Analyse av testosteron i serum Immunologisk metode vs. LC/MS/MS-teknikk

Transkript

1 1 Analyse av testosteron i serum Immunologisk metode vs. LC/MS/MS-teknikk Erling Sagen St. Olavs hospital Avd. for medisinsk biokjemi Testosteron 2 Strukturformel: Bruttoformel: C 19 H 28 O 2 Molekylvekt: 288,3 g/mol Testosteron er det viktigste mannlige kjønnshormonet Det dannes primært i testikler hos menn og i eggstokker hos kvinner I mindre mengder i binyrebarken hos begge kjønn Normale konsentrasjoner i serum: Voksne kvinner: 0,3 1,4 nmol/l Voksne menn: 6,7 31,9 nmol/l Barn: Ca. 10% av voksenverdi for jenter, ca. 1% av voksenverdi for gutter Konsentrasjonen avtar gradvis med alderen, spesielt hos menn Indikasjon: Menn: Spørsmål om hypogonadisme, for tidlig pubertet (puertas praecox) eller forsinket pubertetsutvikling (pubertas tarda), impotens. Oppfølging av testosteronbehandling Kvinner: Utredning av hirsutisme, virilisering, amenoré, ved spørsmål om polycystisk ovarialsyndrom, ved mistanke om ovarie- eller binyrebarktumor 1

2 3 Analysemetoder for s-testosteron Radioimmunoassay (RIA) etter opprensing med væskeekstraksjon og kromatografi (ca. 1970) Automatiske immunologiske teknikker uten opprensing Gasskromatografi/massespektrometri (GC/MS) - Gullstandard - Reproduserbar/spesifikk - Arbeidskrevende - Lang analysetid - Krever stort prøvevolum (> 1 ml) Væskekromatografi/tandem massespektrometri (LC/MS/MS) (St. Olavs hospital nov. 2008) Immunoassay Definisjon Et immunoassay er en kvantitativ målemetode som baserer seg på reaksjon mellom et antigen (analytt) og ett eller flere spesifikke antistoffer For deteksjon og kvantitering er antistoffet koblet til en signalsubstans («merkelapp») Signalsubstanser (merkelapper) Radioaktive isotoper ( 125 I, 3 H) (Radioimmunoassay, RIA) Enzymer (pepperrot peroksidase, alkalisk fosfatase, glukose oksidase) (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) Fluorescerende forbindelser Kjemiluminiscerende forbindelser Forbindelser som gir lysspredning To hovedtyper immunoassays Kompetitive: Merket og umerket antigen (analytt) konkurrerer om bindingen til antistoff Non-kompetitive («sandwich»): To ulike antistoffer rettet mot to ulike epitoper på antigenet (analytten) Utførelse Antigen og antistoff blandes og inkuberes Skille bundet og ubundet merket reagens (antistoff) Måling av responssignal Avlesning mot standardkurve og beregning av analyttkonsentrasjon Basiskomponenter i et immunoassay Spesifisitet Spesifisiteten er avhengig av bindingen mellom antistoff og bindingssetet (epitopen) på antigenet Sensitivitet Sensitiviteten er avhengig av detekterbarheten av merkelappen 4 2

3 5 LC/MS/MS-teknikk (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry) Definisjon LC/MS/MS er en analyseteknikk for kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av kjemiske forbindelser basert på kromatografisk separasjon, ionisering og måling av masse/ladningsforhold (m/z). Instrumentering Væskekromatograf (LC) Massespektrometer (MS) LC/MS/MS-instrument 6 3

4 Massefilter (quadrupol, Q) 7 Fire parallelle metallstaver pålegges en fast likespenning og en vekselspenning Spenningen justeres slik at analyttioner med et bestemt masse/ladningsforhold (m/z) får en stabil bane mellom stavene og treffer detektoren Andre ioner kolliderer med stavene og forsvinner uten å treffe detektoren Måling av testosteron med LC/MS/MS-teknikk 8 Prøveopparbeidelse 500 µl serum tilsettes 30 µl intern standard (D 2 -testosteron, 50 nm) Ekstraksjon med 5 ml diethylether/ethylacetat (70/30), mix 10 sek. Sentrifugering (3000 x g i 5 min) Inndamping til tørrhet av organisk fase under nitrogen v/37 C Reoppløsning i 250 µl 50% metanol/vann Injeksjon på LC/MS/MS Analyse Kolonne: Zorbax SB-C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 µm) Mobilfase: Metanol/100 µm ammoniumacetat (70/30) Flow: 0,25 ml/min Injeksjonsvolum: 25 µl Ionekilde: ESI-ionisasjon (elektrospray), positive mode Detektor: MRM-deteksjon (multiple-reaction monitoring) Ioneoverganger: Testosteron m/z 289,3 97,1 Intern standard m/z 291,2 99,2 Kvantitering: Intern standard og åtte kalibratorer (0,1 50 nmol/l) 4

