Mer om gensøk. Kjapp oppsummering fra sist gang. Motif eller tilfeldig DNA forts. Motif eller tilfeldig DNA? Forelesning INF3350/

Transkript

1 Mer om gensøk Kjapp oppsummering fra sist gang Forelesning INF3350/ sept 2007 Ole Christian Lingjærde Gruppen for bioinformatikk Institutt for Informatikk, UiO To prinsipper for søking etter gener i DNA: Homologibaserte metoder Ab initio baserte metoder Forskjellige ab initio metoder for prokaryoter og eukaryoter. Vi skiller mellom to typer av ab initio metoder: Signalsøk (se etter spesielle signaturer) Innholdssøk (se etter regioner med spesielle statistiske egenskaper) Signalsøk for eukaryoter omfatter ofte søk etter motifer (spesielle signaturer som kan være mer eller mindre velbestemte). Metoder for motifsøk omfatter posisjonsvektmatriser (forrige gang) og HMM (i dag). 1 Innholdssøkemetoder for eukaryoter omfatter bl.a. søk etter CpG-øyer (forrige gang) og søk etter områder med overhyppighet av visse basetripler (i dag). 2 Motif eller tilfeldig DNA? Motif eller tilfeldig DNA forts. Posisjonsvektmatriser (PVM) og skjulte markov modeller (HMM) er begge basert på å spesifisere to sannsynlighets-fordelinger over alle mulige sekvenser S av lengde L: Pr(S motif) = sannsynligheten for å observe S i et motif = likehooden (troligheten) for at S er et motif Pr(S tilfeldig DNA) = sannsynligheten for å observere S i et tilfeldig-dna segment av lengde L = likehooden (troligheten) for at S er tilfeldig DNA 3 For å vurdere hva en gitt S er, ser vi på log-likelihood ratioen: Pr(S motif) LLR = log Pr(S tilfeldig DNA) Tre muligheter: LR > 0 : motif mer trolig enn tilfeldig DNA LR < 0 : motif mindre trolig enn tilfeldig DNA LR = 0 : motif og tilfeldig DNA like trolige I praksis vil vi kreve LR > c, hvor c>0 er en gitt terskel, før vi konkluderer at S er et motif. Valget av c avgjør sensitiviteten. 4

2 PVM eller HMM? Posisjonsvektmatriser Forskjellen mellom PVM og HMM ligger i hvordan man definerer de to fordelingene Pr(S motif) Pr(S tilfeldig DNA) Anta f.eks. L = 4 og S = CAGG: Pr( S motif ) = f f f f C1 A2 G3 G4 Pr( S tilfeldig DNA) = p p p p C A G G A C G T 1 f A1 f C1 f G1 f T1 2 f A2 f C2 f G2 f T2 3 f A3 f C3 f G3 f T3 4 f A4 f C4 f G4 f T4 I PVM er sannsynlighetene Pr(A), Pr(C), Pr(T), Pr(G) for å observere de fire basene i et motif posisjonsavhengige. I HMM er sannsynlighetene Pr(A), Pr(C), Pr(T), Pr(G) avhengige av hvilken base som er observert i posisjonen like til venstre for den. LLR = log f f f f p p p p C1 A2 G3 G4 C A G G f = log + log + log + log f f f p p p p C1 A2 G3 G4 C A G G 5 6 HMM = skjulte Markov modeller Skjulte Markov modeller forts. Posisjonsvektmatriser antar uavhengighet mellom basene i en sekvens (dvs hvilken base som opptrer i en gitt posisjon avhenger ikke av hvilke baser man har andre steder i sekvensen). Problem: virkelige motifer lar seg ikke alltid beskrive godt med en modell som antar uavhengighet mellom posisjonene. Skjulte Markov modeller tillater at sannsynligheten for å observere en bestemt base i en gitt posisjon avhenger av hvilken base man har observert like til venstre for dette. 7 Anta at hver base i sekvensen vi ser på er i en av to tilstander, f.eks. "kodende" eller "ikke-kodende". Anta at man med jevne mellomrom foretar tilstandstransisjoner, hvor det for hvert par av tilstander er en gitt sannsynlighet for en transisjon. Etter hver tilstandstransisjon emitteres en av nukleotidene A, C, G eller T med gitte sannsynligheter. Vi observerer bare de emitterte nukleotidene (dvs vi observerer en DNA-sekvens), ikke tilstanden til modellen (derav "skjult"). Vi ønsker å "gå baklengs" og rekonstruere tilstandstransisjonene for å finne ut når vi var i et kodende område og når vi var i et ikke-kodende område. 8

