NGS-genpanel ved nevromuskulære sykdommer i Tromsø-hva er status? Toril Fagerheim, Dr.scient MED. GEN,UNN

Transkript

1 NGS-genpanel ved nevromuskulære sykdommer i Tromsø-hva er status? Toril Fagerheim, Dr.scient MED. GEN,UNN

2 Konklusjon

3 Nevromuskulære sykdommer- ideell for storskala-analyser Bred gruppe av sykdommer som omfatter: myopatier, dystrofier, ionekanalsykdommer, malign hypertermi Perifere polynevropatier, motor nevronsykdommer Spinal muskelatrofier, arvelige spastiske paraplegier ++ Ofte arvelige tilstander og ekstremt heterogent med mer enn 500 gener Mange subgrupper som hver er svært sjeldne og ofte alvorlige Affiserer pasienter med stor aldersspredning (barn til voksen)

4 Diagnostikk av sjeldne sykdommerunike muligheter nå! Sjeldne tilfeller gir utfordringer Få pasienter til klinisk sammenligning Lang utredningstid Mange spesialiteter involvert God klinisk beskrivelse er særdeles viktig Familiehistorie

5 DNA-analyser- «gammelmåten» MPZ, EGR2, LITAF, NEFL, PMP22, GJB1, MFN2, NEFL etc baser 2968 baser 2632 baser 4082 baser 1822 baser 1904 baser 4539 baser 4082 baser

6 Eksempel: diagnostikk av CMT- år 2009 Type Gen Metode CMT1A PMP22 MLPA CMT1B/CMT2I/CMT2J MPZ Sekvensering- 6 exon MPZ MLPA CMT1C LITAF Sekvensering- 4 exon CMT1D/CMT4E EGR2 Sekvensering- 2 exon CMT1E PMP22 Sekvensering- 4 exon CMTX1 GJB1 Sekvensering- 1 exon CMT1F/CMT2E NEFL Sekvensering- 5 exon CMT2A2 MFN2 Sekvensering- 19 exon MFN2 MLPA CMT4A/CMT2K GDAP1 Sekvensering- 6 exon

7 DNA-analyser- Storskalasekvensering «Next-generation sequencing» (NGS) Illumina MiSeq Illumina NextSeq Sluttproduktet fra NGS er det samme som ved tidligere sekvenseringsteknologi = DNA sekvenser FØR: Ett og ett gen av gangen NÅ: Pakke med 4813 gener assosiert med kjent sykdom (TruSight One) Fokuserer på eksoner i kjente sykdomsgener Genpaneler: Utvalg av gener som analyseres etter klinisk beskrivelse/diagnostikk

8 Nevromuskulær utredning Klinisk utredning Muskelstyrke Biokjemiske tester Elektromyografi (EMG) Nerveledningshastigheten (NCV) Muskelbiopsi: histologi og immunhistokjemi Genetisk test Pre-screening av enkeltgener NGS genpanel Genetisk test kommer kanskje tidligere inn i bildet, men er ikke nok! God klinisk beskrivelse er essensielt.

9 NMK-genpanel på UNN 249 gener plukket fra litteraturen og fra GeneTable of Neuromuscular disorders ( oppdatert desember 2015) Ekskludert rene motornevron- og LQTS-gener Lista er under kontinuerlig revisjon, gi gjerne tilbakemelding Dekning 112 gener med 100% dekning 100 gener > 95% dekning 37 gener < 95%

10 Bioinformatisk pipeline Illuminas pipeline: 150 bp paired-end sekvensering Burrows-Wheeler Aligner (BWA) Genome Analysis Toolkit (GATK) Filtrering og tolkning av varianter : Cartagenia Alamut Visual Klassifisering 1-5, klasse 3 er VUS (variant av usikker betydning) HGVS nomenklatur

