3. Væskekromatografi, LC (med HP-LC) B. Instrumentelle aspekter 8. LC-Deteksjon. KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II)

Transkript

1 1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, ISBN: B. Instrumentelle aspekter 8. LC-Deteksjon 1

2 2 HPLC-systemets oppbygging 1. Elueringsmiddel 2. Pumpe(r) 3. Injektor 4. Filter ("In-line".filter) 5. Beskyttelseskolonne ("Guard column") 6. Temperaturkontroll ( kolonneovn") 7. Kolonnen 8. Detektor 9. evt. Fraksjonsoppsamler 10. Signal/data-lagring, -behandling (PC, integrator, skriver) Detektor(er) 2

3 3 er Repetisjon: Generelle detektor-egenskaper ble definert i kap. 2.B.5, GC-detektoren: følsomhet, S (Nedre) deteksjonsgrense Detektorens reaksjon, "selektivitet" Det lineære området og det dynamiske området Sammenligning: massefølsom vs. konsentrasjonsfølsom detektor Andre klassifiseringer av detektorer Bulk property - Specific property Destruktiv - ikke-destruktiv 3

4 4 De viktigste HPLC-detektorene: Detektor Nedre det.- grense i ng Selekti-vitet Lineært område (maks.) UV/VIS 0,1-1 selektiv 10 5 Ja gradientdugandes Andre Egenskaper Anvendelser Fluorescens <,01 selektiv ca ja fluorescerende, el. merket v. fluorescens tag RI universell ca nei bulk, ikke sporanalyse ELSD 0,1-10 universell ja tungt-flyktige og SVOC s El. ledningsevne (konduktometrisk) selektiv 10 4 nei Ikke-ledende (el. dårlig ledende) MF Ioniske stoffer Elektrokjemisk (Red. / Oks.) <,01 selektiv 10 6 nei El.-kjemiske reaktive stoffer MS (SIM) universell & selektiv ja UV/VIS: UltraViolet / VISible (Light) Detector - UV / synlig (lys)-detektor RI : Refractive Index Detector - Lysbrytnings-(indeks-)detektor ELSD: Evaporative Light-Scattering Detector - Fordampnings-lyssprednigsdetektor (SVOC's: Semi-Volatile Organic Compounds) 4

5 5 N.B.: "Viktigste HPLC-detektorene kan delvis være diskuterbar Videre: laser-lysspredning (low angle, multi-angle, molekylstørrelse-måling) CAD (Charged Aerosol Detector), IR (InfraRød), NMR, polarimetri, radioaktivitet, kjemiluminescens, med en del flere. N.B.: Massespektrometeret (for LC/MS) diskuteres (kort) seinere i forelesningen og (mye) mer på KJ

6 6 3. B. 8. a (Spektro-)Fotometriske detektorer Mest brukte (Spektro-)Fotometriske detektorer for UV- og synlig lys-område 3 hovedtyper, skille m.h.t bølgelengde-valg og -registrering: - filter-fotometrisk type, - monokromator-/spektrometrisk type, - Diode Array -spektrometrisk detektor Fotometriske detektorer for UV- og synlig lys-område er de mest vanlige HPLC-detektorene i bruk pr. i dag. 6

7 7 3. B. 8. a (Spektro-) fotometriske detektorer Mest brukte, for UV- og synlig lys-området Lyskilder som dekker aktuelle områder: W-glødelampe (billig, kontinuerlig spektrum for synlig og nær-ir-lys) Metalldamp-lamper: Hg-lampe (253,7, 365,4 nm (m.fl.) Na-damp-lampe, Cd-lampe, Zn-Lampe Gassutladningslamper (linjespektra, nesten-kontinuerlig) Deuterium-lampe (fra UV-C - ca. 650nm) Xenon-lampe (fra ca nm inn IR-området) LED? Vedr. D 2 -lampe: Emissions-området (går i realiteten lavere enn 200 nm) (from Deglr6328 at English Wikipedia, dl ) Vedr. Hg-lampe: In low-pressure mercury-vapor lamps only the lines at 184 nm and 253 nm are present. Only the light at 253 nm is usable. In medium-pressure mercury-vapor lamps, the lines from nm are present. The lamps can be constructed to emit primarily in the UV-A (around 400 nm) or UV-C (around 250 nm). (en.wikipedia ) 7

8 8 3. B. 8. a (Spektro-) fotometriske detektorer Mest brukte for UV- og synlig lysområde Bølgelengde-valg: ved valg av type lyskilde og/eller ved bruk av lysfiltre eller ved monokromatorer (som regel gitter-monokromatorer) (spesielle anvendelser bruker lys-interferens (interferometre) med Fourier-transformasjon av signalet; eks.: IR. Lysmålere: fotomultiplikator, fotodioder (CCD) Utbredt bruk av Hg-lampen med 254 nm som deteksjonsbølgelengde i enkle billige detektorer ofte brukt/ tilgjengelig for LC-rutine-analyser ved en relativ generell bølgelengde : 254 nm ble et generelt akseptert føste-valg for UV-deteksjon Høy intensitet, sterkt dominerende (selv uten bruk av filter for emisjon ved andre bølgelengder) Monokromator-detektorer var / er mange ganger dyrere. For alle aromatiske, og en god del andre kromoforer) Om en ikke hadde gode grunner til å velge noe annet (!) (f.eks. selektivitet, følsomhet) da kunne metoden direkte anvendes å flest mulige HPLC systemer. 8