3 Definisjon av HMM Bruk av HMM Tilstander S 1, S 2,..., S N. Observasjonssymboler V 1, V 2,..., V M. Overgangssannsynligheter a = P( q = S q = S ) ij t+ 1 j t i Symbol-sannsynligheter b ( k) = P( V q = S ) j k t j Sannsynlighet for å starte i en gitt tilstand p = Pq ( = S) i 1 i q t = tilstand ved tid t 9 Gitt en observert symbolsekvens kan vi finne den mest trolige tilhørende tilstandssekvensen ved hjelp av Viterbialgoritmen: ACTGCG HMM S 1 S 1 S 2 S 2 S 2 S 2 Dvs vi kan gi hver observert nukleotid en etikett, f.eks. "kodende" eller "ikke-kodende" hvis dette er tilstandene. Gitt en tilstandssekvens kan vi finne sannsynligheten for en gitt symbolsekvens med forward-algoritmen: P(ACTGCG S 1 S 1 S 2 S 2 S 2 S 2 ) =... Dvs vi kan gi hver nukleotid en score relativt til den spesifiserte tilstandssekvensen. 10 Parameterestimering for HMM Kodonpreferanser For å bruke en HMM må vi først spesifisere modellen. Frekvensen av ulike kodoner er generelt forskjellig i kodende og ikke-kodende segmenter: Strukturen (antall tilstander, hvordan de er forbundet) kan modelleres på ulike måter. Generelt vil en unngå at alle tilstander er forbundet til alle andre, pga problemet med å finne gode parameterestimater. Parametrene (overgangssannsynligheter osv) kan bl.a. estimeres med Baum-Welch algoritmen, et spesialtilfelle av en generell maximum likelihood metode for estimering av "missing data" som kalles EMalgoritmen (EM = Expectation Maximization). noen aminosyrer brukes oftere enn andre i proteiner (Leu brukes mer enn Trp) antall kodoner varierer mellom aminosyrer noen kodoner brukes oftere enn andre til å kode en gitt aminosyre (f.eks. blir Ala oftere kodet som GCA, GCC eller GCT enn som GCG). Dette kan utnyttes til å avgjøre om et segment er kodende eller ikke

4 Kodonpreferansetabell for E.coli Analyse av kodonforekomster Aminosyre Kodon /1000 Kodonpreferansetabellen vi så på angir sannsynlighetene for at et kodende trippel skal være lik GGG, GGA, GGT,... Gly Glu GGG GGA GGT GGC GAG GAA Tilsvarende kan vi lage en kodonpreferansetabell som angir sannsynligheten for at tilfeldig DNA (ikke-kodende DNA) skal være lik GGG, GGA, GGT,... Gitt en sekvens S = GCTATGA... kan vi dermed finne sannsynlighetene for å observere S i et ikke-kodende segment P N (GCT) * P N (ATG) *... Asp GAT GAC et kodende segment P C (GCT) * P C (ATG) *... Må også ta hensyn til at det er ulike leserammer Algoritme (Codon Usage Method) Algoritme (forts.) Gitt: en sekvens q Velg: vindusbredden L = 3*m + 2 hvor m > 0 Definer vinduer: S i = q[1+i:l+i], i = 0, 1, 2,... Identifiser kodoner: Hvert vindu S kan dekomponeres i m kodoner s 1,..., s m på tre ulike måter, svarende til leseramme 1, 2 og 3: S = (s 11, s 21,..., s m1, S[L-1], S[L]) S = (S[1], s 12, s 22,..., s m2, S[L]) S = (S[1], S[2], s 13, s 23,..., s m3 ) Kodonene i leseramme 4, 5 og 6 fremkommer ved å reversere (dvs snu rekkefølgen på basene i) s 1,..., s m i Beregn: For hvert vindu S og for hver leseramme i = 1, 2,..., 6 beregnes PS ( k= i) P ( s ) P ( s ) P ( s ) Pk ( = i S) = = ( ) ( ) ( ) ( ) i i i C 1 C 2 C m 6 6 j j j P S k = j PC s1 PC s2 PC sm j= 1 j= 1 hvor hver av sannsynlighetene P C (.) kan finnes ved å slå opp i en kodonpreferansetabell for kodende regioner henholdsvis leseramme 1, 2 og 3.

5 Codon Usage Method Utgangspunktet for sekvensanalyse Genetisk informasjon overføres mellom individer: ved mitose ved meiose ved horisontal genoverføring (i første rekke hos prokaryoter) Overføringen er normalt nesten feilfri: mitose gir (nær) eksakt kopi av opprinnelig DNA meiose gir (nær) eksakt rekombinasjon av paternalt og maternalt DNA 17 Genetiske endringer skjer normalt langsomt: genetiske endringer som skyldes naturlige prosesser (evolusjon) erverves gradvis, slik at nært beslektede organismer har små forskjeller i DNA og fjernt beslektede organismer har større forskjeller i DNA. noen genetiske endringer (bl.a. horisontal genoverføring) kan bryte dette mønsteret men i mange tilfeller er dette uaktuelt og kan ses bort fra. 18 Konsekvens 1 Konsekvens 2 Kunnskap om DNA til ett individ har overføringsverdi til DNA for andre beslektede individer. Studier av gener og genprodukter i modellorganismer gir kunnskap som kan anvendes til å forstå f.eks. menneskets gener og genprodukter. Beslektet : har et felles evolusjonært opphav. Genprodukter : RNA og proteiner Kunnskap : hvordan DNA-sekvensen ser ut, hvilke gener den inneholder, hvilken funksjon genene har, hvordan organismen er bygget opp og fungerer på molekylært nivå. Overføringsverdien avhenger av hvor nært beslektet de er. Modellorganismer: organismer som er velegnet for laboratoriestudier (f.eks. pga kort livssyklus og lett tilgjengelighet) og som studeres ikke primært for sin egen skyld, men for å gi innsikt i biologiske prosesser som er eller antas å være felles for mange ulike organismer. Eksempler på modellorganismer: ulike mikrober (virus, bakterier, m.m.), bananflue, rundom, sebrafisk 19 20

6 Konsekvens 3 Eksempel: definisjon av en art Ved å sammenlikne DNA fra to organismer kan vi få innsikt i hvor nært beslektet organismene er. Arter er ofte definert som grupper av naturlige populasjoner som: forplanter seg (eller kan forplante seg) med hverandre gir forplantningsdyktig avkom Slike sammenlikninger kan være basert på hele genomene til organismene større eller mindre DNA-segmenter fra organismene er forplantningsmessig isolert fra andre tilsvarende grupper Eksempel: Forskjellene i DNA kan bestå i forskjeller i tilsvarende DNA-segmenter i de to organismene at visse DNA-segmenter bare forekommer i en av organismene Tiger og sebra kan ikke krysses de tilhører ulike arter. Tiger og løve kan krysses, men avkommet vil normalt være sterilt dermed tilhører tiger og løve ulike arter. Dette artsbegrepet er ikke egnet for klassifisering av f.eks. bakterier, og er ikke alltid uproblematisk for andre organismer heller. Alternativ: en DNAbasert artsdefinisjon. Liknende DNA = samme art Ulike typer evolusjon Homologe sekvenser Divergent evolusjon: nært relaterte arter blir gradvis mer forskjellige over tid (typisk som resultat av tilpasning til ulike omgivelser) Konvergent evolusjon: arter som ikke er relaterte utvikler trekk som er gradvis mer like over tid (typisk som resultat av tilpasning til liknende omgivelser eksempel hval og fisk skal begge bevege seg i vann) Koevolusjon: to (eller flere) arter utvikler seg i nær interaksjon med hverandre Definisjon: Vi sier at sekvenser er homologe hvis de er relatert (gjennom evolusjon) til samme opphav. Vi kan ikke snakke om grader av homologi; gitt to sekvenser vil alltid ett disse utsagnene være korrekt: sekvensene er homologe innbyrdes påvirkning sekvensene er ikke homologe TID Opprinnelig art Divergent evolusjon Opprinnelig art I Konvergent evolusjon Opprinnelig art II Opprinnelig art I Opprinnelig art II Koevolusjon 23 24

7 Tilgjengelige ressurser på nettet Hvordan få tilgang til databasene Databaser: Sekvensdatabaser (DNA, RNA, protein) Databaser med andre typer biologiske data Avledete databaser (basert på analyser av data fra databasene i punktene ovenfor) Databaser over markører (genetiske og fysiske kart) Databaser over gener og genetiske sykdommer Sekvensanalyse: Parvise sammenstillinger Multiple sammenstillinger Mønstersøk (motif-søk) Lokalisere gener i DNA-sekvenser Diverse analyseverktøy: Grafisk visualisering Predikere (= forutsi) sekundær- og tertiærstrukturen til et protein ut fra primærstrukturen (eller DNA-sekvensen)... og mye annet 25 Via spesifikke nettsider for hver enkelt database, f.eks. GenBank: Genethon linkage map: SWISS-PROT: OMIM: PFAM:... og mange, mange fler Via portaler (også kalt gateways): Entrez: Ensembl: UCSC genome browser: Disse portalene tillater bl.a. søk på tvers av ulike databaser og de integrerer informasjon fra ulike ressurser i framvising av resultater. 26 Eksempel på portal: Entrez 1) Vi oppgir et søkeord, f.eks. ADAM2 2) Vi trykker på GO 3) Vi får nå opp antall treff i de ulike databasene: 4) Vi klikker på databasen OMIM (gener og genetiske sykdommer hos mennesker) PubMed: 14 treff (Database over artikkelreferanser i biomedisin) Nucleotide: 11 treff (Søk i GenBank-databasen) SNP: 166 treff (Søk i dbsnp-databasen) 27 28

8 5) Vi velger denne ) Vi velger denne 6) Vi går tilbake til Entrez og velger Nucleotide i stedet 31 32

9 Eksempel på portal: Ensembl Vi velger Human Vi får opp en GenBank-post, med blant annet følgende informasjon: Oversettelse til proteinsekvens Polymorfier (genvariasjoner) DNA-sekvens Vi velger kromosom 12 Kjente gener GC repetisjoner SNPs Cytogenetiske bånd Vi peker her og klikker 35 36

10 Tilgang til analyseverktøy Sekvenssøk: Tilgjengelig fra Entrez, Ensembl og UCSC Hele kromosomet Utsnitt som dekker ca 1Mb = 10 6 baser Utsnitt som dekker ca 10 5 baser Analyseverktøy generelt: NCBI Tools: EBI Tools: ExPASy Tools: EMBOSS: + diverse andre steder Utsnitt som dekker ca 100 baser NCBI Tools EBI Tools 39 40