En rask innføring i immunhistokjemi. Elin Borgen Avd for patologi Oslo Universitetssykehus. Disposisjon

Transkript

1 En rask innføring i immunhistokjemi Elin Borgen Avd for patologi Oslo Universitetssykehus Bioingeniørkongressen 2016 Oslo Kongressenter Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips 1

2 Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips Antigener, antistoffer og immunhistokjemi Antigener (Ag) er antistoffgenererende molekyler som kan fremkalle immunologisk respons, især dannelse av antistoffer Antistoffer (As) er proteiner av typen immunglobuliner som produseres av kroppens plasmaceller som ledd i immunrespons. Immunhistokjemi (IHK) er en metode for å lokalisere spesifikke Ag i vev/celler ved hjelp av As/Ag binding 2

3 Antistoff molekylær struktur: 3

4 Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips 4

5 Immunhistokjemi (IHK) viktig del av patologidiagnostikken Identifikasjon/klassifikasjon av sykdommer/kreftsvulster Bestemmelse av prognose (prognostiske markører) Bestemmelse av følsomhet for en bestemt behandling ( prediktive markører som HER2, østrogenreseptor, progesteronreseptor ) Påvisning av bakterier/virus/sopp Forskning På OUS: 46% økning i IHK i løpet av siste 3 år Companion diagnostic kits for immunhistokjemi godkjent av FDA per mai 2016 Companion diagn kit Antigen Pasientgruppe Medikament(er) DAKO EGFR PharmDx Kit DAKO C KIT PharmDx PATHWAY ANTI HER 2/NEU (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical systems INSITE HER 2/NEU KIT Biogenex Laboratories, Inc. Bond Oracle Her2 IHC System HERCEPTEST (DAKO) PD L1 IHC 22C3 pharmdx (DAKO) VENTANA ALK (D5F3) CDx Assay EGFR Colorectal cancer Erbitux (cetuximab); Vectibix (panitumumab) c kit protein GIST Gleevec/Glivec =CD 117 (imatinib mesylate) HER2 Herceptin Mammacancer (trastuzumab) HER2 Mammacancer Herceptin (trastuzumab) HER2 Mammacancer Herceptin (trastuzumab) Mammacancer; HER2 Metastatic gastric cancer Metastatic gastroesophageal junction adenocarcinoma, PD L1 ALK Non small cell lung cancer (NSCLC) Non small cell lung carcinoma (NSCLC) tissue stained with a BenchMark XT Herceptin (trastuzumab); Perjeta (pertuzumab); Kadcyla (ado trastuzumab emtansine) KEYTRUDA (pembrolizumab) Xalkori (crizotinib) 5

6 Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips IHK Den historiske utviklingen 1940 : Immunfluorescens på frysesnitt (ufiksert frosset vev; Coons, Proc Soc Exp Biol Med. 1941;47:200) : IHK med vanlig lysmikroskopi (muliggjort ved innmerking med pepperrot peroxidase) 1974: IHK på vanlig rutinediagnostisk formalinfiksert paraffininnstøpt materiale (CR Taylor. J Clin Pathol 1974; 27:14) 1991: Antigen retrieval (demaskering) ved hjelp av varmebehandling : en revolusjon som førte til bred innføring av IHK rutinediagnostikken (S R Shi, J Histochem Cytochem. 1991; 39: 741 Tidlig 1990 tall: IHK innført rutinediagnostikk (dvs på paraffinblokker) Og deretter: utvikling av stadig bedre antistoffer og IHK protokoller (økt sensitivitet, reproduserbarhet, standardisering ) 6

