Flow cytometri ved akutt leukemi

Transkript

1 Flow cytometri ved akutt leukemi Anne Dorthea Bjerkenes Rø Overlege Avdeling for Immunologi og transfusjonsmedisin St Olavs Hospital 1 Disposisjon Hva er akutt leukemi Hvem rammes og hva er overlevelsen Hva er flowcytometri Flowcytometri ved diagnostikk og oppfølging av akutt leukemi Kasus 2 1

2 Akutt leukemi Ukontrollert vekst av umodne blodceller X X X 3 Akutt lymfatisk leukemi ALL Lymfoide progenitor celler B-ALL eller T-ALL ( >20% lymfoide blaster i marg ) 3.3/ barn(<15 år) pr år debutalder 2-4 år Gutter>jenter >90% overlevelse BB T 4 2

3 ALL -overlevelse Overall survival of childhood ALL patients treated at St. Jude Children's Research Hospital trials between 1962 and Robison L L Hematology 2011;2011: by American Society of Hematology 5 ALL- Norden Nordic Society of Pediatric Haematology and Oncology 6 Schmiegelow K et al. Leukemia 2010: 24:

4 Akutt Myelogen leukemi (AML) Myeloide progenitor celler ( >20% myeloide blaster i marg ) 3/ voksne pr år Median debut alder 69 år 5 års overlevelse 30-40% 7 AML -overlevelse (A) Age 15 to 59 years (B) 60 or more years. J Clin Oncol 2011: Therapeutic 8 Advances in Acute Myeloid Leukemia Alan Burnett, Meir Wetzler, and Bob Löwenberg 4

5 Akutt leukemi -aldersfordeling Fiegl M. 9 (2016) Epidemiology, pathogenesis, and etiology of acute leukemia. In: Hiddemann W. (eds) Handbook of Acute Leukemia. Adis, Cham Diagnostikk og klassifikasjon av akutt leukemi Klinikk Morfologi Cytogenetikk Akutt leukemi Flowcytometri Molekylærdiagnostikk 10 5

6 Behandling og langtidseffekter Prognostiske faktorer Alder Cytogenetikk Behandlingsrespons Behandling Kombinasjon av cytostatika Stamcelle transplantasjon Nye immun: antistoff, CAR-T Langtidseffekter Reduserte levealder Residiv av leukemi Sekundære kreftformer(hud, CNS, bryst, ben, tyroidea) Hjertetoksistet Neurotoksistet Øke kurasjon og begrense langtidseffekter 11 Flow cytometri Måling av celler i væskestrøm Karakterisere proteiner som er uttrykt på overflaten, i cytoplasma eller i kjernen på celler 12 6

7 merking 1)Pasientens celler 2)Antistoff mot CD19 FITC -merket 3)Alle B-lymfocytter er merket med anti- CD19 4)Avlesning i Flowcytometer Y Y + = Y Y Y Y 13 CD19 Flowcytometri Rask - timer Enkeltceller - millioner celler analyseres Mange parametre Størrelse, Granularitet, Flere markører simultant Cellefordeling: for mange? For få? Linje: Lymfocytt, monocytt, granulocytt Modenhetsgrad Unormale celler? Asynkront Over/underekspresjon «Cross-lineage» Detaljert immunfenotype av de leukemiske cellene 14 7

8 Hvorfor flowcytometri ved leukemier Viktig informasjon ved igangsetting av behandling Prognostisk viktig Bidra til å vurdere behandlingseffekt Vurdere residiv Øke kurasjon og begrense langtidseffekter15 Måling av restsykdom - MRD MRD som responskriterie MRD oppfølging Standard for ALL Standard for AML? Molekylær MRD hvis molekylære markører Flow MRD hvis ikke molekylære markører Vurder endret behandling hvis MRD + eller MRD øker 16 van Dongen, JMM et al. Blood 2015 Schuurhuis GJ et al Blood

9 MRD i ALL IBFM study group: 240 pt MRD - PCR Relapsfree survival NOPHO-92 protokoll 70 pt på Karolinska MRD Flowcytometri Diseasefree survival Van Dongen JJM et al: Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia in childhood: Lancet 1998 Bjørklund E et al: Flow cytometric 17 follow-up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in children with acute lymphoblastic leukemia MRD i ALL Long-term follow-up in childhood ALL patients, classified according to MRD measurements. (A) ALL International BFM (B) ALL INTERFANT-99 (C) BCP-ALL AEIOP-BFM 2000 (D) T-ALL AEIOP-BFM-ALL van Dongen, JMM et al. Blood