9 9 3. B. 8. a (Spektro-) fotometriske detektorer Mest brukte for UV- og synlig lysområde Celler for UV-deteksjon: ofte en såkalt Z- type (klassiker): Det gjelder : Beer-Lamberts lov A = log (I/I 0 ) = c ε l ε the molar absorptivity; c the molar concentration of the attenuating species in the material. l the path length; N.B. : Lite Cellevollum tillater lite topp-volum, Fra lærebok i Analytisk kjemi (SWHC8 (2004), kap. 32, s. 979) Cellevolum har effekt på: oppløsning (negativ ved for stor celle) og/eller følsomhet (for kort celle, lav l, eller for lite tverrsnitt (effekt på I 0 ). Celler for UV-deteksjon - nyeste design: Bruker fused silica -kapillærer som celler og fiberoptikk for lystransport : f.eks. Cellen i lab.-kurs-instrumentene (Agilent Ser Max-Light Cartridge Cell): 9

10 10 3. B. 8. a (Spektro-) fotometriske detektorer Det gjelder : Beer-Lamberts lov A = log (I/I 0 ) = c ε l - Eksempel for en filter-fotometrisk detektor fast bølgelengde-detektor (Planlagt brukt som enkel detektor til framtidig SEC-forsøk, utstyrt til deteksjon ved 254 nm) Fra : Knauer Manual for Smartline UV Detector 10

11 11 3. B. 8. a (Spektro-) fotometriske detektorer Det gjelder : Beer-Lamberts lov A = log (I/I 0 ) = c ε l - Eksempel for Variabel bølgelengde-detektor (UV/synlig) - Monokromator-basert : Fra : Agilent 1200 series VWD-Manual 11

12 12 3. B. 8. a (Spektro-) fotometriske detektorer Det gjelder : Beer-Lamberts lov A = log (I/I 0 ) = c ε l - Eksempel for : "Phototdiode Array" UV/vis-detektor : (skjematisk) Fra : Agilent 1200 series VWD-Manual 12

13 13 3. B. 8. b Fluorescens-detektor Konsentrasjonsfølsom selektiv: kan selektere både på eksitasjons- og emisjons-bølgelengde. GooglePix, dl Dessuten er fluorescerende stoffer / grupper ikke veldig utbredt - i utgangspunkt meget god mulighet for selektivitet, når først fluorescens ER detekterbar. Eksitasjons/Emisjons-bølgelengde-"velgerne" kan være kombinasjon av - Bølgelengdevelger: Filter eller monokromatorer, - Filter/filter, filter/gitter, gitter/gitter, gitter/dad. Monokromatiske lyskilder også aktuelle. I nyere tid brukes oftere og oftere Lasere til eksitasjon (høy lystetthet i små volum, høy koherens av strålingen). Relativ robust for gradient og MFendringer, så lenge MF ikke er lysabsorberende i aktuell område. Problemer : Metningsfare for signalet ved for høye kons. ( Inner Filter effekt) Fluorescens blir quench'et ved noen stoffer, særlig O 2! Styrke: selektivitet og potensielt høy følsomhet. 13

14 14 3. B. 8. c Andre LC-detektorer (i) Brytningsindeks-detektor ("Refractive Index" detektor, RI-detector): Måler brytningsindeksen (forandringer i den) av eluenten Trenger ingen kromoforer (analytten skal helst ikke absorbere ved den observerte bølgelengden) Bulk -detektor Konsentrasjonsfølsom, Universell! Ikke veldig følsom. En type RI-detektor : (flere ulike måle-prinsipper brukes) Men: Meget følsom mot trykk- og temperaturendringer og (særlig) for endringer i MFsammensetning: Helt uaktuell for gradient-analyser 14

15 15 3. B. 8. c Andre LC-detektorer (ii) Fordampnings-lyssprednings-detektor (ELSD = Evaporative Light Scattering Detector) : Eluent-løsningen sprayes i et oppvarmet rør og løsningsmiddelet fordampes. Når eluenten inneholder (ikke-flyktig) analytt dannes mikro-dråper/ krystaller av u-fordampet analytt ("tåke eller snø") Mikro-dråpene (eller -krystallene) detekteres, ved at de sprer lys (i motsetning til luft el. homogen damp): Som detektor signal måles intensiteten av lysspredningen side-veis fra en rettet lysstråle (evt. laser). Signal avhengig av analytt-flyktighet: lav flyktighet = ok respons, høy flyktighet = lite eller ingen respons. Lignende detektor for ikke-flyktig analytter: Forstøvning (som i ELSD) -- men elektrisk deteksjon av partikler: CAD-detektor (Charged Aerosol Detector). 15

16 16 3. B. 8. c Andre LC-detektorer (iii) "Elektriske detektorer" : - Elektrisk ledningsevne-detektor : registrerer ledningsevne (ion-migrasjon) generert av tilstedeværende ioner. - Elektrokjemiske detektorer (amperometriske detektor) gjennomfører red/oks-reaksjoner i detektorcellen måler produserte strømstyrker fra reaksjonen: amperometriske målinger, typisk måles ved fastlagt elektrisk potensiale (som kan velges for spesifikke stoffer). 16