Kvantitativ analyse av glukokortikoider i human plasma ved forenklet prøveopparbeidelse og UHPLC-MS/MS

Transkript

1 Kvantitativ analyse av glukokortikoider i human plasma ved forenklet prøveopparbeidelse og UHPLC-MS/MS Monica Ulriksen Masteroppgave i farmakologi Farmasøytisk Institutt Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO Avdeling for Farmakologi Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet 18. november 2016

2 II

3 Kvantitativ analyse av glukokortikoider i human plasma ved forenklet prøveopparbeidelse og UHPLC-MS/MS Monica Ulriksen Masteroppgave i farmakologi, Farmasøytisk Institutt Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet Universitetet i Oslo Oppgaven ble utført ved: Avdeling for Farmakologi Rikshospitalet Oslo Universitetssykehus Veiledere: Nils Tore Vethe, Avd. for farmakologi, Rikshospitalet, Oslo Universitetssykehus Stein Bergan, Avd. for farmasøytisk biovitenskap, Farmasøytisk Institutt og Avd. for farmakologi, Rikshospitalet, Oslo Universitetssykehus III

4 Monica Ulriksen 2016 Kvantitativ analyse av glukokortikoider i human plasma ved forenklet prøveopparbeidelse og UHPLC-MS/MS Monica Ulriksen Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo IV

5 Sammendrag Bakgrunn For organtransplanterte pasienter er immundempende behandling helt avgjørende for å forhindre avstøtning. De fleste pasienter som gjennomgår en nyretransplantasjon følger et behandlingsregime bestående av fire ulike legemidler. For flere av disse legemidlene utføres terapeutisk legemiddelmonitorering for å forhindre bivirkninger og avstøtningsepisoder. Glukokortikoider er per i dag ikke ett av legemidlene hvor plasmakonsentrasjoner måles, men dette kan være interessant for å undersøke sammenheng mellom aktiv og inaktiv form av legemidlene, og forekomst av bivirkninger. Hensikt Hensikten med denne oppgaven var å utvikle en enkel LC-MS/MS-metode for analyse av glukokortikoider i plasma. Det var en målsetning å benytte proteinfelling som eneste prøveopparbeidelsesmetode. Ved å undersøke aktiv og inaktiv form av tre ulike glukokortikoider ønsker man å oppnå bedre forståelse av klinisk respons i pasientene. Metode UHPLC-MS/MS ble benyttet til å analysere følgende glukokortikoider: prednisolon, prednison, kortisol, kortison, metylprednisolon og metylprednison. Kromatografiske og massespektrometriske betingelser var i hovedsakfastsatt på forhånd, og under metodeutviklingen ble det fokusert på å komme fram til en hensiktsmessig prøveopparbeidelse, samt evaluere metodens egenskaper. Resultater Proteinfelling med fellingsreagens av metanol og 0,1 mol/l sinksulfat i 2:1 medførte topper som var forholdsvis smale og symmetriske. Denne sammensetningen gjorde at man kunne injisere en forholdsvis stor mengde biologisk materiale til kromatografisk analyse, og man kunne oppnå en lavere nedre kvantifiseringsgrense. Evaluering av ulike internstandarder indikerte at D8-prednisolon kunne brukes for prednisolon og kortisol, D8-prednison for prednison og kortison, og D6-metylprednisolon for metylprednisolon og metylprednison. V

6 Validering ble utført for selektivitet og overdragning, og delvis for nøyaktighet, presisjon og nedre kvantifiseringsgrense. Overdragning < 13 % av nedre kvantifiseringsgrense. VK < 9,6 % for innen-serie-presisjon. Nøyaktighet: 1,5 til 18 % for innen-serie-nøyaktighet. Nøyaktighet ekskludert laveste kontrollprøve: 1,5 til 13,5 %. Konklusjon Prøveopparbeidelse ble bestemt til å være proteinfelling med sinksulfat og metanol. Dette ga god signalrespons med smale og symmetriske topper i kromatogrammet. Metoden ble validert for selektivitet, overdragning, innen-dag-nøyaktighet og innen-dag-presisjon, og preliminært nedre kvantifiseringsgrense. Resultatene var innenfor forhåndsdefinerte kvalitetskrav (EMA). VI