10 MRD AML HOVON/SAKK AML 42A 517 pt år Cumulativ relaps risiko NOPHO pt 2-18 år Eventfree survival Terwijn M et al ; : High Prognostic Impact of Flow Cytometric Minimal Residual Disease Detection in Acute Myeloid Leukemia: J Clin Oncol 2013 Tierens A et al; Residual 19 disease detected by flow cytometry is an independent predictor of survival in childhood acute myeloid leukaemia; results of the NOPHO-AML 2004 study, BJH 2016: Metoder Cytogenetikk RT-PCR eller NGS Sensitivitet 10-4 til 10-6 Flow >50% kan følges Sensitivitet 10-4 til? 90% har en LAIP «leukemiassociated phenotype» og kan følges NB - blodtilblanding! Hematology Am Soc Hematol Edu P 2016:MRD in AML: does it 20 already guide therapy decision-making? Ossenkoppele G, Schuurhuis GJ, Nat Rev Clin Onc 2013:Minimal residual disease in acute myeloid leukemia ; Hourigan CS, Karp JE, 10

11 Anbefaling for flow cytometry Panel: Minimum 8 farge med anbefalte markører Validerte panel og harmonisert/standardisert Flowcytometer MRD nivå : 0,1% AML ( 0,01% ALL) to 1 million Leukocytter Prøvetaking: 5-10 ml, first pull for MRD assessment. Diagnose, etter 2 sykler og sluttevaluering MRD i perifert blod er ikke validert 21 Falske negative Immunfenotypinger Celletap Få maligne celler Mulige løsning: Analysere flere celler og flere markører Populasjonen er vanskelig identifiserbar Eks: AML uten avvikende markører Mulige løsning: Flere markører 22 11

12 Granulocytter Monocytter Erytroide Lymfocytter 23 Normal Granulocytter Monocytter Erytroide Lymfocytter 24 12

13 Noen viktige punkter å se etter Linjemarkører: Myeloide : cympo, CD13, CD15, CD33 B-lymfoide: cycd79, CD19, CD22 T-lymfoide: cycd3 (CD2, CD5, CD7) Erytroide:CD235 (GPA), CD71, CD36 Megakaryocytter: CD41, CD42, CD61) Umodne markører /modne markører Umodne, CD34, CD117 CD11b, CD14, CD16, CD64, kappa, lambda Avvikende «cross-lineage» Modne og umodne markører samtidig For sterkt eller for svakt uttrykk 25 Kasus A: Mann, 45 år MDS utvikling siste 2 år. Når fallende verdier. Anemi, trombocytopeni, Siste dager, Feber, magesmerter, slapp Linje tilhørighet? 26 13

14 Kasus A: Modning? CD CD34 Kasus A: Modning? 28 Cytometry B 2004van Lochem E et al, 14

15 29 Cytometry B 2004: van Lochem E et al, Kasus B: Gutt, 5 år Tidligere frisk Luftveisinfeksjoner siste 3 uker Leukocytose - Leukocytter 33, Cytopenier: Hb 4,4, Nøytrofile 0,5, Trc 30 XX X 30 15

16 Kasus B: Linje tilhørighet: Modning: Avvikende Markør: 31 B-celle differensiering 32 van Lochem EG, et al. Cytometry B Clin Cytom

17 Normal Granulocytter Monocytter Erytroide Lymfocytter AML B-ALL T-ALL 33 Normal marg i regenerasjon Gutt 14 år, AML 34 17

18 Normal marg i regenerasjon Gutt 14 år, AML Normal marg i regenerasjon CD117 CD117 CD123 CD25 CD34 Jente 18 år, AML Primær febr CD123 CD /ca 30 d 13% mars ca d 60 0,7% slutten av mars april beg celler av CD34 18

19 Normal marg i regenerasjon CD117 CD117 CD123 CD25 CD34 Jente 18 år, AML Primær febr CD123 CD /ca 30 d 13% mars ca d 60 0,7% slutten av mars april beg celler av CD34 Kasus Primær AML D22 13% 2mnd 0,7% 2mnd+1uke 0,3% 277 celler av mnd neg < 0,1% Diagnose D22: 2 mnd 2mnd +1 uke 5mnd CD123 CD34 CD25 CD

20 Leukemiceller i spinalvæske Ved diagnose Etter behandling HLA-DR HLA-DR CD13 CD33 CD117 CD33 CD3 +CD14 CD13 CD33 39 CD117 CD33 CD3 +CD