Kromatografi (LC-MS/MS) Sandra Dahl Hormonlaboratoriet

Størrelse: px

Begynne med side:

Download "Kromatografi (LC-MS/MS) Sandra Dahl Hormonlaboratoriet"

Dan Helgesen
7 år siden
Visninger:

1 Kromatografi (LC-MS/MS) Sandra Dahl Hormonlaboratoriet

2 Innhold Kromatografi (LC-MS) Analytter Separasjon Deteksjon Fordeler og ulemper Endokrinologiske målinger med LC-MS Utfordringer Eksempler på interferenser Forskjeller mellom immunoassay og LC-MS

3 Endokrinologiske målinger med LC-MS/MS Steroider testosteron androstendion 17-OH-progesteron Vitamin D (25-OH) +++ Aminosyre lignende hormoner Tyreoideahormoner Katekolaminer og metabolitter Serotonin Peptid- og proteinhormoner proteomics metabolomics Targeted = man vet hva man ser etter non-targeted = man vet ikke hva man ser etter Oppdage nye biomarkører

4 Kromatografi Kromatografi: chroma (gr.)= farge graphein (gr.) = å skrive Massespektrometri (MS) Gass = GC Elektrokjemisk (ECD) Spektrofotometrisk (UV, fluorescens, kjemiluminescens) væske = LC Refractive Index (RI) Lysspredning

5 Hva er LC-MS? LC-MS = Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Eller på norsk: Væske kromatografi-masse spektrometri LC MS Mobilfase Kolonneovn Autoinjektor MS en Pumpe

6 Definisjoner LC Hva skjer i LC? LC = separasjon av komponenter i en blanding separasjon t 0 t R 1 t R 2 t R 3 t R 4 tid (t) Kromatogram: hver stoff har en retensjonstid (t R )

(stasjonærfasen) Analytter som har lav interaksjon eluerer ( kommer ut ) først Dvs.

7 Definisjoner LC En væske (mobilfasen) frakter blandingen gjennom en kolonne komponentene i blandingen har forskjellig interaksjon med materialet i kolonna (stasjonærfasen) Analytter som har lav interaksjon eluerer ( kommer ut ) først Dvs. de har lav retensjon(stid) Analytter som har høy interaksjon eluerer sist Dvs. de har høy retensjon(stid)

8 Definisjoner LC Normalfase Polar Stasjonærfase (silika) Upolar mobilfase (heksan) Jo mer polar en analytt er (-OH, -NH grupper), jo høyere retensjon Omvendt fase Upolar stasjonærfase (C 18 ) Polar Mobilfase (H 2 O/MeOH/acetonitril) Jo mer upolar en analytt er (-CH-), jo høyere retensjon.

9 Definisjoner LC Hva avgjør analyttens retensjon i omvendt fase kromatografi? Strukturen til analytten Mye C-H høy retensjon Mye -OH, -NH lav retensjon Mobilfasen (væsken) H 2 O: gir høy retensjon (analytten har mye interaksjon med stasjonærfasen) MeOH, acetonitril: gir lav retensjon (analytten har lite interaksjon med stasjonærfasen) Stasjonærfasen (partiklene i kolonna) Van der Waals, hydrofobe interaksjoner (C-H) Solvofob teori (upolare grupper blir presset ut av den polare mobilfasen) π-π interaksjoner (dobbeltbindinger)

10 The real world En topp i kromatografi inneholder ikke kun en forbindelse Her kommer masse spektrometri inn i bildet!

11 Definisjoner MS Hva skjer i MS? MS = separasjon av ioner i gassfase Eller en vekt som veier analyttens molekylvekt 2 trinn: 1) Analyttene blir ionisert 2) Ionene separeres etter masse/ladning (m/z) LC-MS = separasjon i 2 dimensjoner

12 Definisjoner MS Ionisering av analytten: ESI = Elektrospray ionization Prøven sprayes ut av en kapillær inn i et høyspennings felt. Positive [M+H] + ioner eller negative [M-H] - ioner dannes. Nesten ikke noe fragmentering OBS! Avhengig av analytt kan det forekomme fragmentering i ionekilden

Orbitrap, Q-Exactive Q-TOF Targeted (man vet hva man ser etter)

13 Definisjoner MS Separasjon av ionene etter deres masse-ladnings forhold (m/z) Kvadrupol (Q) Time-of-flight (TOF) Ion-trap (IT) Orbitrap, Q-Exactive Q-TOF Targeted (man vet hva man ser etter)

Definisjoner MS Stor molekyl (Mw=1000) Middel stor molekyl (Mw=400) Liten molekyl (Mw=100) Kvadrupol (Q) masse analysator: Ionene blir filtrert eller ledet gjennom fire metallstaver som er parvis

14 Definisjoner MS Stor molekyl (Mw=1000) Middel stor molekyl (Mw=400) Liten molekyl (Mw=100) Kvadrupol (Q) masse analysator: Ionene blir filtrert eller ledet gjennom fire metallstaver som er parvis tilkoblet en spenning ( elektromagnetisk felt) Spenningen blir justert slik at utvalgte ioner har en stabil bane mellom metallstavene og treffer detektoren. De som ikke har en stabil bane, krasjer i stavene og kommer ikke frem til detektoren.

