Typiske ligand(affinant) / prøve - par eller prøve / ligand(affinant)-par :

Transkript

1 S. 1 (av 6) 3.C.6 Andre LC-separasjonsmekanismer : 3.C.6. a) Bioaffinitetskromatografi (BAC) (også Affinitetskromatografi) Kromatografi-teknikk med hovedsakelig biokjemisk/biologisk anvendelse. Den brukes oftest preparativt. Retensjon baseres på en spesifikk/selektiv tiltrekning mellom få (meget få) utvalgte prøvekomponenter ("substrater", "analytter"; engelsk: analytes) og spesielle molekylære strukturer (affinanter, ligander) på stasjonærfasen. Av de to aktuelle biologisk aktive stoffer er vanligvis den ene immobilisert på en matriks ( SF) (= veldefinert, støkiometrisk "adsorpsjonssentrum") og den andre den aktuelle prøvekomponenten. Den (høyt) selektive vekselvirkningen skyldes at de innblandede stoffene er...:... ideally suited to each other, both spatially and electrostatically. (Sitat (og inspirasjon til tegningen nedenfor) fra : Veronika R. Meyer, Practical High-performance Liquid Chromatography (Wiley 3.engelske utgave, 1998, s. 195). Typiske ligand(affinant) / prøve - par eller prøve / ligand(affinant)-par : enzym - substrat, inhibitor, (kofaktor) antigen - antistoff - celle, virus, hapten 1 hormon - reseptor (-protein) lectin - glykoprotein, (poly-)sakkarid nukleinsyrer - komplementære nukleinsyre-sekvenser De immobiliserte ligandene "plukker" bare de stoffene ut av prøven som de har den spesielle (biologiske) affiniteten for. Alle andre prøvekomponentene blir ikke (eller rel. ubetydelig) retardert. 1 Definisjon av hapten (fritt oversatt fra Encyclopedia Britannica ( sept.1998): En relativ enkel forbindelse som i samarbeid med en større forbindelse (som regel et protein) kan stimulere dannelsen av antistoffer (immunoglobuliner) - men som alene ikke er istand til det. Antistoffene produseres som en reaksjon på hapten-protein-komplekset. Siden kan haptenet med sin spesifikke reaksjon med antistoffene utløse immunreaksjoner (allergiske reaksjoner). Proteinet deltar ikke direkte men fungerer som bærer for haptenet. Ofte er proteinet et av kroppens egne. Medisiner som gir allergiske reaksjoner, f.eks. penicillin, fungerer som haptener.

2 S. 2 (av 6) Separasjon med høy selektivitet - og høy separasjons-faktor ofte tilfredsstillende, selv ved lav til moderat kromatografisk effektivitet av kolonnen. (Bio-)affinitets-kromatografi brukes ofte "digitalt" : sorpsjon - vask - desorpsjon (eluering) (finnes som "fast-fase"-ekstraksjon : enkel - raskt - (kanskje) billig, men også som i lavtrykk-versjon (og fantes (finnes?) også som HPLC-variant). Den stasjonære fasen i BAC består av matriks og immobilisert ligand (= affinant) - Matriks: egnede egenskaper som kromatografis matriks, dessuten derivatiserbar for å kunne binde ligandene (immobilisering). - Immobilisering: kovalent binding mellom matriks og (immobilisert) bioaktivt stoff (affinant, ligand), som ikke ødelegger dens selektiv bindings-evne. Eluering av den selektivt bundne analytten: selektivt : bindingen mellom ligand og analytt løses ved å tilsette til mobilfasen (ett) (annet) stoff med selektiv affinitet til enten liganden eller analytten. ikke-selektivt : analytt- eller affinant-struktur endres for å svekke den spesifikke bindingen (ph-forandring, ionstyrke-endring, andre tilsatsstoffer) uten å irreversibelt ødelegge noen av de bio-selektive stoffene. Ikke uvanlig å selv-lage siste trinn i kolonne-produksjon av BAC-kolonner: Kjøp en aktivert matriks (pakket i kolonna) med en reaktiv funksjonell gruppe - klart til å reagere med en aktuell ligand, på et sted på liganden, som ikke deltar i (og ikke hindrer) den aktive BAC-interaksjonen.