7 IHK protokoll: Forbehandling: antigen demaskering («antigen retrieval») Retrieval : The act or process of getting and bringing back something. Shi S R et al, J Histochem Cytochem Jun;39(6):741 8: An gen retrieval in formalin fixed, paraffin embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections Formalinfiksering fører til kryssbindinger mellom formalinen og proteiner i vevet. Kryssbindingene hemmer antistoff/antigen binding. Kryssbindingene kan løses opp igjen vha bl a varmebehandling (hydrolyse). ph i løsningen påvirker også resultatet. Antigen demaskering (retrieval) Heat induced epitope retrieval (HIER) Oppvarming/koking i vannholdig buffer ( ulike måter: koking i PT link (Dako), i mikrobølgeovn, itrykk koker, eller varmebehandling i selve fargemaskinen (Ventana, Bond, ) Forbehandlingsbufferen er vanligvis Tris/EDTA (ph ca 9) eller citrat basert (ph6), og de ulike fargemaskin/deteksjonssystem leverandørene har hver sine forbehandlingsbuffere: Leverandør Tris/EDTA ph9 Citrat ph6 Dako High ph Low ph Ventana/Roche CC1 CC2 (ph 8.5) Bond/Leica Solution 2 Solution1 For noen få antistoffer: enzymbehandling eller ingen forbehandling. 7

8 : Polymer med HRP på : HQ label: Hydroxy quinoxaline = et hapten : OptiView amplifier «containing tyramide with a linker containing HQ» Moderne IHK deteksjonssystemer (hjemmelaget forenklet fremstilling av noen hovedprinsipper) OptiView med amplifikasjon Flex UltraView HRP/polymer mrk geit anti mus og HRP mrk geit anti kanin Flex+ UltraView med amplifikasjon OptiView (fra Ventana) HRP/multimer mus monoklonalt anti HQ HRP/multimer mus monoklonalt anti HQ OptiView amplifier Kanin anti mus el. mus anti kanin HQ mrk geit anti mus og HQ mrk geit anti kanin Primærantistoff (mus el kanin) Celle/antigen Eksempel: Immunfarging med antistoffet Melan A mot melanocyttene basalt i plateepitelet i huden: 8

9 Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips Standardisering, standardisering, standardisering preanalytiske variable fallgruber for IHK For lang tid fra kirurgisk inngrep til formalinfiksering Viktig å skjære opp store preparater For kort fikseringstid er generellt verre enn for lang fikseringtid formalinen bruker 1 time/mm på å trenge inn, først deretter starter fikseringsprosessen ASCO/CAP, for HER2 på mammabiopsier: Fikseringtid 6 72 timer NordiQC anbefaler minimum t fiksering for biopsi på 1 mm Praksis på OUS: 6 timer fiksering skal være absolutt minimum for nålebiopsier. 24 timer eller mer for større preparater For høy temperatur Aldri over maks 60 grader før deparaffinisering/demaskering Hurtigfremføring, mikrobølgeovn basert: Den rådende anbefaling er: bør testes for de enkelte antistoff inntil man vet mer om konsekvensene og positiv kontrollmaterialet bør være tilsvarende behandlet altså i praksis nokså uhåndterbart ) Dekalsinering kan ødelegge; går som oftest bra, men bør overvåkes Avdelingene bør opprette fagansvarlig bioingeniør og fagansvarlig patolog spesielt for histologilaboratoriene 9

10 Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips Fagansvar IHK karrieremuligheter for bioingengiør! Overvåke kvaliteten av immunfargeprotokollene, inkl sammen med patolog riktig valg av primærantistoffer Positiv kontroller (Pos ktr på hvert snitt, med mindre det er tilstrekkelig med intern kontroll i selve pasientsnittet) Innkjøring av nye antistoffer; lage multiblokker Eksterne kvalitetssikringsprogrammer: NordiQC og Neqas Kommunikasjon med de som sender inn prøvemateriale og med histologilab for best mulig standardisering av preanalytiske variable. 10

11 Støping av positivkontroll blokker (Kopiert fra presentasjon av Søren Nielsen, Aalborg sykehus/nordiqc, Kurs i Immunhistokjemi Oslo januar 2012) men hvordan gripe det an? 11

12 At the very beginning... De to første ukene går fosteret fra å være en liten celleball. 1. dag mm dag mm Dag mm 12

13 ..til å bli en flat avrundet plate, bestående av to cellelag oppå hverandre: Epiblast Hypoblast Epiblast 6. Dag mm Her fester det seg til livmorslimhinnen Hypoblast 7. 8 dag mm Her synker det ned i uterinslimhinnen 3. uke: Epiblast cellene prolifererer og hoper seg opp til en fortykkelse («the primitive streak») langs midtlinjen. I denne fortykkelsen danner det seg en langsgående fordypning. Epiblastceller vandrer ned i fordypningen hvor de så bryter seg løs fra epiblastcellene og migrerer videre i alle retninger og legger seg innimellom epiblastlaget og hypoblastlaget, og danner her et tredje cellelag: mesoderm. Dermed består fosteret av 3 cellelag som nå heter: Ectoderm (som tidligere het epiblast) endoderm (tidl. hypoblast) mesoderm. 13

