Takk til. Kromatografisk separasjon og deteksjon. Disposisjon. Hvorfor separere stoffer? Hvordan separere stoffer?

Transkript

1 Kromatografisk separasjon og deteksjon Takk til Professor Leon Reubsaet, Farmasøytisk Institutt Elisabeth og Åse Marit Leere Øiestad, Avdeling for rusmiddelforskning og metodeutvikling, Folkehelseinstituttet Disposisjon Innledning - historikk Kromatografiske parametere Analytters egenskaper Kromatografi definisjoner Typer kromatografi prinsipper vs. teknikker Deteksjon Kromatografi Kromatografi = fargeskriving (Tsvet 1903) chroma - farge grafi skrive Separerte klorofyll og karotenoider Samlenavn på separasjonsmetoder Hvorfor separere stoffer? Hvordan separere stoffer? Prøvene er komplekse blandinger interessert i å analysere noen få stoffer i blandingen Kvalitetskontroll råvarer forurensninger preparater produktkontroll, holdbarhetskontroll (spaltningsprodukter) Sporanalyse stoffer i biologisk materiale fullblod, plasma, urin, spytt, vev, matvarer etc. La stoffblandingen vandre en viss lengde. hvis stoffene vandrer med forskjellig hastighet vil de kunne separeres hvis forskjell i vandringshastighet er stor nok hvis veien stoffene vandrer er lang nok start mål Løypa stoffene vandrer gjennom kalles en kolonne 1

2 Separasjonsprinsipper Separasjonsprinsipper I kromatografi tvinges stoffene gjennom løypa (kolonnen) med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet væsken eller gassen kalles mobil fase Kolonnen / stasjonærfasen holder stoffene tilbake - retensjon stoffene kan separeres hvis retensjonen er forskjellig I kromatografi gjelder det å velge riktige betingelser som sikrer at stoffene vandrer gjennom løypa med tilstrekkelig forskjell i hastighet og samtidig separeres på kortest mulig tid Kromatografisk separasjon Retensjon 1. Stoffene beveger seg med forskjellig hastighet 2. Stoffene spres i lengderetningen når de vandrer K = C s C m Fordelingskoeffisienten bestemmer hvor mye av stoffet som vil oppholde seg i stasjonær fase (BESTEMMER RETENSJNEN) Båndspredning K = C s C m a. Stoffet oppholder seg bare i mobil fase og retarderes ikke av stasjonær fase b. Stoffet oppholder seg i svært stor grad i stasjonær fase og vandrer svært langsomt - kraftig retensjon Får alltid båndspredning fordi molekyler av samme type har forskjellig (gjennomsnitts) hastighet Skyldes fysiske prosesser 2

3 Van Deemter Høyere optimal flowhastighet for små partikler enn store. Høyere flow gir smalere og høyere topper. Figur fra Waters 5 μm partikel 1.7 μm partikler 60 μm menneskehår Kromatogram Resultatet av en kromatografisk separasjon Kromatografiske parametre 1. Retensjonstiden t R karakteriserer retensjonen - interaksjonen med stasjonær fase (brukes til identifikasjon) 2. Bredden av toppene t W (ved grunnlinjen) karakteriserer båndspredningen 3. t 0 er tiden et ikke retardert stoff bruker gjennom kolonnen Retensjonsfaktor retensjonstid retensjonsvolum Teoretiske plater høydeekvivalenten til en teoretisk plate ppløsningsevne k 1? Retensjonsfaktor eksempel k 1 = (8,944-1,25) 1,25 k 1 = 6,16 k = (t r -t 0 )/t 0 Teoretiske plater eksempel w 4 1/2 = 0,44 min N? N 16 t r w b 2 N 16 28,21 2 0,77 N t 0= t 0=

4 k ) R s = 1/4 ( - 1) N ( 1 + k ppløsningsevne eksempel t R s 5 t 4 1 2(w 4 b w 5 b ) Hva er R s mellom topp 4 og 5? 31,62 28,21 R s w 4 1 b = 0,77 min 2(0,77 0,86) w 5 b = 0,86 min R s 4,2 Effekt av selektivitet, effektivitet og retensjon t 0= Analytten Lipofilisitet = fettløselighet Hydrofilisitet = vannløselighet Polare funksjonelle grupper - lokalisert eller spredt ut over molekylet? Størrelsen på upolar del av molekylet Sure og basiske grupper pka-verdier Analytten Flyktighet, størrelse, stabilitet Egenskaper av betydning for deteksjon UV-absorbans Fluorescens ksiderbarhet Bestemte grunnstoffer (nitrogen, fosfor, halogener) Konsentrasjon Eksempel: Ladningen av morfin ved forskjellige ph-verdier Morfin: pka1= 8.0 pka2 =9.9 Ladet CH + 3 NH ph = 8 50 av molekylene er ladet på aminet 50 er uladet på aminet ~99 er uladet på oksygenene N CH 3 Ladet ph ~ 6 CH + 3 NH 99 av molekylene er ladet på aminet er uladet på oksygenene - Ladet N CH 3 ph = 10 N CH 3 99 av molekylene er uladet på aminet ~50 er ladet på det ene oksygenet ~50 er uladet på oksygenene Figur lånt av Thomas Berg, FHI Matriks Vanlige komponenter som må vurderes Proteiner Fett Salter Endogene forbindelser Andre stoffer/metabolitter Hvordan foreligger analytten Grad av proteinbinding Konjugert Er det forbindelser som kan interferere eller ødelegge for analysen? 4

5 Uegnet prøve Flere grunner til at en prøve kan være uegnet Ikke egnet for prøveopparbeidelsesmetoden Ikke egnet for analyseinstrumentet Inneholder andre stoffer som gir falske negative eller positive utslag En prøve kan derfor godt være uegnet for f.eks en GC-analyse, men K for en HPLC-analyse Prinsipper NB! Prinsipp er ikke det samme som teknikk (metode) Prinsipper (type stasjonærfase i kolonnen) Adsorpsjon Fordeling/faste kjemisk bundne stasjonærfaser Ionebytte Eksklusjon (gel) Stasjonærfasen i kolonnen holder stoffene tilbake - retensjon Stoffene tvinges i gjennom kolonnen med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet (gassen/væsken kalles mobilfasen) Gasskromatografi (GC) Mobilfasen er en gass Teknikker Væskekromatografi (UHPLC/HPLC el LC) Mobilfasen er en væske Kolonne preparativ eller analytisk Tynnsjikt (TLC) Superkritisk fluid kromatografi Mobilfasen er et superkritisk fluid (vanligvis superkritisk C 2 ) Prøve (a,b,c) Kromatografi Stasjonærfase Mobilfase Separasjon av en blanding av stoffer (a,b,c) fås hvis stoffene har forskjellig interaksjon med stasjonærfasen (og evt. mobilfasen) Fordelingskromatografi Gasskromatografi Basert på fordeling av et stoff mellom to ikke blandbare væsker. Den ene væsken er adsorbert til en bæresubstans Den bundne, adsorberte væsken kalles den stasjonære fase og den andre væsken den mobile fase Gasskromatografi den stasjonære fase er impregnert som en tynn film på en bæresubstans eller på veggen av en kapillærkolonne Detektorer Flammeionisasjonsdetektor Nitrogen-fosfor detektor MS Vanligvis helium 5

6 Fordelingskromatografi (GC) Fordelingskromatografi (GC) I GC er stasjonærfasen vanligvis silikoner evt silikonoljer eller -gummier Disse har god termisk stabilitet, og variasjon av kjedegrupper gir ulik grad av polaritet. Upolar stasjonærfase separasjon etter kokepunkt (flyktighet) Polar stasjonærfase separasjon etter polaritet (interaksjon) og kokepunkt (dvs. kan separere forbindelser med samme kokepunkt, men forskjellige funksjonelle grupper) Temperaturgradient Fordelingskromatografi HPLC (faste kjemisk bundne stasjonærfaser) den stasjonære fase er vanligvis kjemisk bundet til overflaten av en bæresubstans (silika eller polymer) Væskekromatografi (LC) Detektorer UV Fluorescence Elektrokjemisk MS Separasjonsprinsipper i LC mvendt fase Stasjonærfasen er upolar og mobilfasen er polare væsker slik som metanol, acetonitril eller vann. Vanlige stasjonærfaser: C18, C8 Mer upolare forbindelser har større retensjon i systemet. Aller mest brukte system innen LC per i dag! I omvendt fase kromatografi retarderes stoffene ved hydrofob interaksjon Si Si H 3 C Si Si CH 3 H 3 C Si Si H 3C Hydrofob interaksjon van der Waalske krefter HCH 3 C C Interaksjon mellom hydrokarbonkjedene på C18 og den hydrofobe delen av naproxen 6

7 organic modifier organic modifier Separasjonsprinsipper i LC Normalfase Stasjonærfasen er sterkt polar og mobilfasen er hovedsakelig upolar (slik som heksan). HILIC Separasjonsprinsipper i LC Stasjonærfasen er polar og mobilfasen er upolar ( normalfasesystem ) Mobilfasen inneholder vann Alternativ til omvendt fase kromatografi for polare forbindelser Fordeling mellom mobilfasen og vannlag utenpå stasjonærfasen Begynner å få stor utbredelse. Isokratisk eluering vs. gradient eluering Isokratisk eluering: mobilfasens sammensetning endrer seg ikke under analysen. H 2 2 = hydrogenperoksid Gradienteluering: mobilfasens sammensetning endrer seg under analysen. Brukes når stoffene har stor forskjell i hydrofobisitet Topper som eluerer sent blir smalere Sparer tid! 39 Gradienteluering Ulike muligheter for programmering av gradienten convex linear 40 concave block combined Retensjonsrekkefølge RP C18 Minst hydrofob kommer først ut Lenger hydrofob kjedelengde gir lengre retensjonstid Forgrenet før rettkjedet Umettet før mettet Ionisert form før ikke-ionisert Time (min) Time (min) 7

8 Retensjonen påvirkes av: Retensjonen påvirkes av: Mobilfasens sammensetning Økende innhold av organisk modifikator (ACN, Me) gir mindre retensjon ph Syrer blir minst retardert ved høy ph Baser blir minst retardert ved lav ph Tilsetning av salter Salter kan minske løseligheten i mobil fase Ionepardannere øker stoffets lipofile karakter Tilsetningsstoffer som adsorberes til kolonnen (eks. aminer) gir mindre retensjon samt bedre symmetri og mindre båndspredning ved analyse av baser Stasjonær fase mvendt fase materialer med lange hydrokarbonkjeder som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere hydrokarbonkjeder Materialer med polare overflatergrupper gir mindre retensjon Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon Temperatur Økende temperatur gir mindre retensjon fte ca. 35 grader HPLC, 65 grader UPLC GC vs LC Forskjell i kolonnelengde betyr at man kan få bedre separasjon på en GC-kolonne enn en LC-kolonne GC m LC 2 30 cm I HPLC kan vi i større grad variere mobilfasen og stasjonærfasen flere muligheter Forskjellige krav til flyktighet, løselighet osv. GC må ofte derivatisere Større og mer polare molekyler -> LC Detektorer En detektor skal gi en respons dvs. et elektrisk signal for de stoffer en ønsker å identifisere/kvantifisere Responsen skal være proporsjonal med konsentrasjon av stoff i mobilfasen mengde (massen) av stoff i mobilfasen slik at det kan utføres kvantitative analyser basert på måling av topphøyder/arealer Flammeionisasjonsdetektor (FID) Flammeionisasjonsdetektor (FID) Vanlig GC-detektor rganiske forbindelse med C- H-bindinger forbrennes i en luft/hydrogenflamme og danner ioner (C, C2 detekteres ikke) Ioner samles opp ved anoden under påvirkning av en polariserende spenning (-200 V) Dette gir opphav til en målbar strøm på A Signal probe Signal probe Figur fra Perkin Elmer Collector Flame tip Air Column Hydrogen Generell detektor som registrer de aller fleste stoffer som inneholder karbon Stabil og reproduserbar Stort lineært område Lett å bruke 8

9 UV detektoren Flow cell Diffraction grating Vanlig LC-detektor Svært mange legemidler absorberer UV lys UV detektoren er derfor den mest anvendte detektor i farmasøytisk analyse Filterfotometer Spektrofotometer Mirror Slit Mirror Mirror D 2 lamp f. eks. diodearraydetektoren gir stoffenes UV spektra Flowcellevolum: klassisk vs. nano LC Massespektrometer som detektor lys fotodetektor Mye benyttet som detektor til GC og LC Generell og spesifikk detektor «Gullstandard» innen dopinganalyse og rettstoksikologisk analyse lysvei: 1cm Mobil fase volum: 10 µl Flow: 1 ml/min tid til å fylle detektor: < 1 sec. 5 µl/min tid til å fylle detektor: 2 min.!!!! Flowcellen må tilpasses flow! Massespektrometre Nødvendige egenskaper: - Analytt må kunne komme i gassfasen - Analytt må kunne ioniseres Til sammenligning: UV: analytt må absorbere lys (kromofor) fluorescens: analytt må fluorescere elektrokjemisk: analytt må ha red/ox egenskaper Prinsipp for MS Danner og analyserer ioner stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer) Måler masse over ladning, m/z Analyserer i vakuum (gassfase) Destruktiv teknikk 9