11 Gennavn: AARS, ABCC9, ABHD5, ABHD12, ACADVL, ACTA1, ACVR1, ADCK3, AFG3L2, AGL, AIFM1, ALDH3A2, ALG13, ANO5, AP4E1, AP4M1, AP5Z1, APTX, AR, ARHGEF10, ASAH1, ATL1, ATM, ATP2A1, ATP7A, ATXN1, ATXN10, ATXN3, ATXN7, B3GNT1, BAG3, BEAN1, BIN1, BSCL2, C10orf2, C12orf65, CACNA1A, CACNA1S, CACNB4, CAPN3, CAV3, CFL2, CHKB, CLCN1, CNBP, CNTN1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, CPT2, CRYAB, CTDP1, CYP7B1, DAG1, DCTN1, DES, DMD, DMPK, DNAJB2, DNAJB6, DNM2, DNMT1, DPM1, DPM3, DYNC1H1, DYSF, EGR2 EMD, ENO3, ERBB3, ETFA, ETFB, ETFDH, EXOSC3, FA2H, FBLN5, FGD4, FGF14, FHL1, FIG4, FKRP, FKTN, FLNC, FXN, GAA, GAN, GARS, GBE1, GDAP1, GJB1, GJB3, GLE1, GNE, GTDC2, GYG1, GYS1, HARS, HEXB, HK1, HOXD10, HSPB1, HSPB3, HSPB8, HSPD1, HSPG2, IFRD1, IGHMBP2, IKBKAP, INF2, ISCU, ISPD, ITGA7, ITPR1, KARS, KBTBD13, KCNA1, KCNC3, KIAA0196, KIF1A, KIF1B, KIF21A, KIF5A, KLHL9, L1CAM, LAMA2, LAMP2, LARGE, LDB3, LDHA, LITAF, LMNA, LPIN1, LRSAM1, MARS2, MED25, MEGF10, MFN2, MPZ, MRE11A, MSTN, MTM1, MTMR2, MTPAP, MYBPC3, MYH2, MYH3, MYH7, MYH8, MYOT, NDRG1, NEB, NEFL, NGF, NIPA1, NOP56, OPA1, PABPN1, PEX7, PFKM, PFN1, PGAM2, PGK1, PGM1, PHKA1, PHOX2A, PHYH, PIP5K1C, PLEC, PLEKHG5, PLP1, PMP22, PNPLA2, PNPLA6, POLG, POLG2, POMGNT1, POMT1, POMT2, PPP2R2B, PRKAG2, PRKCG, PRPS1, PRX, PTRF, PYGM, RAB7A, REEP1, RRM2B, RTN2, RYR1, SACS, SBF2, SCN4A, SEPN1, SEPT9, SETX, SGCA, SGCB, SGCD, SGCE, SGCG, SH3TC2, SIL1, SLC12A6, SLC1A3, SLC22A5, SLC25A20, SLC25A4, SLC33A1, SLC52A3, SLC5A7, SMN1, SPAST, SPG11, SPG20, SPG21, SPG7, SPTBN2, SPTLC1, SPTLC2, SUCLA2, SURF1, SYNE1, SYNE2, TBP, TCAP, TDP1, TK2, TMEM43, TNNI2, TNNT1, TNNT3, TOR1A, TPM2, TPM3, TRIM32, TRPV4, TTBK2, TTN, TTPA, TTR, TUBB3, UBA1, VCP, VRK1, WNK1, YARS, ZFYVE26, ZFYVE27

12 Analysering via filtrering Typisk resultat: ca varianter Etter filtrering varianter: mange missens varianter (VUS) Mange nye varianter i nye gener Mange store gener med mange normalvarianter (TTN, NEB osv) Minimert utilsiktede funn

13 Ekspempel; alignment av LPIN1- genet

14 Strategi- 23 ulike NMK pasienter De vanligste genene var sjekket med Sanger sekvensering- ca 17% deteksjonsgrad på CMT pasienter (Østern et al., 2013) Nok kliniske opplysninger til å gjøre NGS Mange pasienter med kompleks fenotype som har vært i systemet svært lenge Analysering + TOLKNING og deretter verifisering av funn ved Sanger sekvensering og test av eventuelt andre familiemedlemmer