14 Prosessen hvor det tolagede fosteret blir til tre lag (i ca 3. uke) kalles gastrulering og organiseres av «the primitive node» (Hensens node) Primitive streak hos humant foster Etisk betydning/overgang? Victor Hensen ( ): The development of the primitive streak is taken, by some bioethicists, to signify the creation of a unique, potential human being Humant 10 mm embryo ved 7 ukers graviditet 14

15 Embryologi kortversjonen: Ectoderm blir til hudoverflaten (plateepitelceller). Fra ectoderm utvikles også nervesystemet. Endoderm blir til cellelaget som kler innsiden av (mesteparten av) tarmkanalen, og div kjertler som åpner seg i tarmkanalen som lever og bukspyttkjertel; samt luftrør, lungealveoler, urinblære, skjoldbruskkjertel (for det meste sylinderepitelceller) Mesoderm blir til benvev/benmarg/blod, brusk, muskel og bindevev Carcinomer er kreft utsprunget i epitelceller, dvs vev derivert fra ectoderm eller endoderm. Sarcomer er kreft utsprunget i vev derivert fra mesoderm Osteosarcomer (benkreft), levkemier, lymfomer, (utgått fra benmarg/lymfesystem), leiomyosarcomer (utgått i glatt muskulatur), fibrosarcomer (utgått i bindevev),... Nevrogene svulster utgår fra neurectoderm Hjernesvulster, schwannom, neuroblastom,... 15

16 Plate og sylinderepitel: Flerlaget plateepitel: har man der hvor det trengs beskyttelse mot ytre slitasje (hud, munnhule, spiserør,... her får man plateepitelcarcinomer. Sylinderepitel (ett eller noen få lag) : har man i innvendige slimhinner, kjertler mm her får man adenocarcinomer (for eks mamma, colon, ovarie, prostata endometriecancer) Immunhistokjemi kortversjonen...: Carcinomer er typisk positive for antistoff mot cytokeratiner (CK), som utgjør epitelcellenes celleskjelett Hematopoietiske tumores (lymfomer, levkemier) er typisk positive for antistoff mot CD45 (=LCA, «leukocyte common antigen») Sarcomer er typisk positive for vimentin (fibrosarcomer) eller desmin (muskelderiverte svulster) eller CD31 (karsvulster),.. Nevrogene svulster og melanomer er typisk positive for S 100 Men under visse omstendigheter, som ved kreftutvikling, kan celler gjenoppta produksjonen av proteiner som normalt bare er tilstede i fosterlivet. Kreftceller kan også uttrykke markører som ikke var tilstede i cellene de kom fra opprinnelig og ofte er det kombinasjoner av antistoffer som gir fasitsvaret 16

17 Ectoderm overflate ectoderm neurectoderm Hud (plateepitel) nervesystemet Plateepitelcarcinomer (CK5/6, CK14,...) Nevrogene svulster (S 100, CD56,...) Melanocytter i huden Melanomer (S 100, HMB45, melana,.. Endoderm tarm, luftveier, mamma, lever, pancreas,... Adenocarcinomer (hovedsaklig) CK7, CK8, CK18, CK20,.. Mesoderm Bindevev Hematopoietiske system/benmarg Blodkar/lymfekar Benvev/brusk Muskler Fibrosarkomer (vimentin,..) Lymfomer, levkemier (CD45: alle CD3: T lymfocytter/t cellelymfom CD20: B lymfocytter/b cellelymfom CD15/CD30: Hodgkins lymfom Myeloperoxidase: granulocytter(myeloid levkemi) Karsvulster (angiosarcomer,..) (faktor VIII, CD31,C D34, D2 40) Osteosarcom/chrondrosarcom Desmin (både tverrstripet skjelettmusk. og glatt muskulatur) Glatt muskulatur (leiomyom/leiomyosarkom; SMA, h caldesmon Tverrstripet skjelettmuskulatur (myogenin, myod1,...) Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips 17