7 VII

8 Forord Denne masteroppgaven ble utført ved Avdeling for Farmakologi ved Oslo Universitetssykehus, Rikshospitalet, i perioden august 2015 til november Det har vært utrolig spennende og lærerikt å se hvor mye arbeid som ligger bak utvikling av analysemetoder for rutineanalyse. Her har jeg fått lære mer om forutsetninger som er avgjørende for om en metode lar seg gjennomføre i rutinearbeid. Muligheten til å skrive en oppgave som kombinerer analyse og farmakologi er jeg veldig glad for. Utviklingen av metoden er et prosjekt som er utført i fellesskap. Denne masteroppgaven dekker kun en liten bit av det totale arbeidet. Nils Tore Vethe, Anders Andersen og Rolf Klaasen har utført mye av arbeidet. Takk for alt dere har gjort, og for at jeg har fått være med på prosessen. Jeg vil gjerne takke veilederen min, Nils Tore, for alt. Alle spørsmål, all hjelp, all veiledning: tusen takk! Takk til Stein Bergan, intern veileder fra Farmasøytisk Institutt, for innspill og tilbakemeldinger. Takk til Rolf for all hjelp og at du har tatt deg tid til å svare på alle dumme spørsmål. Takk til avdelingen for god motivasjon, spesielt i innspurten. Tusen takk til dere alle for mye god hjelp hele veien! Familie og venner har også gjort sitt for at denne oppgaven skulle bli til, spesielt Jørgen, Elisabeth og Ville. Takk til alle som har fungert som heiagjeng. Det trengs! Oslo, november 2016 Monica Ulriksen VIII

9 IX

10 X

11 Innholdsfortegnelse 1 Bakgrunn Transplantasjon Forlikelighet Avstøtningsreaksjoner Immundempende behandling ved nyretransplantasjon Terapeutisk legemiddelmonitorering Legemiddelanalyse i prøver fra pasienter Analysemetoder som brukes til TDM: Prøveopparbeidelse Validering: EMA guideline bioanalytical method validation Analyse av glukokortikoider Hensikt Materialer og metode Reagenser og utstyr Tillaging av reagenser Mobilfaser Stamløsninger og arbeidsløsninger Fellingsreagens Kalibratorer og kontroller LC-MS/MS metode for glukokortikoider Prøveopparbeidelse Kromatografi Massespektrometri Programvare og databehandling Metodeutvikling Prøveopparbeidelse Validering Selektivitet Overdragning Kalibreringskurve Nøyaktighet XI

12 3.5.5 Presisjon Nedre kvantifiseringsgrense Ikke-validerte punkter Resultater Prøveopparbeidelse Validering Selektivitet Overdragning Kalibreringskurve Nøyaktighet Presisjon Nedre kvantifiseringsgrense Diskusjon Metodeutvikling Prøveopparbeidelse Validering Selektivitet Overdragning Kalibreringskurve Nøyaktighet Presisjon Nedre kvantifiseringsgrense Ikke-validerte punkter Begrensninger Fremtidige perspektiver Konklusjon Litteraturliste XII

13 Forkortelser ACN - Acetonitrill APC - Antigenpresenterende celle APCI - Atmosfæretrykk-kjemisk-ionisasjon CV - Variasjonskoeffisient CYP - Cytokrom p450 DNA - Deoksyribonukleinsyre EMA - European Medicines Agency ESI - Elektrosprayionisasjon FKBP12 - FK-bindende protein 12 GC - Gasskromatografi GR - Glukokortikoidreseptor GRE - Glukokortikoidreseptor respons element HLA - Humant leukocytt antigen HPA - Hypothalamus-hypofyse-binyrebark HPLC - High Performance Liquid Chromatography HSD11β1 - Hydroksysteroid (11-beta) dehydrogenase 1 HSD11β2 - Hydroksysteroid (11-beta) dehydrogenase 2 IL-2 - Interleukin-2 IMPDH - Ionosin-5'-monofosfat dehydrogenase LC - Væskekromatografi LC-MS - Væskekromatografi koblet til massespektrometri LC-MS/MS - Væskekromatografi koblet til tandem-massespektrometri LLE - Væske-væske ekstraksjon LLOQ - Nedre kvantifiseringsgrense MeOH - Metanol MHC - Major Histocompability Complex MR - Mineralkortikoidreseptor MS - Massespektrometri mtor - Mammalian Target of Rapamycin NFAT - Nuclear Factor of Activated T cells 1