3 S. 3 (av 6) 3.C.6. a) Kromatografi av enantiomerer (kirale stoffer) Problemet med å separere enantiomerer er ulik fra vanlig separasjon. Kirale molekyler med samme konstitusjon men som er ikke er enantiomerer (d.v.s. er diastereomerer) kan separeres på vanlige akirale systemer (som andre geometriske isomerer, f.eks. cis-/trans-isomerer). Men det er ikke mulig for enantiomer-par (speilbilder). Problemstilling: Separasjon av kirale molekyler må bygge på stereokjemiske forhold, fordi de fleste kjemiske og fysikalske egenskaper for øvrig er identiske for enantiomerer, når ikke kiralitet er «en del av «målingen» : samme funksjonelle grupper i molekylet, samme - men speilvendt - arrangement av dem. Kromatografisk problem: SF (eller evt. MF) må tilby kirale (ikke-rasemiske) partner-molekyler (strukturer) som de to enantiomere analytt-molekylene kan danne diastereomere komplekser" med. Stabiliteten til disse «kompleksene» er ulike: Ved stor nok forskjell i energi/stabilitet kan det gi stor nok forskjell i affinitet og stor nok forskjell i retensjon - nok for å oppnå separasjon. Makroskopisk: - håndtrykk med naboen (begge med høyre hånd) går greit - håndtrykk med naboens venstre hånd (eller med seg selv): blir klønete. Eller tilsvarende: Hånd i (kiral) hanske -forsøk. Eller tilsvarende: Venstreskru i (kiral) høyre-mutter

4 S. 4 (av 6) Sterk pådriver for separasjon av enantiomerer er den farmasøytiske kjemi: Karv om - enantiomert rene medisiner (inneholdende kun den aktive enantiomeren) - og/eller kvantitativ informasjon om enantiomer sammensetning. (KJ2053-)Teknikker som separerer enantiomerer (analytisk evt. preparativt) - «kiral separasjon» : HPLC: NP (IEC) SFC CE GC TLC Prinsipielle separasjonsmuligheter for enantiomerer ved kromatografi : Prinsipp kiral selektor bindg. til kiral selektor Diastereomert derivat: pre-analyse kovalent akiral Diastereomer komplex i MF reversibel akiral Diastereomer komplex på SF reversibel kiral SF Kirale stasjonærfaser inneholder en kiral selektor, ofte (men ikke alltid) kovalent bundet til bærematerialet (både i LC, SFC og GC). Kirale mobilfaser - sjeldenere brukt: typisk laget ved tilsats av et kiralt selektormolekyl eller -ion (typisk en «host» for «host-guest»-komplekser) til en akiral væske. Separasjonsprinsippet for kiral kromatografi - sitat LRG(2014) ch When (..) an optically active molecule passes through a stationary phase containing a chiral function, short-lived association complexes are formed with slightly different chemical properties leading to a difference in retention of two optical isomers. Når (..) et optisk aktivt molekyl passerer gjennom en stasjonær fase inneholdende en kiral gruppe, blir kortvarige assosiasjons-komplekser dannet med litt forskjellige kjemiske egenskaper, som fører til en forskjell i retensjon av to optiske isomerer. (+/-Google translate)

5 S. 5 (av 6) Vanlige selektorer: Syklodekstriner 2 : ; sykliske oligomerer av hhv. 6, 7 og 8 glukose-enheter; naturlig, eller derivatisert (på OH-grupper). (LRG,Chro(2014) noen peptider (bl.a. sykliske, som Vancomycin) eller proteiner karbohydratderivater, mange basert på cellulose (f.eks. Chiralcel ) Pirkle-faser, som har flere «små» kirale syntetiske organiske substituenter: som må ha flere ulike funksjonelle grupper som har mulighet for ulike tiltrekkende (evt. frastøtende) vekselvirkninger o via H-bindinger, o - -vekselvirkninger, o dipol-dipol-vekselvirkninger el. o hydrofobisk tiltrekning og o evt. hindring/frastøting : sterisk hindring, rent steriske el. evt. elektronisk frastøtende vekselvirkning. 2

6 S. 6 (av 6) Eksempel på kiral SF (silika-basert ) av Pirkle-typen 3 :. Asymmetrisk karbon («kiralitetssentrum») er her C-atomet bundet til fenylringen (benzyl-karbonet). Separasjonsmekanismer for kiral kromatografi blir ofte rasjonalisert med: 3-punkts-vekselvirkningsmodellen for kiral separasjon, eller med host-guest -vekselvirkning (kiral host som gir ulik stabilitet med de to enantiomere guests). Rasjonalisering m.h.t hvilke(n) fase(r ) som fungerer med hvilken analytt er ikke alltid lett (av og til mulig for hovedkategorien som kan brukes) : Rel. ofte må det brukes prøving og feiling, inntil separasjonen, α, er stor nok. 3