mol soff i sasjonærfasen, n S, og i mobilfasen, n, for e gi soff. eardasjonsfakoren, F, er besleke med reensjonsfakoren: n F = = n + n +k S E alernaiv il å bruke reensjonsider er å bruke reensjonsvolum. eensjonsvolume for en komponen som elueres u er: V = F F er den volumeriske srømmingshasigheen il mobilfasen (ml/min).volume av mobilfasen (nullreensjonsvolume) i den kromaografiske kolonnen er: V = F Vi kombinerer de o volumene for soffe og mobilfasen: V = V = V (+ k) = V + K V S k ns n S S = = CV C V = K Vs V. Kurvefasong: Vi anar a oppene i e kromaogram kan beskrives ved hjelp av en normalfordelingskurve. Likningen som beskriver en slik gaussisk opp ser slik u: ( ) A /σ h() = e σ π h(): Topphøyde ved iden, A: Toppareal, σ: Sandardavvik (i idsenheer), : Toppens reensjonsid. Toppmaksimum, H, har vi når = A h( ) = H = σ π Likningen viser a max opphøyde for gaussiske opper er proporsjonal med areale og omvend proporsjonal med båndspredningen. Topphøyden, i sede for areale, kan derfor brukes ved kvaniaiv umåling (NB! kun for symmeriske opper med relaiv lik båndspredning).
Toppbredden W, ved ulike idspunk er lik (- ), dvs: w = ( ) Innsa i gaussformelen og løs m.h.. på w får vi følgende urykk for oppbredden ved e vilkårlig idspunk: h() W = σ ln H 3. Båndspredning: Båndspredningen urykkes ved plaealle N: N = σ N er e mål på kolonnens effekivie. Sore verdier for N ilsier lien båndspredning. Eksperimenel kan vi besemme plaealle N ved å måle bredden på en opp. Ved grunnlinjen seer vi pr. def. Wb = 4σ (anar gaussisk form). Urykke for N blir da: N N = 6 wb = 5,54 w0,5 Alernaiv kan vi måle bredden ved halve opphøyden, w0,5. Her er oppbredden lik,355σ, og urykke for N blir da: En avlede sørrelse er plaehøyden H: H = L/N der L er lengden av den kromaografiske søylen. H vil være summen av bidragene fra de individuelle båndspredningsprosessene: H = H Longudinal + H Eddy + H obilfase + H Sillesående P + H Sasjonærfase Små verdier av H ilsier lien båndspredning. 3
4. Oppløsningsevnen, s, er definer som: = S w w ( + ) () Oppløsningsevnen er definer som avsanden mellom o naboopper del på den gjennomsnielige grunnlinjeoppbredden il båndpare. Vi ser a med sor avsand mellom oppene vil oppløningsevnen også bli sor. Oppløsningsevnen angir hvor god o nærliggende opper med reensjonsid og er askil. For å kunne opimalisere og syre den kromaografiske separasjonen ønsker vi å urykke oppløsningsevnen ved hjelp av de vikige paramerene k, N og α (separasjonsfakoren). Følgende sammenhenger er gi: = (+ k ) = (+ k ) k α = k 4 4 + ( k) wb N N N= 6 = = wb Ved å see direke inn i formel () uen å gjøre noen forenklinger vil vi ende opp med følgende urykk for s : ( α ) N k k N k s = =, hvor k = k + k k + k + + k + ( ) ( α ) Imidlerid foreas de ofe ilnærminger i formel (): Alernaiv : k = = ( α ) S S N ( ) w 4 + w + w k Alernaiv : α k S = S = ( ) N 4 w + w w α + k Som yerligere ilnærming ersaer vi il slu den individuelle reensjonsfakoren, k eller k, med den gjennomsnielige reensjonsfakoren, k. 4
OPTIALISEING AV OPPLØSNINGSEVNEN, s α k = N S 4 α II k + I III Ledd I: Hvis α = er reensjonsfakorene like sore, og vi har ingen separasjon av soffene. Økende α-verdi gir bedre separasjon. Dee ledde sier derfor noe om separasjonens selekivie. α kan syres ved å endre sammenseningen av sasjonærfasen og mobilfasen. For α vil separasjonen sor se være brukbar. Hvis separasjonsfakoren er for lav, må plaealle N (se ledd II) økes for å gi bedre oppløsning. Dee vil imidlerid bey lengre kolonner og lengre reensjonsider. α bør derfor maksimeres. Over en viss verdi vil likevel effeken av å øke α bli lien (se figuren under). Ledd II: Dee ledde sier noe om oppløsningen som funksjon av plaealle N. Bes separasjon oppnås ved å øke plaealle/redusere plaehøyden. E høy plaeall resulerer i mindre båndspredning, dvs. smalere opper. N er derfor e mål på kolonnens effekivie. Ledd III: Ledde angir reensjonen for båndpare (k sniverdi av k og k ). Ved å redusere k-verdien vil båndpare passere hurigere gjennom kolonnen, og vi får dårligere separasjon. Effeken er mes synlig ved små k-verdier (k < ). Ved å øke k-verdien vil oppløsningen forbedres, men i praksis vil k-verdier over 0 ikke bey noen vesenlig forbedring (se figuren under). For lange reensjonsider er av mange grunner ikke ønskelig. Effek av å endre de kromaografiske paramere α og k,0 0,9 Verdi 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 (α )/α k/(+k) 0,3 0, 0, 0,0 0,0,0,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 0,0,0,0 3,0 4,0 5,0 α eller k 5
Asymmeriske opper I våre uledninger har vi hiil ana a oppene kan beskrives ved hjelp av normalfordelingskurver. I praksis kan oppenes symmeri avvike beydelig fra normalfordelingen, og vi har såkale asymmeriske opper. Kjene asymmeriske former kan være: Haledannelse ( ailing ): Dee fenomene gjenkjennes ved a en opp har e mer eller mindre ydelig eerslep. Fenomene skyldes a noen molekyler innenfor den samme soffraksjon blir hold krafigere igjen i kolonnen enn de øvrige molekylene. Dee resulerer i en forskyving av elueringsiden mo lengre oppholdsider for noen molekyler. Haledannelse observeres gjerne i sysemer hvor de kan inngås hydrogenbindinger mellom analy og sasjonærfase. Froning: Her passerer noen av molekylene innenfor en soffraksjon raskere gjennom kolonnen enn de øvrige molekylene. Fenomene skyldes a noen molekyler får mindre ineraksjon med sasjonærfasen enn forvene. Froning oppsår vanligvis i sysemer der en for sor mengde soff påsees kolonnen, slik a reensjonskapasieen overskrides i den førse delen av kolonnen. Asymmerien il opper beskrives ved hjelp av asymmerifakoren A S. Asymmerifakoren besemmes ved å måle avsanden mellom oppens maksimum og oppens forkan og bakkan ved 0% opphøyde. Dee er vis i figuren under. A S = b/a a og b måles ved 0% opphøyde a b Asymmerifakoren bør hels ligge e sed mellom 0,9 og, for aksepabel kromaografering. 6