Vitaminer (A, D, E og K)

Transkript

1 Vitaminer (A, D, E og K) Trude Athammer Sandvik Metodeutvikler Fürst Medisinsk Laboratorium Kurs i Kromatografi og massespektrometri Scandic Nidelven 23.mai 2018 Fürst Medisinsk Laboratorium Laboratoriet ble grunnlagt i Oslo i 1950 av dr. Valentin Fürst og Astri Fürst Privateid og norsk Mer enn 400 ansatte Det største medisinske laboratoriet i Norden Betjener over 6000 leger over hele landet Analyserer daglig prøver fra pasienter Akkreditert 1

2 Hvor er vi? Vårt hovedlaboratorium ligger på Furuset i Oslo PRØVETAKINGSSTASJONER Furuset Majorstuen Oslo sentrum Sandefjord Bergen HJEMMEPRØVER INSTITUSJONER/ SYKEHJEM Våre fagområder Fürst kan tilby over 250 analyser innen fagområdene medisinsk biokjemi, klinisk farmakologi, medisinsk mikrobiologi og patologi. Oversikt over analysene finnes i elektronisk blåbok på furst.no MEDISINSK BIOKJEMI KLINISK FARMAKOLOGI MEDISINSK MIKROBIOLOGI PATOLOGI 2

3 Kromatografigruppa del av Spesialanalyser seksjonsleder Bente N. Berge fagbioingeniører Bente Hexeberg Ingrid Honne Frøysa Elin Hagen (instrumenter) Ca. 12 bioingeniører Metodeutviklere nye metoder vedlikehold og forbedring av metoder problemløsning instrumentansvar investeringer Daglig rutinedrift Kromatografi og massespektrometri Startet med Metylmalonsyre på GC-MS som første analyse i Instrumenter pr. mai 2018: 8 x LC-MS/MS 2 x SFC-MS/MS 1 x ICP-MS Automasjon: 3 x Hamilton STAR 1 x Hamilton Vantage 3

4 Våre kromatografi- og MS- analyser Rusmiddel/misbruk bekreftelse Alkoholmarkører (PEth og EtG/EtS) Metylmalonsyre Vitamin D (25-OH-vit D2 og 25-OH-vit D3) Vitamin A (retinol) Vitamin E (tocopherol) Vitamin K (phylloquinone) Spor- og tungmetaller Vitaminer Essensielle næringsstoffer som trengs i små mengder for forskjellige biokjemiske funksjoner i kroppen Kan ikke syntetiseres i kroppen og må derfor inntas via mat. Et unntak er vitamin D som kan lages i huden ved eksponering av sol. Vannløselige vitaminer: vitamin C og B Fettløselige vitaminer: vitamin A, D, E og K 4

5 Vitamin A Viktig for: Syn Vekst Reproduksjon Kilder: Lever og kjøtt Egg Meieriprodukter β-karoten i grønne, gule og oransje grønnsaker Vitamin E Viktig som: Antioksidant Kilder: Vegetabilske oljer Nøtter Korn Salat 5

6 Vitamin D Viktig for: Regulering av kalsium og fosfatmetabolismen Kan redusere risiko for hjerte-karsykdom, enkelte kreft-typer, diabetes, kognitiv svikt, depresjon, allergi, MS etc. Kilder: Sol Tran Fet fisk Vitamin D-beriket mat og kost-tilskudd 6

7 Vitamin K Viktig for: Koagulasjon Forebygging av osteoporose Forebygge forkalkning av blodårer Kilder: Grønne blad-grønnsaker Små mengder i vegetabilske oljer, frukt, frokostblandinger, kjøtt og meieriprodukter Vitamin K2 i fermentert mat av mikrobiologisk opphav som f.eks. «natto», ost og surkål. Analytter og måleområde Analyse Analytt Referanseområde i serum (Fürst) Vitamin A Retinol > 0,7 µmol/l Vitamin E Tocopherol 2 42 µmol/l Vitamin D Vitamin K1 25 OH D2 25 OH D3 Phylloquinone nmol/l ng/ml (0.2 5 nmol/l) 7

8 Vitamin D2 (25 hydroxy vitamin D2) Vitamin A (retinol) Vitamin E (tocopherol) Vitamin K1 (phylloquinone) Vitamin D3 (25 hydroxy vitamin D3) Kromatografiteknikker SFC Supercritical Fluid Chromatography Kilde: waters.com 8

9 Prøveopparbeidelse Væske-væske ekstraksjon (LLE) Fast-fase ekstraksjon (SPE) Kilde: waters.com Analysemetoder for bestemmelse av fettløselige vitaminer i serum: Vitamin A, D og E: Væskekromatografi med UV eller MS deteksjon. Prøveopparbeidelse med proteinfelling, væske-væske ekstraksjon og fast-fase ekstraksjon Immunoassay er tilgjengelig for 25-OH-vitamin D Vitamin K: Væskekromatografi med fluorescence detektor LC-MS/MS Omfattende prøveopparbeidelse med store volum løsemidler 9

10 Forutsetninger ved metodeutvikling Mange prøver -> «High throughput» Arbeide i 96-brønnsplater (DWP) Semi-automatisering all pipettering ved hjelp av robot «Keep it simple» (metoder og programmering) Så generelle metoder som mulig (mange brukere) HMS bruke så «snille» kjemikalier som mulig Våre vitamin-metoder Vitamin A, D og E: Serum Proteinfelling/IS med metanol Væske-væske ekstraksjon med heptan LC-MS/MS Vitamin K: Serum Proteinfelling/IS med metanol/etanol Fast-fase ekstraksjon (SPE) med Oasis HLB og heptan SFC-MS/MS 10

11 Rutineanalyse Mange prøver. Prøveflyt fra pre-analyse til ferdig resultat. Semi-automatisert prøveopparbeidelse med pipetteringsrobot og annet «småutstyr». Rutineanalyse Overføring av barkoder til kromatografi-instrumenter og oppstart av instrument 11

12 Rutineanalyse Analyse på kromatografi-instrumenter over natt. Rutineanalyse Resultatbehandling: Prosessering og vurdering av kromatogram for alle standarder, kontroller og prøver. 12

13 Kromatogram 1 C D E A B Vurdering av: - Integrering - Retensjonstid - Internstandard C D E A B - Ratio Qual/Quant Kromatogram 2 A: m/z overgang C D E A B: Signalintensitet B C: Retensjonstid Kromatogram 3 D: Areal E: Høyde Vitamin D (proteinfelling/ væske-væske ekstraksjon) 13

14 Vitamin D Prøveopparbeidelse 1. Fellingsreagens med IS 2. Tilsetning av prøve 3. Utfelling av proteiner 4. Ekstraksjonsmiddel 5. Kraftig blanding med påfølgende sentrifugering 6. Overføring 7. Inndampning Kilde: Thomas Bjellaas Vitamin D (proteinfelling/ væske-væske ekstraksjon)

15 Vitamin K (proteinfelling/ fast-fase ekstraksjon) Vitamin K (proteinfelling/ fast-fase ekstraksjon)

16 Noen utfordringer ved rutineanalyse: Oppdage «det unormale» krever erfaring fra «normaltilstand». «Dag til dag» variasjoner i instrumenter og kromatografien. Feil kan oppstå i alle trinn, viktig å vite hva som skjedde «i går» eller «i forrige uke» for å kunne vurdere og feilsøke. Utfordringer øker med økende antall instrumenter må vite at alle er like gode selv om de er ulike. Økende behov for vedlikehold! Takk for meg! - og takk til kromatografigjengen på Fürst 16