ARBEIDSGRUPPE HELSEDIREKTORATET. Testing: ELISA OG WESTERN BLOT (Immunoblot) Min konklusjon

Transkript

1 ARBEIDSGRUPPE HELSEDIREKTORATET Testing: ELISA OG WESTERN BLOT (Immunoblot) En moderne Western blot som baserer seg på rekombinante in vivo antigener er å foretrekke da en her bruker spesifikke antigener som ikke reagerer med uspesifikt antistoff som kan dannes mot andre mikroorganismer. Hver antistoff som detekteres (bånd) har en bestemt tallverdi. En summerer og hvis tallet overstiger en viss sum som er fastlagt i prosedyren er prøven positiv. Selv om det er spesifikke antistoff en detekterer har de likevel litt variabel verdi. IgM anti OspC har så høy verdi at med bare dette antistoff er prøven klart positiv. For de andre trengs det to bånd. protein 18 (p-18) positivt forteller om det er en virulent (spesielt sykdomsfremkallende) stamme. Testen kan også fortelle om det er tidlig eller sen sykdom. Man kan også antyde hvilke genospecies som gir infeksjon.( kilde, Brorson) Denne Western blot kan være mer følsom enn Elisa på grunn av in vivo antigener som ofte ikke finnes i Elisa testene, og den har flere antigener fra alle 4 genospecies.(kilde Brorson) Det bør ikke tolkes feil hvis retningslinjene følges. Elisatesten inneholder mange antigener av bakterien (et sonikat av hele bakterien) som er dyrket i kunstig medium (in vitro) Enkelte Elisatester er tilsatt enkelte in vivo antigener fra flere genospecies. Disse er da mer sensitive enn de tradisjonelle som bare baserer seg på "en suppe" av hele bakterien. Elisatesten kan bare si om prøven er positiv eller ikke, man kan ikke se hvilke antistoffer (bare frie)som er tilstede, og dermed ikke om det er spesifikke antistoffer (genospecies.) Genotyper er undergrupper av genospecies (B.afzelii, B. garinii, B. sensu stricto, B. spielmanii) og siden Elisatestene vanligvis baserer seg på kun en genospecies er det sannsynlig vanskeligere å fange opp alle genospecies og undertypene av bakterien. Mikrogen rekombinant immunoblot er basert på alle 4 sykdomsfremkallende genospecies og spesifikke in vivo antigener. Disse er recombinante antigener og derfor helt "rene". Disse antigener forekommer ikke eller i liten grad i Elisa tester, så det da mulig å ha positiv western blot og negativ Elisa. (kilde: Brorson).Etter mitt syn blir det da feil å følge IDSA sitt krav om denne to- trinns prosessen. Derfor bør alltid western blot gjennomføres og vektlegges hvis Elisatesten er negativ og det er klinisk mistanke om borreliose. falske positive tester Elisa

2 IDSA, CDC og ILADS sine guidelines er enig i noe når det gjelder falske verdier. Alle er enige om at falske positive Elisa tester kan skje når mononucleose og revmatologiske lidelser kan kryss reagere med borrelia antigenet. (spesielt IgM) Nå det gjelder falske positive Elisa kan det fortsatt forekom, da det er en blanding av alle Borrelia antigenen i de fleste Elisa tester. Her er p-41 (flagellinet) et av antigenene. Det er imidlertid flere bakterier og også virus som kan danne antistoffer mot dette antigen, og hvis det er tilstrekkelig antistoff tilstede vil prøven bli positiv. (Imidlertid hos enkelte pasienter kan p-41 være det eneste antistoff over flere mnd. i første del av infeksjonen. Western blot IDSA, CDC og ILADS sine guidelines er også enige her. Alle er enige om at andre spirocheter, som syfilis og liptospira og andre treponema infeksjoner, kan kryss reagere med borrelia i western blot. (p-41) Western blot kan gi falske positive verdier hvis man har rheumafaktor i serum. Det er mulig å felle dette ved å gjennomføre en ana/dna/rheumatoid factor screen. Derfor er ikke dette et stort problem.(disse tingene du nevner er ikke noe problem med en rekombinant immunoblot, det er kun EBV infeksjon som kan gi svak positiv IgM pga polyklonal stimulering av B-celler. EBV-infeksjon etableres vanligvis i barndom eller i ungdomstiden) Imidlertid er det spesifikke bånd til borrelia antigenet som synliggjøres i western blot. Disse er p-18, OspC, OspA, p-39, (p-41), p-58, VlsE og p-100. Man krever ett visst antall bånd for å regne som positive for å erklære testen som positiv. Dette vil gjøre det enklere å vurdere testene. Elisa testen har større risiko for falsk positiv enn western blot. (Immunoblot regnes som gullstandard) Falske negative tester dominerer Den første immun responsen er IgM. Problemet er at vedvarende IgM er typisk i kronisk syke (kilde, Tom Grier). Problemet er også at fraværende IgM betyr ikke helbredelse av borrelia. Utfordringen ligger i å sørge for å ha analyse verktøy som fanger opp de fleste stammer av borrelia. (Borrelia er en utrolig hetrogen bakterie antigenmessig) Derfor er det livsfarlig å hentyde at Elisa er gode nok. Lori Bakken ms/mph gjennomførte en dobbel blind studie som viste at ikke bare var Elisa unøyaktig mellom konkurrerende laboratorier, men det samme laboratoriet viste forskjellige resultater på samme prøve! Bare 45 laboratorier hadde en score på 55%.

