UPC 2 MSMS Teori og anvendelsesområder. Solfrid Hegstad. Hva er UPC 2? Ultra Performance (UP) Convergence Chromatography (CC)=UPC 2

Størrelse: px

Begynne med side:

Download "UPC 2 MSMS Teori og anvendelsesområder. Solfrid Hegstad. Hva er UPC 2? Ultra Performance (UP) Convergence Chromatography (CC)=UPC 2"

Finn Mortensen
5 år siden
Visninger:

1 UPC 2 MSMS Teori og anvendelsesområder Solfrid Hegstad Hva er UPC 2? Ultra Performance (UP) Convergence Chromatography (CC)=UPC 2 1

2 Hva er UPC 2? Ultra Performance (UP) Convergence Chromatography (CC)=UPC 2 GC: Mobil fase gass LC: Mobil fase væske UPC 2 : Mobil fase gass og væske UPC 2 : Kombinasjon av superkritisk fluid kromatografi (SFC) og LC Historisk perspektiv Superkritisk Fluid Kromatografi (SFC) Teknikk først beskrevet i 1962 Dårlig reproduserbarhet, lite robust, lav sensitivitet Ikke egnet for kvantitative analyser Vanskeligheter med å koble til massespektrometer Preparativ kromatografi i legemiddelindustrien 2

3 SFC SFC Middels polare til upolare Termolabile Isomere Kirale 3

lett endres H 2 O 374 221 Ekstreme forhold er nødvendig Metanol 24 8 Ekstreme forhold er

4 SFC Superkritisk fluid: En substans over sin kritiske temperatur og trykk SFC mobil faser Substans Kritisk temp ( o C) Kritisk trykk (bar) Kommentar CO Fysisk tilstand kan lett endres H 2 O Ekstreme forhold er nødvendig Metanol 24 8 Ekstreme forhold er nødvendig Ammonia Sterk etsende Freon Miljøuvennlig N 2 O Oksideringsmiddel 4

SFC mobil faser Substans Kritisk temp ( o C) Kritisk trykk (bar) Kommentar CO 2 31 73 Fysisk tilstand kan lett endres H 2 O 374 221 Ekstreme forhold er nødvendig

5 SFC mobil faser Substans Kritisk temp ( o C) Kritisk trykk (bar) Kommentar CO Fysisk tilstand kan lett endres H 2 O Ekstreme forhold er nødvendig Metanol 24 8 Ekstreme forhold er nødvendig Ammonia Sterk etsende Freon Miljøuvennlig N 2 O Oksideringsmiddel Superkritisk CO 2 73 bar 31,3 C ~ 34 K 5

6 Fysikalske egenskaper Hvorfor er superkritisk fluid en god mobil fase for kromatografiske analyser? Diffusivitet (cm 2 /s) Viskositet (g/cm x s) Tetthet (g/cm 3 ) Gass Superkritisk fluid (væskelignende) (gasslignende),2 1 Væske < , Diffusivitet: Beskriver hastigheten som en substans kan gå gjennom en annen Tetthet påvirker løseligheten av analytt i mobilfasen Fysikalske egenskaper Hvorfor er superkritisk fluid en god mobil fase for kromatografiske analyser? Diffusivitet * (cm 2 /s) Viskositet (g/cm x s) Tetthet (g/cm 3 ) Gass Superkritisk fluid (væskelignende) (gasslignende),2 1 Væske < , Diffusivitet: Beskriver hastigheten som en substans kan gå gjennom en annen Tetthet påvirker løseligheten av analytt i mobilfasen Høy diffusivitet og lav viskositet som kombineres i SFC gir rask og effektiv kromatografi. 6

7 CO 2 tetthet, trykk og temperatur Redusert tetthet,47 g/ml Temperaturøkning 73 bar ~ 7,3 MPa ~ 158 psi Økende trykk Redusert tetthet nedsatt løselighet økt retensjon SFC nyere tid UPC 2 Waters, 212 Stabil trykkregulator God kontroll på trykk tetthet Lavt systemvolum Smalere kromatografiske topper LC lignende kolonner Større fleksibilitet ved valg av stasjonær fase Utviklet for å kobles til MS UPC 2 robust og egnet for kvantitativ analyse 7

8 UPC 2 Mobil faser Mobil fase = Superkritisk fluid UPC 2 Mobil faser Mobil fase = Superkritisk fluid + co solvent + 8

2 styrke Co Solvent Pentan, heksan, heptan Xylen Toluen Dietyl eter Diklormetan Kloroform Aceton

9 UPC 2 Mobil faser Mobil fase = Superkritisk fluid + co solvent Co solvent (mobil fase B) kan påvirke: Løselighet i mobil fasen Elueringsstyrke i mobil fasen Overflateaktivitet i kolonnen + CO 2 styrke Co Solvent Pentan, heksan, heptan Xylen Toluen Dietyl eter Diklormetan Kloroform Aceton Dioxan THF MTBE Etylacetat DMSO Acetonitril 2 Propanol Etanol Metanol Elueringsstyrke Svakest Sterkest 9

10 UPC 2 Mobil faser Mobil fase = Superkritisk fluid + co solvent + Metanol Etanol 2 propanol ACN m. fl. UPC 2 Mobil faser Mobil fase = Superkritisk fluid + co solvent + Metanol Etanol Co-solvent konsentrasjon Polaritet 2 propanol ACN m. fl. 1

11 UPC 2 Mobil faser Additiv = + UPC 2 Mobil faser Additiv = Salt eller væske tilsatt co solventen + 11

12 UPC 2 Mobil faser Additiv = Salt eller væske tilsatt co solventen Formål: Forbedre toppfasong Forbedre analytt løselighet Kan påvirke selektivitet + UPC 2 Mobil faser Additiv = Salt eller væske tilsatt co solventen + Dietylamin Ammonium hydroksyd Maursyre Trifluoreddiksyre Ammoniumformat m. fl. 12

13 UPC 2 Mobil faser Additiv = Salt eller væske tilsatt co solventen + Dietylamin Ammonium hydroksyd Ammoniumformat Maursyre Trifluoreddiksyre m. fl. UPC 2 Mobil faser Additiv = Salt eller væske tilsatt co solventen + Dietylamin Ammonium hydroksyd Ammoniumformat Maursyre Trifluoreddiksyre m. fl. 13

14 ACQUITY UPC 2 kolonner ACQUITY UPC 2 Trefoil AMY1 amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) ACQUITY UPC 2 Trefoil CEL1 cellulose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) ACQUITY UPC 2 Trefoil CEL2 cellulose tris-(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) ACQUITY UPC 2 BEH 2-EP 2-Ethylpyridine ACQUITY UPC 2 BEH Unbonded BEH particle BEH, CSH & HSS Technology ACQUITY UPC 2 CSH Fluoro-Phenyl Charged surface hybrid fluoro-phenyl ACQUITY UPC 2 HSS C 18 SB High strength silica C18 Optimalisering av separasjonen med UPC 2 Toppform Retensjon Selektivitet Stasjonær fase Co Solvent Additiv Trykk* Flow hastighet* Temperatur* Injeksjon løsning 2 (*) Påvirker tetthet 1 Størst effekt 4 Minst effekt 14

15 UPC 2 MSMS Hvordan virker UPC 2 systemet? 15

16 Hvordan virker UPC 2 systemet? Hvordan virker UPC 2 systemet? 16

17 Hvordan virker UPC 2 systemet? Hvordan virker UPC 2 systemet? 17

18 Hvordan virker UPC 2 systemet? Kiral amfetamin Anvendelsesområder Isomere amfetaminer Syntetisk cannabis Anabole steroider Fettsyrer Vitaminer 18

19 Metodeutvikling våre erfaringer Fettsyrer i fullblod R/S Citalopram i serum R/S Amfetamin i urin Legalt S amfetamin Illegalt R/S amfetamin Strategier for å forbedre selektivitet og kromatografisk separasjon Analytisk kolonne/stasjonær fase Endre co solvent og/eller blandinger av co solventer Additiver Endre tetthet på mobil fasen ved å endre trykket eller kolonnetemperatur Injeksjonsvolum 19

Effekt av stasjonær fase R/S Citalopram To ulike kirale kolonner UPC 2 Trefoil CEL2 UPC 2 Trefoil AMY1 3 mm X 15 mm, 2,5 µm Effekt av stasjonær fase R/S

20 Effekt av stasjonær fase R/S Citalopram To ulike kirale kolonner UPC 2 Trefoil CEL2 UPC 2 Trefoil AMY1 3 mm X 15 mm, 2,5 µm Effekt av stasjonær fase R/S Citalopram Trefoil AMY1 Trefoil CEL2 R/S Citalopram R Citalopram S Citalopram A:CO 2, B: Metanol/acetonitril (7/3) 1 mm ammonium acetat Gradient: 4 min; 25 B til 4 B 2

21 Effekt av co solvent R/S Amfetamin Chiralpak AD 3 2,1 mm X 15 mm, 3 µm Metanol Metanol/2 propanol, 5/5 Co solvent: Metanol Additiv:,25 NH 4 OH Effekt av co solvent R/S Amfetamin Co solvent: Metanol/2 propanol, 5/5 Additiv:,25 NH 4 OH test 43 MRM of 4 Channels ES test 32 MRM of 4 Channels ES > 119 (Amfetamin) e > 119 (Amfetamin) 1.83e7 S Amfetamin 2.64 R/S Amfetamin R Amfetamin Time Time

22 Effekt av additiv R/S Amfetamin Additiv:,25 NH 4 OH Co solvent: Metanol/2 propanol, 5/5 Additiv:,3 syklohexylamin Co solvent: Metanol/2 propanol, 5/5 S Amf R Amf S Amf R Amf Effekt av trykk Linolensyre Kolonne HSS C 18 SB 2,1Xmm, 1,8 µm 22

23 Effekt av kolonnetemperatur Linolensyre 5 C 6 C 7 C Effekt av kolonnetemperatur R/S Citalopram R Citalopram S Citalopram 35 C 5 C 6 C? X 23

Effekt av injeksjonsvolum R/S Citalopram 1 µl µl serum 375 µl ACN m/ 1 maursyre 3 µl 4 µl 6 µl Tid (min) Flow (ml/min) UPC 2 gradient R/S Citalopram CO 2 () B () Kurve Initial 2, 75

24 Effekt av injeksjonsvolum R/S Citalopram 1 µl µl serum 375 µl ACN m/ 1 maursyre 3 µl 4 µl 6 µl Tid (min) Flow (ml/min) UPC 2 gradient R/S Citalopram CO 2 () B () Kurve Initial 2, 75 25,3 2, , 2, ,8 2, ,5 2, ,6 2, , 2, B: Metanol/acetonitril (7/3) 1 mm ammonium acetat Analysekolonne: Trefoil CEL2 Kolonne temperatur: 35 C 24

25 R/S Citalopram i serum UPC 2 MSMS UPLC MSMS F1:MRM of 1 channel,es+ R-Citalopram_S > e+4 R_Citalopram_S 6.58 F1:MRM of 2 channels,es+ 325 > e min min IS R-Citalopram-d F2:MRM of 1 channel,es > e F2:MRM of 1 channel,es+ IS R-Citalopram-d > e min min 4 min, flow 2 ml/min 12 min flow 1 ml/min R/S Citalopram i serum R Citalopram 5 5 nm Std1 Std 5 nm F1:MRM of 1 channel,es+ R_Citalopram_S > e+4 6. Response Std1 min F2:MRM of 1 channel,es+ IS R-Citalopram-d > e+5 -. nm min 2 prøver per år 25

R/S Amfetamin i urin Response 6. 5. 4. 3. 2. 1. S Amfetamin 5 ng/ml -.

26 R/S Amfetamin i urin Response S Amfetamin 5 ng/ml -. µg/l Std 5 ng/ml 21AKIRAMF_6 Smooth(Mn,3x3) F1:MRM of 2 channels,es+ Std1 S-Amfetamin > e+4 21AKIRAMF_6 Smooth(Mn,3x3) F2:MRM of 1 channel,es+ Std1 IS S-amfetamin-d3 139 > e min min 25 prøver per år 26

27 Prøve 1 S Amfetamin 811ASOH3_ F1:MRM of 2 channels,es > e+6 S Amfetamin d 811ASOH3_ min F2:MRM of 1 channel,es > e+4 Konklusjon: Legalt amfetamin R Amfetamin d min Prøve 2 S Amfetamin 811ASOH3_ F1:MRM of 2 channels,es > e+5 R Amfetamin S Amfetamin d 811ASOH3_2 3 min F2:MRM of 1 channel,es > e+4 Konklusjon: Illegalt amfetamin R Amfetamin d min 27

28 Prøve 3 S Amfetamin 91AHH1_ F1:MRM of 2 channels,es > e+6 S Amfetamin d 91AHH1_ R Amfetamin 2.36 min F2:MRM of 1 channel,es > e+4 Konklusjon: Legalt og illegalt amfetamin R Amfetamin d min Utfordringer Høyt trykk/lekkasje i CO 2 pumpa Renhet CO 2 er viktig Ingen ventil på MS viktig med rene prøver Splitter ca 8 av prøven i waste mindre prøve inn i MS en Begrenset injeksjonsvolum i forhold til LC Gassflaske i rommet Flere organiske løsninger enn vanlig LC, make up solvent og to vaske løsninger 28

29 Konklusjon Relativt kort analysetid for kirale metoder Stabile retensjonstider og trykk Enkel i bruk Samme programvare som våre UPLCsystem Valideringen av metodene viser gode resultater mhp reproduserbarhet mm To metoder i rutinedrift Robust 29

Like dokumenter

Hva bør man tenke på ved valg av kromatografi som analysemetodikk. Ingeborg Amundsen 4. februar 2015

Hva bør man tenke på ved valg av kromatografi som analysemetodikk Ingeborg Amundsen 4. februar 2015 Agenda Kromatografiske metoder Ny analysemetode- viktige spørsmål Screening/bekreftelse Ny analysemetode-hvor