14 NF-κB - Kjernefaktor-kappa B PP - Proteinfelling QC - Kvalitetskontroller RNA - Ribonukleinsyre RPM - Rounds per minute (omdreiningstall) sfbs - Stripped Fetal Bovine Serum (strippet kalveserum) SPE - Fast-fase ekstraksjon TCR - T-celle reseptor TDM - Terapeutisk legemiddelmonitorering UHPLC - Ultra High Performance Liquid Chromatography ULOQ - Øvre kvantifiseringsgrense 2

15 1 Bakgrunn 1.1 Transplantasjon I år er det 60 år siden Nordens første organtransplantasjon ble utført i Norge. Dette skjedde bare to år etter verdens første vellykkede organtransplantasjon utført på eneggede tvillinger i Boston i Norges første transplantasjon ble utført ved Rikshospitalet med nyre fra ubeslektet giver, såkalt allogen transplantasjon. Pasienten levde i 30 dager etter operasjonen, noe som var imponerende på denne tiden, da dagens immundempende legemidler ikke var tilgjengelig. Den gang bestod behandlingen av kortison og helkroppsbestråling (1). Både vevstyping og immundempende legemidler har bidratt til at organtransplanterte kan leve lenge med god livskvalitet. For pasienter med nyresvikt er behandlingsalternativene dialyse eller transplantasjon, hvor transplantasjon er foretrukket (2). Dialyse er både krevende for pasienten og samfunnsøkonomisk kostbart (3). Organtransplantasjon har gått fra å være eksperimentell behandling på 50- og 60-tallet, til i dag å være foretrukket behandling ved flere sykdommer (1, 2). Det ble i 2015 utført 435 organtransplantasjoner i Norge hvorav 254 var nyrer (3). Av naturlige årsaker er nyre det organet som transplanteres mest. Her kan man benytte levende donor, ofte familiemedlem eller ektefelle. Det er kun ved nyre- og levertransplantasjon levende donor er en mulighet. Det er ønskelig med levende donor, da det ofte gir bedre resultat. Ved bruk av død giver kan organet ha vært utsatt for en ekstra stressbelastning i forbindelse med dødsfallet, og i tillegg har organet vært en periode uten blodtilførsel. Foruten nyrer utføres organtransplantasjon av lever, hjerte, lunge, pankreas og tarm. I tillegg kan noe vev transplanteres, blant annet blod, stamceller og hjerteklaffer (2) Forlikelighet Et viktig gjennombrudd for transplantasjonsmedisinen var vevstyping. Immunforsvaret har et imponerende system for å gjenkjenne egne celler, slik at det ikke angriper seg selv. MHC (major histocompability complex)-molekyler finnes på overflaten av de fleste celler og har som oppgave å presentere biter av fremmede organismer til leukocyttene, som avgjør hvordan det skal håndteres videre. MHC-molekyler hos menneske kalles HLA: humant leukocytt antigen. Det er stor variasjon i HLA-molekylene, og hvert individ har sin bestemte 3