3 En annen studie ble gjennomført av College of American Patholigists. Resultatet var forferdelig. Det var tilsvarende likt antall falske positive som falske negative. 45% Av de 516 laboratorier som ble testet, viste riktig svar. Det er derfor viktig å sørge for å benytte riktig fremgangsmåte (ref Sykehuset i Vestfold) for å eliminere de fleste unøyaktigheter. (de testene vi bruker er kommersielle som brukes i andre land, men de baserer seg på ulike genospecies. Ved utredninger bruker vi 3 ulike Elisa og en immunoblot) Western blot lager ett kart av antistoffer immunsystemet produserer mot bakterien. Mot borrelia produseres det spesifikke antistoffer som18,23-25,31,34,39, 58, VlsE, 100. Disse båndene representerer antistoff respons til ett gitt protein Borrelia som bakterien har. P-41 båndet indikerer et antistoff til flagella 41 kda og kan være uspesifikk. Kan kryss reagere med andre spiroketer. Så falsk positiv av de spesifikke bånd er meget sjeldent. Oppfordrer til å finne dokumentasjon på dette området, hvis det eksisterer.(wilske Bettina) (Det er bare IgM OspC som har høy nok verdi til å være positiv alene.) Når det gjelder falsk negativ er historien en helt annen. Det er en myte at det er både falske positive og negative verdier. Falske negative dominerer fullstendig og falske positive er ytterst sjeldent.( I noen tester er det noen falske positive Elisa IgM og gråsone IgG, disse bør derfor konfirmeres med immunoblot). Dette forholdet må man ta innover seg! Årsaken til falske negative resultater er mange, bakterien manipulerer med immunapparatet vårt slik at vi ikke danner antistoffer, antistoffer dannes svært sent i forføpet, frie antistoffer kan være festet til antigener i såkalte sirkulerende immunkomplekser, bakterien kan ligge i nisjer, intracellulært, i organer hvor bakterien er gjemt for immunapparatet og bakterien omdannes til cysteformer med nye antigener, som ikke finnes i de tilgjengelige tester idag. De testene som brukes idag er ganske spesifikke så falske positive er ikke noe stort problem, men falske negative derimot er problematisk. Det er derfor klinikk og anamnese er så viktig i totalvurderingen. Western blot bør vektlegges fremfor Elisa som indirekte test. Følsomheten har vært diskutert vedrørende western blot, men spesifikke bånd i testen bør være en klar indikator på borrelia smitte. Oppfordrer arbeidsgruppen til å hente frem dokumentasjon på følsomheten på de spesifikke borrelia båndene for å bekrefte overfølsomhet som dermed gir falske svar. Elisa er svakest av disse testene. Den er billigst å gjennomføre, men det skal ikke være grunnlag for prioritering. Den har klare svakheter og er ikke bra nok som helseministeren har inntrykket av. Western blot, som indirekte test, må finansieres så testen blir prioritert. ( Siden immunoblot er svært arbeidskrevende og kostbar kan ikke denne test utføres på alle pasienter ( vi har borreliaundersøkelser i året, det ville i så fall kostet oss 3.5 millioner), En eller helst to følsomme Elisa etterfulgt av immunoblot på alle IgM og svake positive IgG. Negative Elisa med klinisk mistanke utføres immunoblot IgG og IgM. Selv ikke immunoblot detekterer alle borreliainfeksjoner og da kommer de cellulære tester inn.

