Prøveopparbeidelse for komatografiske analyser

Transkript

1 Prøveopparbeidelse for komatografiske analyser Lisbeth Solem Michelsen Kromatografikurs arrangert av NITO i Trondheim mai 2018 Hvorfor prøveopparbeidelse? Ulike typer matriks Hår prøver Lever, nyrer etc. Blod/serum prøver Beslag; pulver, tabletter etc. Urin prøver 1

2 1. Fortynning 2. Proteinfellingmed/uten fjerning av fosfolipider Ulike typer prøveopparbeidelse 4. Væske-væskeekstraksjon (LLE) 3. Fast-faseekstraksjon (SPE) Internstandard (IS) Skal være så lik analytten som mulig Tilsettes i lik mengde/konsentrasjon i standarder, kontroller og prøver Korrigerer for tap av analytt under prøveopparbeidelse og matrikseffekter i ionekilden Ikke helt samme masse som analytten og kan derfor skilles fra denne med MS Deuterium- eller C13 merket er det som vanligvis brukes. 13 C 6 i ringen Amfetamin Amfetamin-D 3 Amfetamin- 13 C 6 2

3 1.Fortynning av prøve Med vann/meoh Første og siste del av kolonne eluering til «Waste» Enkel, rask teknikk Billig, lite utstyr Enkel metode utvikling Ingen prøve-opprenskning Ingen prøve-oppkonsentrering Eks fortynning ved beslag Prøve: tabletter, pulver fra beslag Veies, knuses, Tilsetter MeOH og sentrifugeres Supernatant: lager fortynningsrekke og analyseres på LC-QTOF 3

4 2. Proteinfelling 7 Tilsetter fellingsreagens som denaturerer proteiner i biologisk matriale Analytt-proteinbinding brytes Proteinene feller ut Analytten forblir i løsningen (supernatanten) Analyse av supernantant eller videre opparbeidelse Proteinfelling, eks på fellingsreagens Fellingsreagens må være polart, dvs. blandbart med vann, feks Acetonitril (ACN) Metanol Blanding av metanol og ACN ZnSO4 + ACN 4

5 Felling med acetonitril Supernatant; Kald ACN Analyseres direkte eller videre opparbeidelse Ristes + sentrifugeres Blodprøve + IS Presipitat Oppsummering proteinfelling Enkel, rask teknikk Billig lite utstyr, enkel metode utvikling Kan analyseres direkte eller fordampes og oppkonsentreres Begrenset prøve opprensing Kan være egnet i rettsmedisinske saker (RM saker) 5

6 Proteinfelling med fjerning av fosfolipider Fosfolipider primærkilde for ionesuppresjon, matrikseffekt ved LC-MS analyse av biologiske-prøver reduserer analysekolonnens levetid og MS-sensitivitet Ionesuppresjon pga. fosfolipider Fosfolipider Analytt 6

7 PPP-modul (Positive Pressure-96 Processor) Oppsummering pp+ fosfolipidfiltrering med 96-brønnsplate Enkel rask teknikk Enkel metodeutvikling Kostbare engangsplater/brønner Krever PPP eller vakum (og pipetteringsrobot) Noe begrenset prøve-opprenskning, men fjerner fosfolipider 7

8 3. Fast fase ekstraksjon (SPE) Kolonne-ekstraksjon med fast fase og væskefase Separasjon ved kjemiske interaksjoner mellom analytt og fast fase i kolonnen Kondisjonering Prøve på Vask Eluering setting Reservoar Filter Sorbent Filter 16 Omvendt fase ekstraksjon For å oppkonsentrere og rense upolare analytter fra polar matriks (vandig løsning) Sorbenten har upolare funksjonelle grupper (C18) Analytt fester seg til sorbent ved upolare interaksjoner Stoffer som fjernes er enten mer polar (salter, proteiner) eller mindre polar (sitter igjen på sorbenten) enn analytt. Sorbenten er upolar (C18-kjeder)

