Forelesninger i BI Cellebiologi Proteinrensing - Væskekromatografi. Figure 3-43 b

Transkript

1 Proteinrensing - Væskekromatografi Figure 3-43 b

2 Proteinrensing - Væskekromatografi Ved affinitets-kromatografi brukes en søyle med kuler som er dekket med ligander (f.eks. et enzym-substrat eller et annet molekyl) som binder til seg spesifikke proteiner. I den praktiske oppgaven som skal demonstreres vil brukes Concavalin A (Con A) - Sepharose gel som er spesielt egnet for separasjon av glykoproteiner. Con A er et lektin dvs. et protein som binder karbohydrater. En spesiell form er antistoff-affinitets-kromatografi hvor liganden er et antistoff som er spesifikk for det aktuelle proteinet (se Figure 3-43 c). Alle andre proteiner renner direkte gjennom søylen - uavhengig av ladning og masse. Elueringen av bundet protein skjer ved tilførsel av overskudd av antistoff eller endring av ph eller saltkonsentrasjon som bryter antigen-antistoff-bindingen.

3 Proteinrensing - Væskekromatografi Figure 3-43 c

4 Proteinrensing - Praktisk demo på lab. I den praktiske oppgaven brukes Concavalin A (Con A) -Sepharose gel. Proteinet som skal renses er polygalacturonase-inhibitor-protein (PGIP) som er jordbærplantens svar på angrep fra soppen gråskimmel som produserer polygalacturonase (PG) for å nedbryte celleveggen i jordbæret. Undersøkelser av PGIP og PG er helt sentrale i vårt EU-prosjekt hvis mål er genmodifisering av jordbærplanter for å gjøre disse mer resistente mot gråskimmel. PGIP er et glykoprotein som etter isolering fra jordbærplantene felles (denatureres reversibelt) med ammoniumsulfat(nh 4 SO 4 ). Praktisk forsøk på lab: PGIP felles med NH 4 SO 4 og løses på nytt i Con A-buffer Lektin i Con A er et protein som binder karbohydrat-delen i PGIP (f.eks.dmannopyranosyl) ; de øvrige proteiner går gjennom søylen uhindret Etter at de ikke-bundne proteinene er gått igjennom søylen elueres PGIP ut ved tilførsel av metyl- D-mannopyranosyl. Bestemmelse av tilstedeværende PGIP i fraksjonene skjer vha spesifikke antistoffer (ELISA og Western blot). I den praktiske demonstrasjonen brukes elektroforese og proteinfarging - etter Con A elueringen.

5 Proteinpåvisning - Mer bruk av enzymer og antistoffer Det kreves en spesifikk assay for å selektere utvalgte proteiner fra søylefraksjoner eller gelbånd. Ulike typer slike assay er : Kromogene reaksjoner Lys-emitterende enzym-reaksjoner Western-blotting Kromogene reaksjoner :Dette er et prinsipp som baseres på at et enzym bruker et farge(kromogent)-substrat som skifter farge i løpet av reaksjonen. Dette brukes mye i tilknytning til sekundære antistoffer. Lys-emitterende enzym-reaksjoner :Luciferase er mest typisk eksempelenzymet finnes bl.a. i insekter og bakterier og gir en lys-utstråling der hvor spesifikke proteiner er lokalisert. Western-blotting : Immunoblotting - er en av de viktigste metoder for proteinseparasjon og karakterisering. Ved bruk av f.eks. to ulike antistoffer kan det søkte proteinet finnes (se Figure 3-44). I praktisk forsøk på lab vil apparatur, montering av gel, bruk av membran etc. demonstreres.

6 Proteinpåvisning - Western-blotting (immuno-blotting) Figure 3-44

7 Protein- og nukleinsyrepåvisning - Bruk av radioisotoper Bruk av radioisotoper er sentralt i eksperimentell biologi. De vanligste er vist i Table 3-2. Tilstedeværelse av isotopene endrer ikke de kjemiske egenskaper til det molekylet som isotopen er en del av. Spesielle krav til radioisotoper : Spesifikk aktivitet (dpm =disintegration per min per mmol), halveringstid (se Table 3-2) Isotopmerking og påvisning av merkete molekyler : Autoradiografi er en semikvantitativ visuell test (Figure 3-45)

8 Protein- og nukleinsyrepåvisning - Bruk av radioisotoper Figure 3-45a Figure 3-45b

9 Proteinkarakterisering ved bruk av kjemiske metoder Klassisk metode for bestemmelse av aminosyresekvenser - Edman degradering (Figure 3-46). Prinsippet er at aminosyre-gruppen ved den N-terminale enden blir merket ved kobling til PITC (Cycle 1) og påfølgende syrehydrolyse gir syklisk PTH-derivat og et polypeptid som er en aminosyre kortere. Prosedyren gjentas. PTH-derivatet blir bestemt med HPLC. Metoden anvendt frem til Alternativ og mer moderne metoder er rekombinant DNA-teknikker : Påvisning og kloning av mrna Gen-koding av spesifikk protein Sekvensering av mrna og DNA er raskere enn kjemisk sekvensering av proteiner (kfr. HUGO-prosjektet)

10 Proteinkarakterisering ved bruk av kjemiske metoder Figure 3-46

11 Proteinkarakterisering ved bruk av massespektrometri Bestemmelse av protein-masse skjer ved massespektrometri (Figure 3-47). Krever metode for ionisering av prøven ved bruk av laser og aksellerering av ionet som flyr ned et rør mot detektor. Flytiden er viktig : omvendt proporsjonal med massen og direkte proporsjonal med proteinets ladning. Peptid-masse finger-print kombinert med massespektrometri og kjennskap til genomsekvenser, er en metode som har tilnærmet eliminert kjemisk sekvensering for å bestemme et proteins primærstruktur. Figure 3-47

12 Syntese av peptidsekvenser Syntetiske peptider - som er identiske med peptider syntetisert i cellene - er viktige i studier av proteiner og celler. Petider med lengde på rester er tilstrekkelige som antigen for antistoff-produksjon i dyr (kfr. EU-prosjektet). På kurset vil vi benytte antistoffer dannet på grunnlag av slike syntetiske peptider (blir nærmere gjennomgått før de praktiske ELISA-tester). Syntesen av peptidene skjer fra monomere aminosyrer ved kondensasjonsreaksjoner som danner peptid-bindingene (Figure 3-48).

13 Syntese av peptidsekvenser Figure 3-48

14 Bestemmelse av proteinkonformasjon Protein-konformasjon (dvs. 3D-form) bestemmes med avanserte fysiske metoder : X-ray krystallografi (Figure 3-49) Cryoelektron-mikroskopi NMR spektroskopi For detaljer om disse metodene henvises til andre lærebøker. Figure 3-49