18 Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS: en nålebiopsi fra tumor i lever hos 22 år gammel kvinne: hematoxylin eosin farget snitt Normale leverceller Normale leverceller Tumor 18

19 Hematoksylin eosinfarging: Mikroskopisk utseende som en ondartet tumor cellerik og med kjerner med store nukleoler. Vekstmønsteret er dels litt spolcellet, dels litt «epiteloid», dels udifferensiert/ubestemmelig Bredspektert antistoff mot cytokeratin (epitelceller) (AE1AE3) : Normalt levervev sterkt positivt, men tumor er nega v. Altså er det ikke et carcinom. De normale levercellene er positive Tumorcellene er negative 19

20 CD45 er negativ (bortsett fra i enkelte normale hvite blodlegemer altså er det ikke et lymfom Kan det være en kar derivert tumor? men CD34 er negativ i tumorcellene (det er bare blodkar/lymfekar som er positive. 20

21 Kan det være Ewing sarkom? Men CD99, som er en typisk markør for Ewing, er negativ: CD99 pos. kontroll Et lungecarcinom? Men lungemarkøren TTF1 er negativ : Pos ktr TTF1 (normalt lungevev) og Myf4 og CD117 (for hhv rhabdomyosarkom og gastrointestinal stromal tumor (GIST)) var også negative. 21

22 S 100 er negativ i normal lever men positiv i tumorcellene! Ectoderm overflate ectoderm neurectoderm Hud (plateepitel) nervesystemet Plateepitelcarcinomer (CK5/6, CK14,...) Nevrogene svulster (S 100, CD56,...) Melanocytter i huden Melanomer (S 100, HMB45, melana,.. Endoderm tarm, luftveier, mamma, lever, pancreas,... Adenocarcinomer (hovedsaklig) CK7, CK8, CK18, CK20,.. Mesoderm Bindevev Hematopoietiske system/benmarg Blodkar/lymfekar Benvev/brusk Muskler Fibrosarkomer (vimentin,..) Lymfomer, levkemier (CD45: alle CD3: T lymfocytter/t cellelymfom CD20: B lymfocytter/b cellelymfom CD15/CD30: Hodgkins lymfom Myeloperoxidase: granulocytter(myeloid levkemi) Karsvulster (angiosarcomer,..) (faktor VIII, CD31,C D34, D2 40) Osteosarcom/chrondrosarcom Desmin (både tverrstripet skjelettmusk. og glatt muskulatur) Glatt muskulatur (leiomyom/leiomyosarkom; SMA, h caldesmon Tverrstripet skjelettmuskulatur (myogenin, myod1,...) 22

23 Eksempel: Immunfarging med antistoffet Melan A mot melanocyttene basalt i plateepitelet i huden: og også Melan A, mot melanocytter er positiv: 23

24 Ectoderm overflate ectoderm neurectoderm Hud (plateepitel) nervesystemet Plateepitelcarcinomer (CK5/6, CK14,...) Nevrogene svulster (S 100, CD56,...) Melanocytter i huden Melanomer (S 100, HMB45, melana,.. Endoderm tarm, luftveier, mamma, lever, pancreas,... Adenocarcinomer (hovedsaklig) CK7, CK8, CK18, CK20,.. Mesoderm Bindevev Hematopoietiske system/benmarg Blodkar/lymfekar Benvev/brusk Muskler Fibrosarkomer (vimentin,..) Lymfomer, levkemier (CD45: alle CD3: T lymfocytter/t cellelymfom CD20: B lymfocytter/b cellelymfom CD15/CD30: Hodgkins lymfom Myeloperoxidase: granulocytter(myeloid levkemi) Karsvulster (angiosarcomer,..) (faktor VIII, CD31,C D34, D2 40) Osteosarcom/chrondrosarcom Desmin (både tverrstripet skjelettmusk. og glatt muskulatur) Glatt muskulatur (leiomyom/leiomyosarkom; SMA, h caldesmon Tverrstripet skjelettmuskulatur (myogenin, myod1,...) og positiv er også HMB45: som er et antistoff mot melanosomer. Er tilstede i normale melanocytter i fosterlivet, men ikke i normale, hvilende melanocytter senere. Antigenet dukker opp igjen i aktiverte melanocytter, som ved betennelsestilstander, og ved godartede og ondartede føflekker. Diagnose: Malignt melanom (ondartet føflekk) 24