5 9 Massespektrometer (Analyse av testosteron) Ionekilde Q1 Q2 Q3 Detektor LC Kollisjonscelle Positiv elektrospray ionisering (ESI): [M + H + ] Testosteron: m/z 289,3 D 2 -Testosteron: m/z 291,3 Synonyme begreper: LC/MS/MS = LC/Tandem massespektrometri = LC/Trippelquadrupol = LC/QQQ Valg av molekyl-ion (moder-ion, precursor ion) (m/z 289,3) (m/z 291,3) Fragmentering av molekyl-ion med nitrogen Valg av produkt-ion (datter-ion) Quantifier: m/z 97,0 Qualifier: m/z 109,0 Quantifier: m/z 99,0 Qualifier: m/z 111,0 Testosteron Massespekter Produktion-spekter 10 D2-Testosteron Massespekter Produktion-spekter 5

6 Kalibreringskurve 11 Kromatogram 12 Kalibrator 0,5 nmol/l 6

7 13 Kromatogram Pasientprøve (kons. 0,4 nmol/l) 14 Validering Riktighet Verdi sporbar til innveid mengde testosteron (Fluka, kat.nr ) Analytisk recovery 101,6 % Impresisjon Analytisk dag-til-dag variasjonskoeffisient: 6,1 % ved 2,2 nmol/l (n=8) 3,9 % ved 28,6 nmol/l (n=8) Innen-serie-variasjonskoeffisient: 19,9 % ved 0,15 nmol/l (n=10) 0,6 % ved 28,0 nmol/l (n=10) Deteksjonsgrense 0,05 nmol/l (signal/støyforhold=5) 7

8 15 40 s-testosteron, metodesammenligning (Passing and Bablok regression) (n = 40) Immunoassay Roche Modular (nm) LC/MS/MS (nm) 16 RATIO of Immunoassay Roche Modular and LC/MS/MS 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0-0,5 s-testosteron, metodesammenligning (Bland and Altman plot) (n = 40) SD 2, AVERAGE of Immunoassay Roche Modular and LC/MS/MS (nm) Mean 1, SD 0,01 8

9 Ekstern kvalitetskontroll (NKK/Labquality) 17 Ekstern kvalitetskontroll (NKK/Labquality) 18 9

10 19 Konklusjon Immunoassay er en upålitelig metode for testosteron i serum, spesielt for lave konsentrasjoner (barn, kvinner, menn med hypogonadisme) (P.g.a indirekte metode, kryssreaktivitet, interferens, matrikseffekter etc.) LC/MS/MS er mer pålitelig og har større spesifisitet og sensitivitet enn immunoassay LC/MS/MS har stor mulighet til å måle flere analytter i samme oppsett (St. Olav har testosteron, androstendion og 17α-hydroksyprogesteron i samme run) LC/MS/MS kan inkludere hormoner som det ikke finnes immunoassay for Enkelte endokrinologiske tidsskrifter har krav om LC/MS/MS-basert metode i manuskripter som bruker kjønnshormonanalyser som viktige endepunkter Norsk endokrinologisk veileder anbefaler også LC/MS/MS-teknikk for steroidhormoner Vær OBS på metodikk ved tolkning av laboratoriesvar og ved litteraturgjennomgang Litteratur a) Taieb J et al. Testosterone Measured by 10 Immunoassays and by Isotope-Dilution Gas Chromatography Mass Spectrometry in Sera from 116 Men, Women, and Children. Clin.Chem. 49:8, (2003) b) Wang C et al. Measurement of Total Serum Testosterone in Adult Men: Comparison of Current Laboratory Methods Versus Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J.Clin.Endocrinol.Metab. 89, (2004) c) Cawood ML et al. Testosterone Measurement by Isotope-Dilution Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry: Validation of a Method for Routine Clinical Practice. Clin.Chem. 51:8, (2005) d) Kushnir MM et al. Performance Characteristics of a Novel Tandem Mass Spectrometry Assay for Serum Testosterone. Clin.Chem. 52:1, (2006) e) Turpeinen U et al. Determination of testosterone in serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Scand.J.Clin.Lab.Invest. 68(1), (2007) f) Nasjonal Veileder i Endokrinologi (2018) 20 10