15 Definisjoner MS Tandem MS (=MS/MS) 2 MS etter hverandre Fjerner bakgrunn bedre sensitivitet Ser på karakteristisk MRM overgang bedre selektivitet MRM = multiple reaction monitoring

16 MRM m/z =289 m/z = 109

17 Hvorfor separasjon? Immunoassay (eks. steroider): har et antistoff som skal gjenkjenne en spesifikk struktur (eks. 17a-OH-prog) MRM overgang: antistoffet i LC-MS spesifikk for et molekyl Separasjon: når et antistoff har kryssreaktivitet med flere enn et steroid (IA) når en MRM overgang er spesifikk for flere analytter (MS) 17a-OH-prog/Deoxykortikosteron Kortikosteron/11-Deoxykortisol

18 Prøveopparbeidelse Ekstraksjon av analytten fra matriks frigjøring fra bindeprotein Opprensning av ekstraktet fjerne interferenser lengre instrument levetid Oppkonsentrering forbedre deteksjonsgrense Proteinfelling Væske-væske ekstraksjon (LLE) Fastfase ekstraksjon (SPE) eller ofte en kombinasjon av flere teknikker

19 Internstandard Internstandard (ISTD) er i LC-MS/MS metoder et stabilt isotop deuteriummerket (D, -d) eller 13 C merket skal ideelt sett oppføre seg helt lik analytten siden molekylvekt til ISTD er forskjellig fra analytten, ser MS forskjell ISTD tilsettes alle prøver (inkl. kalibratorer og QC) korrigere for tap under opparbeidelse (SPE/inndamping etc.) korrigere for ionisering

20 Fordeler med LC-MS/MS Mulig å analysere flere analytter samtidig (også forskjellige stoffklasser) Selektiv sammenlignet med immunoassay har retensjonstid og MRM overgang for en analytt Sensitiv bestemmelse av 1 fmol (på kolonna, avhengig av injeksjonsvolum og ionisering)

21 Utfordringer med LC-MS/MS ikke plug & play Tidkrevende metodeutvikling sammenlignet med immunoassay-kit (>4-6 måneder) Dyr utstyr krever erfarne brukere Tett samarbeid mellom lab, forsker og klinker hva måler den enkelte metoden, hva er fallgruvene?

22 Utfordringer ved endokrinologiske analyser Komplekse prøver (eks. serum, plasma, urin, spytt, spinalvæske) Mange interferenser Særlig proteiner og fosfolipider i serum og plasma Analyttene har ofte lav konsentrasjon lav pmol/l (testosteron, 1,25-(OH) 2 -vitamin D, aldosteron) Bundet til bindeproteiner (eks. SHBG, DBP, CBG) eller albumin skal det måles total konsentrasjon, fritt hormon, bio-tilgjengelig hormon? konsentrasjon av bindeproteiner? Endogene interferenser med samme masse ( isobarer ) epimerer (= diastereomerer), f. eks. 25-OH vitamin D, testosteron andre isobarer, f.eks. testosteron og DHEA; 11-deoxykortikosteron og 17α-OH-progesteron; 11- Deoxykortisol og Kortikosteron medikamenter, f.eks. prednisolon, kortison en utfordring for separasjonen Ikke typisk lett å ionisere (steroider)

23 Metodeforskjeller IA og LC-MS/MS IA: immunreaksjon (antigen antistoff immunkompleks) feil assosiert med antigen antistoff binding og kompleksdannelse kryssreaktivitet ekstraksjon/separasjon LC-MS/MS: direkte (kjemisk) måling av konsentrasjon manglende separasjon av interferenser tap av analytt assosiert med prøveopparbeidelse feil i prøveopparbeidelse, separasjon og massespektrometri blir korrigert for med bruk av internstandard

24 Husk! LC-MS/MS blir mer og mer brukt i endokrinologiske analyser også i rutine analyser Vær OBS på utfordringer med endokrine analyser Komplekse prøver Lav analytt konsentrasjon Bindeproteiner Interferenser Ved tolkning av svar i endokrinologiske problemstillinger må man passe på hvilken metode som måler hva Immunoassay versus LC-MS/MS forskjellige LC-MS/MS metoder

Like dokumenter

Liv Hanne Bakke Hormonlaboratoriet, Oslo Universitetssykehus (Aker) Innhold. Hormonlaboratoriet Hva er steroidhormoner? Når analyseres steroidhormoner

Liv Hanne Bakke Hormonlaboratoriet, Oslo Universitetssykehus (Aker) Innhold Hormonlaboratoriet Hva er steroidhormoner? Når analyseres steroidhormoner Hva er LC MS Fordeler og utfordringer med LC MS Våre