15 Resultater I 10 pasienter med sikre patogene funn DMD, SH3TC2, BSCL2, EGR2, DYNC1H1, GARS, LRSAM1, COL6A3, LPIN1 3 pasienter med funn i gode kandidatgener, ikke verifisert SCN4A, TRPV4, COL6A2 2 pasienter med funn i usikre kandidatgener i forhold til klinikk ARHGEF10, KIF5A 4 uten sikre funn- omkjøringer pga teknisk kvalitet 1 uten funn 3 med spesiell klinikk til full analyse av 4813 gener

16 Resultater I Funnprosent 35 % 9 % 13 % 43 % Sikker molekylær diagnose Gode kandidatvarianter Usikre kandidatvarianter Ingen funn/videre analyse Funn i mer enn 50% av pasientene (56.5%)

17 Resultater II- for restriktiv filtrering Pasient f med myoglobinuria med rhabdomyolyse Normal ved første analysering, men kliniker insisterte på ekstra sjekk i LPIN1 genet Homozygot for c.546delc p.(ser183alafs*6) i LPIN1 - genet Erfaringer med grenser for vår egen kvalitetskontroll (for konservativ)

18 Resultater III- overraskelser Pasientkasus Knapt 3 år gammel gutt fra Midt-Østen(?) med forsinket utvikling, gikk 21 mnd gammel, med høy CK etter hjertelungeredning (24000->7000) Hva skal vi teste? Etterspør mer informasjon Fra Gambia, ubeslektede foreldre, hjertestans etter pølse i halsen pga svelgvansker?, forsinket utvikling + congenitt muskeldystrofi? Hemizygot for c.10010g>a p.(cys3337tyr) i DMD genet Sannsynlig patogen, funnet i en DMD- pasient tidligere

19 Resultater IV Ikke alt er blitt fanget opp i tidligere ved Sanger sekvensering Pasient med CMT1 eller 2, usikker arvegang: Funn av homozygositet for c.798t>g, p.(tyr266*) i SH3TC2-genet (CMT4C)- recessiv CMT. Nye gener ikke alltid kjørt på gamle pasienter Stort etterslep. Må kontaktes og eventuelt nytt samtykke

20 Resultater- V Mange pasienter har vært mange år i systemet til utredning uten å ha fått stilt diagnose Gjennomsnittlig gener testet: 5.5 Antall testede gener 22 % 30 % 13 % 35 %

21 Pre-screeningsstrategi Muskeldystrofi (med økt CK): FKRP DMD -MLPA CMT: GJB1 PMP22- MLPA HNPP: PMP22 sekvensering og MLPA Myotoni: DMPK (DM1)- fragmentanalyse og RP/PCR CNBP (DM2) - fragmentanalyse og RP/PCR

22 Konklusjoner/lærdom Mye lettere å analysere enn exom Nye varianter vil utvide fenotypespekteret for mange sjeldne tilstander Få pasienter beskrevet til nå Få bedre genotype-fenotype forståelse NMK-genpanel kan være utilstrekkelig på pasienter uten klar NMK-fenotype Analysere i lag med foreldre eller utvide til exom

23 Husk også: NGS kan enda ikke detektere større delesjoner og duplikasjoner eller repeterte områder Ekspansjonssykdommer Supplerende metode som MLPA/SNP-array Supplerende analyser kan være nødvendig for å bevise patogenisitet Sjanse for falske positive funn er liten Verifisering med Sanger sekvensering Vær kritisk til databaser og litteraturen for bevis rundt seksvensvariant (HGMD, Clin Var osv.) Variantinfo fra store populasjonsdatabaser er viktig

24 Oppsummering De enkleste pasientene er allerede diagnostisert De vanskeligste kan ha veldig uklart klinisk bilde God klinisk beskrivelse og familiehistorie er essensielt Kommunikasjon mellom lab og kliniker er en stor fordel - videre analyser/tester, hint om spesielle gener Ingen nasjonale retningslinjer for klinisk bruk av NGS Kommer i forbindelse med persontilpasset medisin?