16 kombinasjon. Videre dannes det antistoffer mot fremmed HLA. Da det ble mulig å identifisere ulike HLA-vevstyper og oppnå bedre vevsforlikelighet mellom pasient og donor økte suksessraten ved organtransplantasjon. Det er ingen absolutte minstekrav for å gjennomføre transplantasjon, men prognosene er bedre ved vevsforlikelighet. De forskjellene som eventuelt er mellom vevstypene reguleres med immundempende legemidler. Det er også ønskelig med ABO-forlikelighet. I tillegg gjøres en crossmatch for å sjekke om pasienten har HLA-antistoff mot potensiell donors HLA-antigener (2) Avstøtningsreaksjoner Avstøtning (rejeksjon) er kroppens naturlige respons. Det er denne responsen man forsøker å motvirke ved å velge organ fra donor med forlikelig blod- og vevstype, og med immundempende behandling. Avstøtning er en immunologisk reaksjon der både det medfødte og ervervede immunforsvaret spiller inn. Det kan oppstå når som helst etter transplantasjon, men skyldes ulike faktorer (2, 4). Hyperakutt rejeksjon Hyperakutt rejeksjon oppstår innen det første døgnet etter transplantasjon. Avstøtningen skyldes antistoffer pasienten allerede har i blodet mot HLA- eller ABO-antigener i det transplanterte organet. Antigenene i organet er på endotelcellene i blodårene, i tillegg til erytrocyttene. Det fører til endotelskade og plateaggregering, som igjen gir hemmet blodtilførsel til organet og ødelegger det. Denne type avstøtning unngås i stor grad ved å utføre crossmatch-tester i forkant av transplantasjon. Dette er en serie av tester som kartlegger mottakers reaksjon på det fremmede organet (2, 4). Akutt rejeksjon Akutt rejeksjon skyldes hovedsakelig to mekanismer som kan oppstå alene eller i kombinasjon: en T-celle mediert prosess som gir en akutt cellulær rejeksjon og en B-celle mediert prosess som gir en humoral akutt rejeksjon. Dette kan oppstå dager eller måneder etter transplantasjon. Man har lenge antatt at T-celler alene er ansvarlig for avstøtning, men nå vet man at humoral rejeksjon også medvirker til akutt rejeksjon. B-cellene forsterker reaksjonen ved å fremme T-celle aktivering gjennom kostimulerende veier eller cytokinfrigjøring (5). Aktivering av det medfødte immunsystemet vil skje uavhengig av 4

17 genetiske forskjeller og er en uspesifikk immunrespons. Dette fører til en reaksjon hvor T- celler vandrer til det transplanterte organet og dreper cellene i organet (2, 4). Denne responsen alene er ikke nok til å forårsake en akutt rejeksjon men vil kunne forsterke en eventuell reaksjon hos det ervervede immunsystemet (2). Kronisk rejeksjon Kronisk rejeksjon kommer snikende etter måneder eller år og skyldes en fortykning av blodårene til organet. Blodtilførselen til organet blir dårligere og det oppstår iskemi, nedsatt funksjon og til slutt tap av organ. Kronisk rejeksjon er hovedårsak til tap av organ (2). Direkte allogjenkjennelse Det er tre måter mottakers T-celler kan trigges på etter en transplantasjon. Direkte allogjenkjennelse er den første, og den dominerende i perioden rett etter transplantasjon. Mottakers T-celle reseptor (TCR) binder til donor-apc som presenterer en bit av donor MHC-molekyl. Antigenpresentasjon via direkte allogjenkjennelse spiller en avgjørende rolle i initiering av den ervervede immunresponsen til en MHC-uforlikelig pasient. Men siden det bare er et visst antall leukocytter overført med organet, vil denne stimuleringen av mottakers T-celler bli mindre med tiden. (2, 4) Indirekte allogjenkjennelse Indirekte allogjenkjennelse oppstår når biter av donors MHC-molekyl eller andre degraderte peptider tas opp, bearbeides og presenteres av mottakers APC til mottakers TCR. Indirekte allogjenkjennelse er mulig for antigen-presentasjon så lenge organet er i kroppen, og er derfor hovedmekanismen for allogjenkjennelse (2, 4). Semi-direkte allogjenkjennelse Semi-direkte allogjenkjennelse oppstår der mottakers APC får overført hele eller deler av donors MHC-molekyl fra en annen celle. Til forskjell fra indirekte allogjenkjennelse bearbeides ikke disse fragmentene av den APC. Betydningen av semi-direkte allogjenkjennelse er ikke kjent (4). 5

