Identifikasjon av mykobakterier vha MALDI-TOF MS. Aina Myhre Tuberkuloselaboratoriet, Rikshospitalet

Transkript

1 Identifikasjon av mykobakterier vha MALDI-TOF MS Aina Myhre Tuberkuloselaboratoriet, Rikshospitalet

2 Nåværende identifikasjonsrutiner Direkte i (NALC-behandlet) prøvemateriale: Mikroskopi (auramin) PCR (TaqMan 48, Roche) Rask og sensitiv, men kun M. tub. komplekset Fra positiv kultur (Bactec MGIT 960): RNA-hybridisering Krever stor mengde bakterier, lite egnet for blodige materialer Kun M. tub. og M. avium kompleksene Antigentest (BD) 15 min! Kun M. tub. kompleks 16s sekvensering

3 Hvorfor MALDI-TOF i tillegg? Rask! Preparering av prøve tar minutter Selve analysen tar kun noen sekunder per spot på targetplaten Billig! Under en femmer per prøve Raskere svar til rekvirenten Kan gjøres så fort MGIT-rør har flagget ut fra Bactec, med svar samme dag Kan unngå mer tidkrevende analyser som hybridisering og 16s i noen tilfeller vil vi kanskje kunne korte ned svartiden med et par uker! Får satt opp resistensbestemmelse med en gang

4 Inaktivering Alle isolater må inaktiveres før de tas ut av P3-lab Vanlig: 20 min ved 95 C Ødelegger proteinene? Muligens greit for M. tub., men gir dårlige/ingen spektre for en del atypiske

5 Test av ulike inaktiveringsmetoder I vann, koking ved 95 C I acteonitril, koking ved 95 C OBS! Lokkene spretter opp, krever skrukork Lik mengde acetonitril og 70 % maursyre 50 % acetonitril og 4 % trifluoreddiksyre 90 % acetonitril og 5 % trifluoreddiksyre Tykk suspensjon i 0,5 ml løsning, lar stå hhv 5, 10 og 20 min Sentrifugeres og fjerner supernatant. Pellet brukes til å inokulere MGIT-rør Ingen vekst i noen rør etter 2x42 døgn i Bactec

6 Første forsøk Vanlig grampositiv ekstraksjon 4 ulike arter av atypiske mykobakterier på 7H10-skål, totalt 30 isolater Slemmes opp i 300 µl vann, tilsetter 900 µl etanol Sentrifugeres x 2, supernatant fjernes helt Tilsetter 50 µl 70 % maursyre og 50 µl acetonitril Sentrifugeres, 1 µl supernatant avsettes per spot på plate, dekkes med 1 µl matrix Stort sett bare skurr, kun 7 av isolatene ga spektre i det hele tatt. Svært lave scoreverdier Det kunne jo ikke være så enkelt

7 Utfordring: Løse opp kolonimaterialet Mykobakterier vokser gjerne med tørre, harde kolonier. Hydrofobe Andre har forsøkt heftig pipettering (inntil 5 minutter!) og vortexing, men dette er i overkant tungvint

8 En lys idé MagNA Lyser (Roche)

9 Ekstraksjon med MagNA Lyser Slemmet opp kolonimateriale i 1 ml vann i greenbeads-rør, kjørt på full hastighet i MagNA Lyser Får fin homogen løsning! 300 µl overføres til eppendorfrør, deretter vanlig ekstraksjonsmetode Generelt dårlig kvalitet på spektrene, men der hvor vi får spektre blir isolatene stort sett korrekt identifisert, om enn med lave scoreverdier

10 Ekstraksjon med MagNA Lyser forts.

11 Ekstraksjon med MagNA Lyser

12 Problemer ved denne metoden Svært varierende resultater en del atypiske gir ok spektre og relativt høye scoreverdier, mens bl.a. M. tuberculosis stort sett kommer ut med no peaks For noen no peaks -isolater klarer vi å tvinge fram spektre ved å kjøre manuelt med svært høy laserintensitet (70-80 %) tyder på at proteinkonsentrasjonen er lav? Muligens mister vi for mye protein ved å riste i MagNA Lyser før ekstraksjon

13 En liten helomvending Dropper 7H10-skålene, dyrker i stedet på MGIT-rør Dropper greenbeads-rørene da de krever stort væskevolum 1 ml buljong overføres til rør med skrukork, sentrifugeres og vaskes deretter to ganger med vann Pellet løses opp i 300 µl vann, deretter ekstraksjon som tidligere beskrevet; men samtidig med maursyre tilsettes det en liten mengde silicakuler (diam. 0,5 mm) Kjøres i MagNA Lyser Lar stå ca 15 min Tilsetter lik mengde acetonitril, sentrifugerer og avsetter supernatant på plate + matrix

14 Hah!

15 Tabell resultater Antall <1,7 1,7-2 >2 M. abscessus 3 3 M. avium M. bolletii 1 1 (M. abscessus) M. bovis BCG 2 2 (Not reliable) M. celatum M. chelonae 2 1 (M. abscessus) 1 (M. abscessus) M. fortuitum 4 4 M. gordonae 1 1 M. kansasii M. malmoense 13 1 M. kumamotonense 5 7 M. peregrinum 2 2 M. simiae 4 4 M. tuberculosis 7 Ikke akseptable resultater på noen isolater M. xenopi Totalt

16 Resultater forts.

17 Oppsummering Foreløpige resultater tyder på at MALDI-TOF MS kan brukes til hurtig og sikker identifikasjon av atypiske mykobakterier fra positive MGIT-rør Enkelte arter er svært like, skiller ikke mellom disse Fremdeles problemer med M. tuberculosis, men her har vi andre alternativer i tillegg til MALDI-TOF

18 Videre framover Bedre kvaliteten på spektrene Bygge opp egen database (ATCC-stammer samt kliniske isolater) Kjøre MALDI-TOF parallelt med annen identifikasjon i rutinen

19 Referanser Saleeb, Paul G. et. al. (2011). Identification of mycobacteria in solid-culture media by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Journal of Clinical Microbiology, Lotz, A. et. al. (2010). Rapid identification of mycobacterial whole cells in solid and liquid culture media by MALDI TOF MS. Journal of Clinical Microbiology, online ahead of print doi: /JCM Pignone, M. et. al. (2006). Identification of Mycobacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology,