Flowcytometri ved PNH

Transkript

1 Einar K. Kristoffersen Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin Haukeland Universitetssykehus

2 Paroksysmal noctural hemoglobinuri: PNH Klonal stamcelle mutasjon i pig-a genet Glykosylfosfatidylinositol forankring, GPI defekt Partiell: type II celler Komplett type III celler Erytroide, plater, hvite rekke Trombose, anemi, nyresykdom, dyspnoe, fatigue, magesmerter, svelgvansker, erektil dysfunksj, hemoglobinuri

3 GPI-bundne molekyl CD14 CD16b CD24 CD48 CD52 CD55 CD58 CD59 CD66b CD73 CD87 CD90 CD108 CD109 CD157 Alkalisk fosfatase

4 PNH: CD55 og CD59 Beskytter mot komplementaktivering Erytrocytter og plater Hemolyse og trombose

5 Når måle? Indikasjoner Cytopenier Aplastisk anemi, Myelodysplasi Trombose Venøse, atypiske, forhøyet LD Hemolytisk anemi DAT negative Hemoglobinuri uforklart

6 Metoder Komplement baserte Ham test & sukrose lyse test Kun hemolytisk PNH lav sensitivitet (spesifisitet) Hemagglutinerende Gelkort: manglende agglutinering av antistoff Flowcytometri

7 Preanalytiske momenter Transporttid Perifert blod mer egnet enn benmargsaspirat Merking av celler Lyse før merking Merking før lyse Merking uten lyse

8 Hvilke celler? Røde Granulocytter Monocytter Lymfocytter Plater

9 Gating strategier Lysbrytning i flowcytometeret Lav-vinkel og høy-vinkel brytning CD45 og høy-vinkel brytning Multiparameter antistoff merking

10 granularitet Scatterplot av normalt blod granulocytter monocytter anti-cd45 lymfocytter

11 Flowcytometrisk undersøkelse: røde Madkaikar et al. 2009

12 Hillmen, Hall & Richards 2003

13 Multiparameter flow m/antistoff Hillmen, Hall & Richards 2003

14 FLAER FLAER: bakterielt aerolysin Binder spesifikt til GPI-anker Lysere cellen Inaktiv fluorescent FLAER Kvantitering av leukocyt PNH-kloner Ikke erytrocytter Høy sensitivitet

15 Multiparameter flowcytometri m/flaer Ett glass Identifisere monocytter og granulocytter CD33 og CD45 Måle GPI molekyler FLAER og CD14 FITC PE PC5 ECD FLAER CD33 CD14 CD45 Sutherland et al. 2007

16 FITC PE PC5 ECD FLAER CD33 CD14 CD45 Sutherland et al. 2007

17 FITC PE PC5 ECD FLAER CD33 CD14 CD45 Sutherland et al. 2007

18 FITC PE PC5 ECD FLAER CD33 CD14 CD45 Sutherland et al. 2009

19 Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B: (2010)

20

21

22 Pacific Pacific FITC PE APC Blue orange CD14 CD45 FLAER CD33 CD36 Flowcytometri m/flaer PNH granulocytter32% PNH monocytter6,6%

23 Pacific Blue Pacific orange FITC PE APC CD14 CD45 FLAER CD33 CD36 Flowcytometri m/flaer: Dag 2 PNH granulocytter29% PNH monocytter6,7%

24 Pacific Pacific FITC PE APC Blue orange CD14 CD45 FLAER CD33 CD36 Flowcytometri m/flaer: Dag 3 PNH granulocytter28% PNH monocytter4,8%

25 Pacific Pacific FITC PE APC Blue orange CD14 CD45 FLAER CD33 CD36 Flowcytometri m/flaer: Dag 4 PNH granulocytter21,6% PNH monocytter2,1%

26 Fortynning 1:15 1:100 1:500 1:2500 PNH granulocytter 2,2 0,3 0,06 0,02 PNH monocytter 0,7 0,09 0,03 0,01

27 UK NEQUAS FLAER QC-study

28 UK NEQUAS

29 Pacific Blue Pacific orange FITC PE PerCP Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 CD45 FLAER CD64 CD15

30 Pacific Blue Pacific orange FITC PE PerCP Cy5.5 PE- Cy7 APC CD45 FLAER CD36 CD33 CD15 APC- H7

31 Modifisert multiparameter flow? Ved spørsmål om PNH-klon P. Blue P. orange FITC PE PCPCy5. 5 PE-Cy7 APC APC-H7 CD14 CD45 FLARE CD163 CD34 CD33 CD15 CD24 Ved utredning for AML/MDS/cytopeni Pacific Blue Pacific orange FITC PE PerCP Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 HLA-DR CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 HLA-DR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 IREM2 CD14 Ved oppfølging/eculizumab terapi FITC CD59

32 Pacific Blue HLA- DR Pacific orange Multiparameter flow/euroflow FITC PE PerCP Cy5.5 PE- Cy7 APC APC-H7 CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 PNH granulocytter32%

33 Pacific Blue Pacific orange Multiparameter flow/euroflow FITC PE PerCP Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 HLA-DR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 IREM2 CD14 PNH monocytter7,8%

34 Modifisert multiparameter flow? Ved spørsmål om PNH-klon P. Blue P. orange FITC PE PCPCy5. 5 PE-Cy7 APC APC-H7 CD14 CD45 FLARE CD163 CD34 CD33 CD15 CD24 Ved utredning for AML/MDS/cytopeni Pacific Blue Pacific orange FITC PE PerCP Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 HLA-DR CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 HLA-DR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 IREM2 CD14 Ved oppfølging/eculizumab terapi FITC CD59

35 Anti-C5 monoklonalt antistoff Hindrer dannelse av det lytiske komplekset Stopper hemolyse Hva skjer med PNH-klonen(e)?

36 Eculizumab effekt på PNH klon Richards et al. 2007

37 Jente 9 år MDS, Refract Cytopenia