Molekylære metoder i medisinsk mikrobiologi.

Transkript

1 - 1 - Molekylære metoder i medisinsk mikrobiologi. Laboratorieøvelser onsdag 18.mars Øvelser: 5. Gelelektroforese på PCR produkt fra meca og nuc PCR fra dag 1 6. Mycobakterium genus FRET realtime PCR 7. GBS Taqman realtime PCR 8. Beregning av sensitivitet, real-time PCR for GBS Øvelse 5. Gelelektroforese. Bakgrunn: Det benyttes E-gel (life technologies) til elektroforesen. Dette er en ferdiginnstøpt 2 % agarosegel. Det finnes slike geler tilsatt DNA bindende stoff som Ethidiumbromid eller SYBRsafe. Disse stoffene har fluoriscerende egenskaper og egner seg godt til å farge DNA ved at man tar bilde av gel under fluoriscerende betingelser. En Gel Doc (Bio-Rad) skal benyttes til å ta bilde. DNA er negativt ladet og vil bevege seg mot den positive polen i et elektrisk felt. Agarosematriksen vil gi DNA molekylene motstand på veien. Større molekyler vil bruke lengre tid på å migrere gjennom porene i gelen enn store molekyler. Prøvene og kontrollene som er satt opp i konvensjonell PCR dag 1 (meca og nuc PCR) skal kjøres på gel sammen med en størrelsesmarkør (1 kb plus DNA ladder, se vedlegg). Det er plass til 12 prøver på en gel. 2 grupper går sammen om en gel. Gelen pakkes ut av plastfolien og monteres i strømkilden. Skriv gruppenavn på gelen og noter hvilke brønner hver gruppe benytter. 20µl PCR-produkt blandes med 2 µl loadingbuffer i brønner i ei mikrotiterplate. Ta ut plast-kammen i gelen. Første gruppe: Appliser 20 µl DNA-ladder i brønn 1 og deretter 20 µl PCRproduk/loadingbuffer i brønnene 2-6. Andre gruppe: Start med 20 µl DNA-ladder i brønn 7 og deretter 20 µl PCR-produkt/loadingbuffer i brønn Gelen kjøres i 30 minutter. Etter at gelen er ferdig kjørt taes det bilde i et gel-doc apparat.

2 - 2 - Øvelse 6. Mycobakterium genus FRET realtime PCR Instrument: LightCycler 1.0 Prinsipp: Realtime PCR med hybridiseringsprober (FRET prober) etterfulgt av smeltepunktsanalyse. Målområdet for PCRen er en hypervariabel del av 16S rrna genet. FRET probene er designet til å være 100 % homologe med M. tuberculosis og inneholder flere mismatcher til andre mycobakterier. Positivt amplifikasjonssignal vil oppnås både med M. tuberculosis og atypiske mycobakterier, men smeltepunktsanalysen kan skille mellom M. tuberculosis og atypiske mycobakterier. M. tuberculosis har et smeltepunkt rundt 65 ºC mens andre vil ha et klart lavere smeltepunkt. Reaksjonsmiks til 5 prøver deles ut sammen med enten prøve 4a, 4b eller 4c og to positiv kontroller. Oppsett må foregå etter tur siden alle prøver skal analyseres i samme prøvekarusell. Reaksjonsmiks pr prøve: 2µl Myco sense primer (5µM) 2µl Myco antisense primer (5µM) 2µl Myco probe med lightcycler red 640 (4µM) 2µl Myco probe med fluorescein (4µM) 2µl hybridiseringsprobemix (Roche)med dntp, buffer og enzym 2,4 µl MgCl 2 25mM 1,3 µl dh 2 O 0,5 µl UNG Fremgangsmåte Hver gruppe setter 4 glasskapillærer i karusell til lightcycler og noterer hvilke posisjoner dere har i karusellen. NB! Vær forsiktig, kapillærene brekker lett. Tilsett 15 µl reaksjonsmiks pr.kapillær Tilsett 5 µl prøve og bland. Prøveoppsett som beskrevet under. Sett på kork etter hver prøve for å minske faren for forurensning/feilpipettering. Karusellen sentrifugeres for få materialet ned i glasskapillærene. Inspiser glasskapillærene for å se hvor nøyaktig pipetteringen har vært. Prøveoppsett 1. Prøve 4a, 4b eller 4c (ulikt for gruppene) 2. Negativ kontroll (dh 2 O) 3. Pos. ktr: M.tuberculosis. 4. Pos. ktr: M.intracellulare Program i LightCycler: C i 10 min C i 10sek C i 10sek C i 20sek 2-4 gjentas i 45 sykler Smeltepunktanalyse: 40 C til 75 C med økning på 0,1 C pr.sek

