LEUKEMIER. Klassifisering og Diagnostisk immunfenotyping. Leukemi

Transkript

1 1 LEUKEMIER Klassifisering og Diagnostisk immunfenotyping Leukemi 2 Klonal sykdom av hematologiske stamceller. Deling av den leukemiske stamcellen fører til opphopning av umodne blodceller og hemming av de friske stamcellene. Kan fører til benmargsvikt med bl.a: lave trombocytter-blødning lav Hb Infeksjonstendens Generell sykdomsfølelse, fatigue 1

2 Hvor begynner vi? WHO- klassifikasjon 3 EiKKr Kreftregisteret Nye tilfeller

3 Klassifisering av leukemier 5 FAB - Fransk-Amerikansk-Britisk gruppe(1976) basert på morforlogi og immunhistokjemi. EGIL - European Group for Immunolgisk klassifisering av leukemier, 1995?- basert på immunfenotype. WHO 2008 Stor internasjonal arbeidsgruppe. Basert på morfologi, cytogenetikk, molekylærgenetikk og flowcytometri. (REAL -klassifisering av lymfoid neoplasi 2004) Leukemi inndeling 6 Akutte leukemier -AML Akutt Myelogen Leukemi (barn og voksne) -ALL Akutt Lymfoblastisk Leukemi (barn og voksne) Lymfoblastlymfom (voksne) Kroniske Leukemier -MNP Myeloproliferative Neoplasier KML Kronisk Myelogen Leukemi (voksne) -Lymfoproliferative sykdommer KLL Kronisk Lymfatisk Leukemi (eldre voksne) MDS Myelodysplastisk syndrom 3

4 FAB-klassifisering 7 AML Mo- udifferensiert M1- uten modningstegn M2- med modningstegn M3- hypergranulær promyelocytt ALL L1- cytoplasmafattige, små blaster L2- mer heterogent med henblikk på cytoplasmarikdom og størrelse L3- blaster med basofilt vakuolisert cytoplasma M4- myelomonocytt M5- monoblast M6- erytroleukemi M7- megakaryoblast Andre sjeldne (eosinofili, NKcelle) EGIL/FAB klassifikasjon av AML 8 Best Practive & Research Clin Haemat, 2003, 561 4

5 EGIL-klassifikasjon av B-ALL 9 Best Practive & Research Clin Haemat, 2003, 561 EGIL-klassifikasjon av T-ALL 10 Best Practive & Research Clin Haemat, 2003, 561 5

6 WHO klassifisering av AML 11 AML med genetiske abnormaliteter 9 undergrupper AML med myelodysplasi relasjon AML behandlingsrelatert AML NOS (not otherwise specified) 11 undergrupper Myeloid sarcoma Myeloid proliferasjon relatert til Downs syndrom 2 undergrupper WHO klassifisering av ALL Precursor lymfoid neoplasi 12 B lymfoblastisk leukemi/lymfom NOS B lymfoblastisk leukemi/lymfom med genetiske abnormaliteter. 7 undergrupper T lymfoblastisk leukemi/lymfom 6

7 13 Acute leukemias of ambiguous lineage AUL, akutt udifferensiert leukemi MPAL, Mixed Phenotype Akutt leukemi (bifenotypisk) 5 undergrupper Morfologi 14 MGG Auerstaver Myeloperoxidase Monocytt - esterase 7

8 Eksempel på ulike teknikker 15 A: MGG farging B/M utstryk B: Flowcytometri C: Cytokjemi D: Cytogenetikk E: Molekylærgenetikk: FISH Blood, ; Hva er flowcytometri? 16 Måling av celler i væskestrøm Cellestørrelse Celleform Kompleksitet Fluorescens Karakterisere proteiner som er uttrykt på overflaten, i cytoplasma eller i kjernen på celler. 8

9 Hva kan måles med flowcyometri? Beinmarg ALL Perifert blod 9

10 19 Hvordan Antistoff / antigenbinding Lysspredning Fluorescens Antistoff / antigenbinding 20 Cellulære antigen Membran receptor Nucleære antigen Cytoplasmatiske antigen Antistoffer Monoklonale antistoff konjugert med fluorokrom (f.eks FITC, PE osv.) CD-markører 10

11 Lysspredning FCS/SSC 21 Malign populasjon? Fluorescens Hvert fluorokrom har sitt spesifikke exitasjon- og emmisjonsspekter 22 11

12 Fluorescens intensitet 23 Fluorokromer 24 Flere lasere: Opplysning om inntil 10 parametere på hver celle Laser BD Horizon V450 (Em-Max 448 nm) Pacific Blue (Em-Max 452 nm) AmCyan (Em-Max 491 nm) BD Horizon V500 (Em-Max 500 nm) Alexa Fluor 488 (Em-Max 519 nm). FITC (Em-Max 520 nm) R-PE (Em-Max 578 nm),. PE-Texas Red (Em-Max 615 nm) Texas Red (Em-Max 620 nm) APC (Em-Max 660 nm), PE-Cy 5 (Em-Max 667 nm) Alexa Fluor 647 (Em-Max 668 nm). PerCP (Em-Max 678 nm) PerCP-Cy 5.5 (Em-Max 695 nm) Alexa Fluor 700 (Em-Max 723 nm). APC-Cy 7 (Em-Max 785 nm) APC-H7 (Em-Max 785 nm) PE-Cy 7 (Em-Max 785 nm) 12