25 Disposisjon Definisjoner Viktigheten av immunhistokjemi Metode Fallgruber Fagansvar for immunhistokjemisk lab hvordan gripe det an Embryologi kortversjonen Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS Noen råd og tips hvordan gripe det an : 25

26 På nettsiden ligger også NordiQC liste over top 20 IHK websites Nyttig: NordiQC nettside: Nyttig bok: Mogens Vyberg: Anvendt immunhistokemi ( selv om den nå ikke er helt ny lenger) Valg å gjøre ved innkjøring av IHK protokoller Optimal klon/antistoff til den aktuelle problemstilling sjekk NordiQC, artikler på PubMed, spør evt samarbeidspartnere, Forbehandlingsbuffer Konsentrasjon av primærantistoffet Deteksjonssystem Vev å teste på (normalvev/tumorvev ) Sammensetning av positivkontrollen (bør oftest bestå av flere stanser, må inneholde noe som uttrykker antigenet svakt også og normalvev er en fordel). Sjekk om det foreligger særskilte krav (ved prediktive markører som østrogen og progesteronreseptor, HER2, ALK, CD117, ) Det som står i antistoff dataarket kan være upålitelig! 26

27 Dette har vist seg nyttig hos oss på IHK lab på OUS: Arkivér alle testsnitt ved uttesting av nye antistoffer skriv på glasset fargedato, produktnr for primærantistoffet, forbehandlingsbuffer og deteksjonssystem. Fyll ut et testskjema for hvert nytt antistoff, som alle på laben har tilgang til Opprett en excelfil alle på laben har tilgang til, for å holde orden på uttestinger og godkjente protokoller Lag en digital mappe (evt som alle har tilgang til), for hvert enkelt antistoff: Log (som en wordfil; lavterskel! notater, mailer, råd/tips/ utdrag fra artikler, konklusjoner ) Dataark Artikler Lag digital huskelapp for hvert antistoff til bruk ved hurtig sjekk av positiv kontroller (kan hente bilder/info bl a fra NordiQC nettsider, dataark fra ulike leverandører, artikler, etc ) Positivkontroller: Nummerer pos ktr blokkene og skriv pos ktr blokknr på hvert glass Lag digital mappe med oversikt over kontrollblokkene (blokknr og innhold i blokkene, dato for støping, dato for når tatt inn/ut av bruk.) Positivkontroll snittene må ikke stå i romtemperatur mer enn 1 2 uker! Vår praksis på OUS er: i romtemperatur : maks 1 2 uker (holder litt lengre i kjøleskap) 20 C: 4 6 uker 80 C: >6 uker (Spesielt sårbart: østrogen og progesteronreceptor, HER2, virus, ) Unngå sollys på snitt (gjelder både på fargede og ufargede snitt). Lag multiblokker til uttesting av antistoffer og lag digital mappe med oversikt over inn holdet i multiblokkene Husk personvernhensyn ved lagring av notater/div info! (remissenummer koblet med diagnose er sensitive opplysninger, hvis lagres på steder hvor leseren samtidig har tilgang til pasient navn/fødselsdata (?). forts.dette har vist seg nyttig hos oss på IHK lab på OUS: Fyll ut ett slikt digitalt testark for hvert nytt antistoff og logfør uttestingene underveis her. Opprett to digitale mapper på et fellesområde hvor skjemaene plasseres: Protokoller under arbeid Protokoller godkjent Tips: Ingen bestilling av nytt antistoff før skjemaet er fyllt ut! Skjemaet er laget etter en mal fra Søren Nielsen v/aaborg Sykehus 27

28 forts.dette har vist seg nyttig hos oss på IHK lab på OUS: Excelfil som opprettes på et fellesområde for å holde orden på uttesting av nye antistoffer Skjema for kontrollblokk 28

29 29

30 Takk for oppmerksomheten! 30