9 Mixed mode SPE 17 Både: - Upolare egenskaper (C8) & - Ionebytter egenskaper, eks. kationbytter (- SO 3- H + ) Upolar interaksjon Ionisk interaksjon Analytt Ulike SPE-kolonner og utstyr Reservoar: Forskjellige størrelser (96 plate, 0,2-75 ml) Sorbent/pakkemateriale, forskjellig: Partikkelstørrelse µm Mengde sorbent Kjemiske egenskaper 9

10 Oppsummering SPE Bredt utvalg av sorbenter Høy recovery (utbytte) Økt selektivitet renere ekstrakt ved mix-mode MeOH som løsemiddel mindre skadelig på miljøet Kostnader på kolonner/96-brønnsplater Flere trinn, må være påpasselig med hastigheten av løsning som suges gjennom Viskøse prøver (f.eks RM prøver) kan føre til tette kolonner 4. Væske-væske-ekstraksjon (LLE) Analytt fra biologisk prøve til organisk løsning Matrikskomponenter blir igjen i vandig fase Organisk fase Vann fase 10

11 Analyttens Syrekonstant (pka)? Hvilken ph skal bufferen ha? Analyttens polaritet (logp)? Amfetamin Analyttens Molekylstruktur (syre eller base)? Parametre ved LL- Ekstraksjon Valg av løsemiddel i ekstraksjon? THCA (cannabis) Riktig buffer Analytter må være uladet for å vandre over i upolar organisk fase Legemidler er enten svake syrer eller svake baser Ved analyttens pka-verdi, 50% ladet Hovedregel pka: pka egenskaper for analytt Ladet form av analytt, bufferbetingelser Nøytral (uladet) form av analytt, bufferbetingelser Basiske analytter; Høy pka verdi (pka > 7) Sure analytter; Lav pka verdi (pka < 7) Minst 2 ph eheter lavere enn pka verdi + R-NH 3 Minst 2 ph eheter høyere enn pka verdi R-C-O - Minst 2 ph eheter høyere enn pka verd R-NH 2 Minst 2 ph eheter lavere enn pka verdi R-C-OH II II O O 11

12 Valg av løsemiddel Løsemiddel kan ikke være blandbart med vann Må være nok upolart til å få to faser Arbeidsmiljø; Kloroform, heksan, diklormetan Pentan, sykloheksan, etylacetat Tetthet i forhold til vann, analyseteknikk Analytt i organisk fase Vannfase Polaritet Log P: forteller oss hvor vannløselig et stoff er Upolare stoffer høy logp Polare stoffer lav logp Polart Upolart 12

13 + Intern standard + Buffer Fremgangsmåte for LL-Ekstraksjon Sur beskyttelsesløsning 25 Rister prøvene (event tilsett salt) Avpipporg fase Inndamping av organisk fase Overføring til vial 40 C 1 ml blod/serum/urin Tilsett løsemiddel og ristes 10 minutter Oppkonsentrering Reløsing 26 Oppsummering LLE Enkel teknikk Rimelige reagenser Kan oppnå høy recovery Høy oppkonsentrering Rent ekstrakt Løsemiddel kan ikke være blandbart med vann Må jobbe i avtrekk, også ved automatisering

14 27 Hva velges, SPE eller LLE? Fast fase (SPE) Løsemiddel kan være blandbart med vann Kan automatiseres Kan bruke mindre løsemiddel Ekstraherer amfolytter (har både sur og basisk gruppe) Omstendelig prosedyre uten automatisering Dyre kolonner Væske-væske (LLE) Løsemiddel kan ikke være blandbart med vann Kan automatiseres Bruker «mye» løsemiddel-avtrekk Ekstraherer dårlig amfolytter Omstendelig prosedyre uten automatisering Rimelige reagenser Takk for meg! Lisbeth Solem Michelsen, Fagansvarlig bioingeniør, Analytisk FOU Avd. For klinisk farmakologi, St. Olavs hospital Tlf E-post: 14