A New Approach for the Detection of the Seven Most Common α-thalassemia Deletions

Transkript

1 A New Approach for the Detection of the Seven Most Common α-thalassemia Deletions Catherine B. Herrera, Lamya Garabet, Hege Smith Tunsjø and Tor-Arne Hagve Unit of Gene Technology, Multidisciplinary Laboratory Medicine and Medical Biochemistry, Division of Diagnostics and Technology, Akershus University Hospital, Norway

2 Oversikt 1. Bakgrunn 2. Real-time PCR med smeltekurve analyse, Ahus 3. Resultater 4. Arbeidsflyt 5. Oppsummering

3 Bakgrunn Øk kunnskap om hemoglobinopati økning i antall prøver prøver Hb-typing sendt til ekstern lab prøver Hb-typing 2013 oppstart alfa-talassemi genotyping Ønske om bedre service til rekvirenter

4 Hvilke metoder er brukt i Norden for deteksjon av α-talassemi delesjoner? 1. GAP-PCR og visualisering av PCR-produkt ved hjelp av gel elektroforese Chong et al (2000), Tan et al (2001) + flere Multiplex! Visualisering av PCR-produkt skjer ved hjelp EtBr og UV-lys. 2. AssayStrip ViennaLAb: Basert på hybridisering Andre deler av verden: 3. Real-time PCR med smeltekurveanalyse Skiller mellom de ulike delesjoner ved hjelp av smeltepunkt, Tm NB - Ikke alle 7 delesjoner!

5 Bakgrunn fort. α-talassemi genotyping: Hvorfor ønsker vi en ny tilnærming ved deteksjon av de 7 mest kjente mutasjoner? Økning i antall rekvirering av Hb-typing allerede nå. Screeningprogram i noen europeiske land, bl.a. Danmark Mangel på bioingeniører Raskere responstid

6 Våre krav til den nye metoden Automatisering og kortere svartid LISintegrering HMS

7 Bakgrunn fort. Hvilken metode tilfredsstiller våre krav?

8 Real-time PCR med smeltekurveanalyse Basert på GAP-PCR prinsippet Tilsatte intercalating dye Ulike produkter har hvert sitt smeltepunkt, Tm Én PCR-mix pr delesjon Tan et al. (2001)

9 Real-time PCR med smeltekurveanalyse fort. Pre-PCR arbeid min. Real-time PCR (Overnatt) 4,5 timer Vurdering av kurver og utgivelse av svar min.

10 Eksempler smeltekurver α3.7 delesjon Tm 86 0 C α2 Normalt α-globin gen Tm 90 0 C

11 Eksempel: Prøve 13 Real-time PCR: smeltekurve Multiplex PCR: Gel elfo. Genotype: Homozygot - α3.7 delesjon Tm = 86 0 C = - α3.7 delesjon Produkt str. = ca 2000 bp = - α3.7 delesjon

12 Resultater fort. Sammenligning av resultater oppnådd med real-time PCR metoden og multiplex-pcr metoden/gel elektroforese utført på Ahus. 106 prøver ble sammenlignet 2 bioingeniører tolket resultatene Ved diskrepans, ble prøven sendt til ekstern lab. for verifisering = fasit Fasiten samsvarte med real-time PCR resultater Samsvar Ikke samsvar Bioingeniør 1 96 % 4 % Bioingeniør 2 97 % 3 %

13 Table 1. The genotyping results of 106 samples analysed using real-time PCR with meltcurve (=RT MC) and multiplex gap-pcr with gel electrophoresis (PCR Gel), and the genotyping results of 58 samples analysed at collaborative laboratories. Genotype Number of samples Agreement RT MC vs. PCR gel Agreement RT MT vs. collaborative lab. αα/αα % 99 % * -α3.7/αα 7 86 % 86 % * -α3.7/-α % 100 % -α3.7/--sea 4 50 % 100 % -α3.7/--med % -α4.2/--sea % --FIL/αα % --MED/αα % --SEA/αα 5 60 % 100 % Total number 106 * = Discrepancy caused by swapped sample ID. + = Not analysed due to lack of sample material.

14 Resultater: Sammenligning mot ekstern lab. 58 prøver ble undersøkt med real-time PCR metoden og genotypet på et samarbeidslaboratorium 100 % samsvar! OUS RH/Sahlgrenska, Gøteborg Ahus Positive Homozygot Positive Heterozygot Negative Sum Positiv homozygot Positiv heterozygot Negativ Ingen delesjon Sum

15 Arbeidsflyt ved multiplex PCR gel metode Pre-PCR arbeid Ca 30 min. PCR (Overnatt) 4 timer Post-PCR arbeid 3 timer Vurdering av gelbildet og utgivelse av svar > 60 min.

16 Sammenligning av arbeidsflyt: Real-time vs. multiplex PCR Real-time PCR med smeltekurveanalyse Multiplex gap-pcr med gel elfo.

17 Fordeler med real-time metoden Bruker kortere tid på utførelse Lukket system ingen etterbehandling av post-pcr produkter unngår kontaminering Færre ledd og dermed færre feilkilder God sporbarhet Unngår bruk av etidium bromid (mutagent stoff!)

18 Oppsummering: Har real-time metoden oppfylt våre krav? Mer automatisering og kortere svartid Reduksjon arb.tid ca. 3 timer Reduserer faren for kontaminering Standardisert tolkning av svar LISintegrering Reduserer sjansen for menneskelige feil HMS Mer ergonomisk mindre pipettering. Unngår helseskadelige EtBr