4 Professor og immunolog Tor Lea hevder at 0.4% av befolkningen ikke danner antistoffer. Dette kommer da i tillegg til de ovennevnte problemer.) Statistikk De skrives at i stadium I av sykdommen detekterer Elisa 20-50% av tilfellene og i stadium II/III % alt avhengig av hvilke tester som brukes. Enkelte hevder at følsomheter i stadium II/III ikke er mere enn 20-80%. De testene som brukes på spinalvæske i Norge i dag detekterer ikke mere enn 61% (83% for garinii og 10% for afzelii.(afzelii er den hyppigste stamme som sirkulerer i Norge) (kilde, Brorson)Strle F et al Comparison of findings for patients with Borrelia garinii and Borrelia afzelii isolated from cerebrospinal fluid. Clin Infect Dis. 43: Indikator tester for borrelia CD57 test Hvis Borrelia antistofftester gir usikre svar, kan man ved mistanke for borrelia gjennomføre en test for å sjekke NK celler gjennom CD57 test. Grunnen er at en undergruppe av nk cellene cd57 lymfocytter er kraftig redusert i kronisk borrelia. (kilde, Burrascano guidelines sixteenth Edition, Bioingeniøren juli 07).Disse blir regulert ned av cytokiner som TNF alpha. Siden kronisk syke produserer lite eller ingen antistoffer, så kan denne testen være til hjelp. Også forhøyede cytokinverdier er tydelig i kronisk borrelia. Disse testene bør være standard i diagnostikken av borrelia. (Bør være mulig å få undersøkt ved utredninger, kan ikke gjøres som rutineundersøkelse. En annen test som kan være aktuell er Melisa LTT (lymfocytt transformasjonstest), og Focus Floating Microskopi av biopsier) OPPSUMMERING ELISA OG WESTERN BLOT, ENDELIG KONKLUSJON Western blot er å foretrekke (helst recombinant) over Elisa. Grunner er at Elisa testen har større feilprosent som gir falske verdier. Western blot har mulighet til å skille falske verdier (kilde Carl Brenner).Elisa deler mange antigen med andre bakterier som dermed kan gi falske positive svar. Testen dekker heller ikke flere genotyper som borrelia bakterien representerer. Siden Elisa bare gjenspeiler kun frie antistoffer, har denne testen ikke mulighet til å oppdage antistoffer som er bundet i sirkulerende immunkomplekser(kilder, Brorson).

5 Western blot derimot, har evnen til å indirekte detektere antistoffer mot borrelia spesifikke proteiner som former seg som bånd. Recombinant western blot kan også antyde hvilke genospecies som gir infeksjon. B. afzelii er mer resistent an andre genospecies som kan bl a være til hjelp når man skal sette inn behandling. Western blot IgM og IgG gir synlig tegn på protein bånd, som baserer seg på molekylær vekt og intensitet. Når de spesifikke båndene mot borrelia er synlige samt en viss tallverdi er testen positiv. For å eliminere muligheten for falsk positiv (som rheumatoid factors),kan man gjennomføre ana/dna screening test som feller dette. (kilde, IGeneX, Brorson) Dette er ikke nødvendig for rekombinant immunoblot Man bør også teste Epstein Barr virus (mononucleose) som kan kryss reagere, men mest sannsynlig i Elisa er dette ett problem(igm,barn ungdom) Elisa mangler fullstendig sensitivitet (i tidlig fase av sykdommen) og bør ikke være en diagnostisk test alene. Western blot er den beste indirekte testen som må gjennomføres og vektlegges i diagnostikken av borrelia. Man kan ikke hevde at den er overfølsom uten vitenskapelige forklaringer. Når de spesifikke båndene presenteres, kan man ikke vurdere dette som noe annet enn borrelia. Utfra mitt syn er ikke Elisa bra nok. Western blot er mer troverdig i diagnostikken. (Men husk positiv immunoblot sier bare at det har vært eller er en infeksjon, antistoffer kan holde seg flere år etter overvunnet infeksjon) UTFORDRINGER Den største utfordringen man står overfor, er å finne frem til direkte påvisningsmetoder. Problemet er at disse testene ikke er sensitive nok. De mest naturlige direkte metodene for påvisning av borrelia er PCR, dyrkning og mikroskopi. Mikroskopi vil man se bakterien med det blotte øye og dermed være udiskutabel. En metode for dette ville gjort mye.(man kan se at det er spiroketer, men det må bekreftes med monoklonale antistoffer eller PCR hvilke Borrelia det er) DNA deteksjon er en annen udiskutabel metode. PCR benyttes som regel i en sånn sammenheng. Dessverre eksisterer det bare PCR tester i Norge i dag som ikke er sensitive nok til å detektere borrelia, og har derfor lite verdi for diagnostikken. Hvis man hadde utviklet primere og ekstraksjonsmetoder for å forbedre sensitiviteten, hadde man enklere fått et mer troverdig resultat. Man detekterer borrelia DNA og har mulighet til å gjennomføre en direkte sekvensering genospieces av borrelia bakterien. Man må altså finne rutiner for å hindre at testen blir utsatt for smitte,(dette er ganske godt ivaretatt i dag) noe som vil føre til at prøven blir for mye sensitiv. Det finnes laboratorier i europa i dag som har gode PCR prosedyrer. (Ved PCR bør man bruke multiplex PCR (med flere primere) da ulike gener uttrykkes ved infeksjon i ulike vev og organer, dessuten er det andre primere som egner seg best til cyster. Dette må det imidlertid forskes mer på, men vi har gjort en del arbeid i Tønsberg) Vi har flinke nok borrelia forskere i Norge som kan utvikle tilsvarende. Da må det bli finansiert. Det følger ikke med penger til utvikle tester i Norge har jeg inntrykket av. (Dette er forskning) Økonomi teller for alle reelle borrelia tester. Eivind Markhus