3 - 3 - Øvelse 7. GBS Taqman realtime PCR Instrument: CFX 96 Prinsipp: TaqMan realtime PCR for påvisning av GBS. Målområde for PCR er i sipgenet. Hver gruppe benytter prøve 1 som ble ekstrahert på Qiagen kolonne i går. Reaksjonsmiks til 8 prøver deles ut samt positiv kontroll. Reaksjonsmix pr prøve: 0,5µl sense primer (12µM) 0,5µl antisense primer (12µM) 0,5µl probe (8µM) Reporter FAM. Quencher TAMRA 10 µl Perfecta Multiplex qpcr SuperMix, UNG 3,5 µl MBG-vann Fremgangsmåte Prøve 1 som ble isolert vha Qiagen kolonne settes opp ufortynnet og i 4 10 folds fortynninger. Det lages en 10 folds fortynningsrekke av GBS prøven isolert dag µl MBG-vann pipetteres i 4 rør og merk rørene B-E. 5 µl PCR produkt fra prøve 1 tilsettes rør B. Miks og spin ned. 5 µl fra rør B tilsettes rør C Miks og spin. osv.osv. PCR oppsett i strips. Det tilsettes 18 µl reaksjonsmix pr.brønn i PCR-plate. Tilsett 2 µl prøve og bland. Oppsett beskrevet under. Sett på lokk. Pass på å ikke ta oppå prøvebrønnene da fluorescensavlesningen skjer gjennom lokket. Merk strips med gruppenavn på enden. Prøveoppsett A. GBS prøve isolert på Qiagen kolonne B. 1: 10 fortynning av GBS prøve C. 1:100 fortynning av GBS prøve D. 1:1000 fortynning av GBS prøve E. 1: fortynning av GBS prøve F.Negativ kontroll (dh 2 O) G. Positiv kontroll Program i CFX C i 5 min C i 3 min C i 10sek C i 10sek C i 20sek 6. 4 C Repeter steg 3-5 i totalt 40 sykler

4 - 4 - Øvelse 8. Beregning av sensitivitet, real-time PCR for GBS Vi har følgende opplysninger: Konsentrasjon av GBS lysat se neste side (velg en konsentrasjon å regne på) Størrelse på GBS genomet: 2,2*10 6 bp Sip genet som er målgenet for PCR reaksjonen finnes i én kopi i genomet 2 μl av lysatet brukes i PCR reaksjonen Gjennomsnittlig molekylvekt per basepar (bp) er 660 pg/pmol Se vedlagt fortynningsrekke for å finne siste positive fortynning 1. Finn estimert molekylvekt for GBS genomet a. # bp i GBS genomet * 660 pg/(pmol*bp) 2. Finn # pmol i lysat 1 brukt i PCR reaksjonen a. Finn mengden pg: 2 μl * (den konsentrasjonen du regner på omgjort til pg/µl) b. Bruk molekylvekt til GBS genomet til å finne # pmol dette tilsvarer 3. Gjør om til fra pmol til mol 4. Finn # molekyler i fortynningen du regner på som er brukt i PCR reaksjonen, ved hjelp av Avogadros tall NA = 6, x mol -1 antall molekyler i ett mol 5. Finn antall molekyler i siste positive prøve

5 - 5 -