13 25 Flowcytometrisk Immunfenotyping Benmarg SSC/FSC-gating SSC/CD45-gating Eosinofile Granulocytter Granulocytter Monocytter Lymfocytter Erytroide forstadier Erytroide forstadier Blastregionen Monocytter Lymfocytter Liv T.N. Osnes 26 Normal benmarg vs AML vs ALL Normal AML ALL ALL Grønn populasjon :Blaster M H Fenstad 13

14 Immunfenotype 27 Avvik fra normalmønster Linjetilhørighet av patolologisk populasjon Lymfoid B eller T, Myeloid Akutt eller kronisk Subklassifisering - betydning for behandling/prognose Markørkombinasjoner viktig for oppfølging av MRD Immunfenotyping av leukemi 28 Konsensuspaneler NOPHO/NFCG (nordisk samarbeid) Felles 6-farge-panel for B-ALL og T-ALL til diagnostikk og MRD deteksjon Fra 2008 har FCM-MRD-funn behandlingsmessig konsekvens EMN02 Myelomatose MRD European Myeloma Network (2012) EuroFlow Juni-09: Forslag til 8-farge-FCM-paneler for de aller fleste diagnoser (www. EuroFlow.org) 14

15 Panel for screening 29 8-farge Screening Etikett: Dato: Materiale: Sign lege(r): Prøve tatt: kl: Prøve analysert: kl: WBC: x10 9 /L WBC/analyserør: x10 6 /rør Kommentar: Filene exportert til X:\ Sign bioing: Ekstra Rør FITC µl PE µl CD8 og 2,5 CD56 og 2,5 1 Lambda 5 kappa 5 Antistoff kombinasjon PerCP- CY5.5 µl PE-Cy7 µl APC µl APC-H7 APC- Cy7 µl CD19 og TCRgd 2,5 CD3 2,5 CD38 2,5 P B / HRZ V450 µl HRZ V500 µl Antall events CD20 og CD4 2,5 CD45 2, (LST) 2 CD36 5 CD64 10 CD34 5 CD117 5 CD33 5 CD14 5 HLADR 2,5 CD45 2, (rør 2 AML 3 cy MPO 5 cy CD79a 5 CD34 5 CD19 2,5 CD7 5 CD3 2,5 cy CD3 2,5 CD45 2, (ALOT) ALOT rør: Før merking må prøven lyseres vha Ammoniumklorid ( NH4Cl). Vask to ganger før vanlig prosedyre for intracellulær merking følges. Benytt intracellulær metode til antistoffer med rød skrift LST: Benytt 25 µl av mix, tilsett PerCP-Cy5:5, PE-Cy7 og APC-Cy7/H7 i tillegg Tilhører EQS-prosedy re 8482 "Immunfenoty ping v ed flow cy tometri" Immunologiske linjemarkører 30 Acute leukemia orientation tube (ALOT) (EuroFlow) ALL, AML, akutt udifferensiert leukemi B-celler CD19/CD79a T-celler CD7/CD3/cyCD3 Myeloide celler: cympo/ (CD13/CD33) Liv T.N. Osnes 15

16 Mistanke om leukemi 31 Erasmus MC, 32 Litt til nå.! 16

17 Leukemi-assosiert fenotype (LAPs) Umodne celler (eks CD34, CD117, TdT) Asynkron/abberant markør ekspresjon (eks: dobbelpositive CD13-CD7, CD13-CD19) Antigen overekspresjon Fravær av linjespesifikke markører (spes T-ALL CD7+/CD3-) Unormal lysspredning (FSC/SSC) 33 Minimal residual disease (MRD) 34 Molekylært/cytogenetisk/immunfenotypisk bevis for rest-sykdom Rest-sykdom kan ikke påvises ved vanlig mikroskopering (morfologisk remisjon:<5% leukemiceller) Flow cytometri Sensitivitet <0,01% (hvis nok celler) Abberant fenotype (viktig redskap i MRD oppfølging) 17

18 Flowcytometrisk immunfenotyping Identifisering av celletype B- vs T-celle, myeloid Moden vs umoden Myeloid vs lymfoid forstadium Kvantitering Mengde/dominans av maligne celler Karakterisering Abberante fenotyper Prognose Monitorering 35 Konklusjon Normal? + leg +arm + mouth + eyes FC Analysis: Abnormal! The legs don t go with arms, eye or mouth Decrease in eyes 36 18

19 37 Takk for oppmerksomheten! 38 19