10 Konsekvenser av disse prinsippene Hvis man ikke får dannet ioner kan man ikke se noe til stoffet! Må ha vakuum, ellers blir ionene borte ved kollisjoner med luft Når molekylene blir til ioner går de i stykker slik at man ikke kan måle en gang til på det samme prøvematerialet Gode MS-betingelser = godt vakuum Hva med mobilfasen?? GC: mobilfasen er en gass, og er derfor kompatibel med MS en. LC: mobilfasen er en væske - kan ikke føres direkte inn i vakuum (0,1 ml/min væske ca. ml/min gass!!) Elektronionisering, EI EI Molekyler i gassfase kommer inn ionekilden fra en GC eller fordampes i ionekilden ved hjelp av oppvarming Ved et lavt trykk skytes det på molekylene med en elektronstråle med en energi på 70 ev. Elektronstrålen kommer fra et filament. Molekylene ioniseres til M +. som så går i stykker i mindre biter = fragmenter Ionisering ved atmosfærisk trykk (API-teknikker) Løsning på mobilfaseproblemet ionisering ved atmosfærisk trykk før vakuum-delen av MS en Deretter ledes ionene inn i MS en og inn i stadig bedre vakuum (flere steg med pumping). Flere typer API-teknikker: ESI electrospray ionisation APCI atmospheric pressure chemical ionisation APPI - atmospheric pressure photoionisation Elektrosprayionisering, ESI Sprayer væske med analytten i ut av et kapillærrør Har på en høy spenning som gjør at det dannes ladde dråper Fordamper løsningsmiddelet fra dråpene og får ioner. Store molekyler kan få mange ladninger. Myk teknikk = mindre fragmenter 10

11 Kvadrupol masseanalysator Brukes både til GC-MS og LC-MS Har en enkel oppbygning og er enkle i bruk Dekker et bra masseområde Har god linearitet for kvantitativt bruk Bra oppløsning og kvalitet på massespektrene Er relativt rimelige og tar liten plass Er lite følsomme for forurensninger Skanner veldig hurtig (bra i SIM-modus) Kvadrupol masseanalysator Hva ser vi i MS en? non-resonant ion _ + resonant ion Detector Stable (resonant) ion Molekylioner [M] +. [M+H] + /[M-H] - EI CI, ESI Ion Source + _ Quadrupole Mass Filter Prefilter Postfilter Fragmentioner [M] +. [M+H] + /[M-H] - - X1 - X Xn DC and AC Voltages Rejected ions Addukter [M+ NH4] + (M+18) [M+ Na] + (M+23) hovedsakelig [M+ K] + (M+39) for LC-MS [M+ CH3CN + H] + (M+42) Trippelkvadrupol -instrumenter MS1 Kollisjonscelle MS2 I et «trippelkvadrupol» eller tandem massespektrometer er MS1 og MS2 masseanalysatorer som filtrerer ioner Kollisjonscellen er fylt med argon, og et potensiale settes på for å fragmentere ionene. pptak av MS-spektra scan vs. SIM/MRM Scan sveiper over et valgt masseområde og detekterer alle masser Gir mye informasjon Kan plukke ut interessante masser i ettertid Biblioteksøk fingeravtrykk SIM (=single ion monitoring)/mrm (=multiple reaction monitoring) detekterer en valgt masse eller overgang gir mye lavere deteksjonsgrense NB! Får bare det man ser etter 11

12 Fullt scan (eksempel GC-MS bibl. søk) Eksempel - godt molekylion og tydelige fragmenter SIM Diazepam har en RT på 8,51 min Molekylmasse (molekylion) er 285,1 (M+H) STD _A_ny_ : SIR of 4 Channels ES e6 Height Eksempel på bruk av fragment til avkrefting av identitet: BBT095D 8663_A_ : SIR of 4 Channels ES e4 Height Fragmentionet har riktig retensjonstid riktig masse (193,1) riktig størrelse i forhold til molekylionet (høyde 285/193 = 2,8) _A_ny_ : SIR of 4 Channels ES e5 Height Er dette klonazepam? Riktig molekylmasse, men ikke noe fragment dvs. negativ _A_16 2: SIR of 4 Channels ES e3 101 Height Time Time Sammenlikning av SIM og MRM Ionekromatogram av m/z=255 Fenbufen MixIso_1G14_ ng/ml Ketoprofen 60 ng/ml Fenbufen 1.31 SIR of 1 Channel ES+ TIC 5.95e6 MixIso_1G14_023 SIM av m/z= SIR of 1 Channel ES+ TIC 6.03e6 Ketoprofen Fenbufen Time Ketoprofen Begge har MW på Time MixIso_1G14_ ng/ml Ketoprofen 6 ng/ml Fenbufen 1.31 SIR of 1 Channel ES+ TIC 6.03e6 60 ng/ml Ketoprofen 6 ng/ml Fenbufen MixIso_1G14_024 0 MixIso_1G14_024 MRM av m/z= 255 > MRM of 2 Channels ES > e6 Ketoprofen MRM of 2 Channels ES > e4 Ketoprofen Fenbufen?? MRM av m/z= 255 > 237 Fenbufen Time Time 12

13 Spørsmål? 13