18 Lymfocytt-aktivering Aktivering av T-celler skjer i flere trinn. Signal 1 er binding mellom TCR og MHC på APC. Dette alene er ikke nok til å aktivere T-cellen. Signal 2 er et kostimuleringssignal. T-cellen har flere kostimulerende molekyler på overflaten, og aktiveringen stopper opp dersom disse ikke binder et ligand på den APC. Aktivering av signal 1 og 2 fører til at T-cellen oppregulerer produksjon av blant annet interleukin-2 (IL-2). IL-2 og andre cytokiner som stimulerer celleproliferasjonen skilles ut av cellen og virker autokrint som signal 3. Aktivering av cellen stimulerer til celledeling og differensiering (2, 4). Antistoff-mediert avstøtning er B-celle avhengig og kalles også humoral rejeksjon. B-celler uttrykker MHC og fungerer som APC, og har i tillegg kostimulerende molekyler som CD40 som fungerer som signal 2 i T-celle aktiveringen. B-celler har også komplementreseptorer og kan påvirke komplementsystemet. Antistoffmediert avstøtning kan starte dager eller uker etter transplantasjon, men kan også bidra til tap av organet på et senere tidspunkt. Mekanismen for antistoff-mediert skade er hovedsakelig gjennom aktivering av komplementsystemet, som ender med angrep på cellemembranen (6) Immundempende behandling ved nyretransplantasjon Ved transplantasjon er det standard behandling å benytte flere legemidler med ulike angrepspunkt (7). Dette prinsippet benyttes for å gi synergistisk effekt med lavest mulig forekomst av bivirkninger (8). Standardbehandling i Norge består av et interleukin-2-reseptorantistoff, kalsineurinhemmer, mykofenolat og glukokortikoid. Der hvor pasient og donor er såkalt HLA-identiske bortfaller mykofenolat (7). Figur 1 illustrerer de ulike virkningsmekanismene for legemidlene i T-cellen Interleukin-2-reseptor-antistoff Basiliksimab er et monoklonalt antistoff som gis før operasjon og på dag 4 etter operasjon (7). Legemiddelet undertrykker T-cellenes proliferasjon og er på den måten med på å forhindre rejeksjon (2, 9). Antistoffet, som er et såkalt monoklonalt CD25-spesifikt antistoff, hemmer α-kjeden i IL-2-reseptoren. Uten denne blokkeres signal 3 i T-celle aktiveringen. Det er kun delvis aktiverte T-celler, som allerede har mottatt signal 1 og 2, som har denne α-kjeden i reseptoren. Naive T-celler påvirkes derfor ikke. En enkel dose av legemiddelet er nok til å 6

19 hemme alle CD25 molekylene i kroppen i løpet av ett døgn, og med en halveringstid på to uker, kan legemiddelet ha effekt i over en måned (2). Kalsineurinhemmer Takrolimus gis til alle pasienter med unntak av de med nedsatt glukosetoleranse, som får ciklosporin (7). Virkningsmekanismen for de to legemidlene er lik, med unntak av legemiddelkomplekset som binder kalsineurin. Signaler fra TCR fører til aktivering av transkripsjonsfaktoren aktivator protein-1 (AP-1) og økt Ca2+ konsentrasjon i cytosol. Ca 2+ binder til kalsineurin, som aktiveres og defosforylerer inaktiv nuclear factor of activated T cells (NFAT) til ubundet og aktiv NFAT. Aktivert NFAT diffunderer inn i cellekjernen, binder til AP-1 og danner et kompleks som er nødvendig for transkripsjon av IL-2. Takrolimus binder til FK-bindende protein 12 (FKBP12), et protein i cytosol. Legemiddelreseptorkomplekset binder så til kalsineurin og hemmer effekten av denne. Ved å hemme kalsineurin hemmes aktiveringen av NFAT, som stopper gentranskripsjon av IL-2. Dermed oppreguleres ikke cellens IL-2 konsentrasjon, og aktiveringen av T-cellen stopper før signal 3. Selv om hovedmekanismen til legemiddelet er å hemme aktivering av T-cellen, undertrykkes også aktivering av B-celler og granulocytter (2). Mykofenolat Mykofenolat hemmer proliferasjon av B- og T-lymfocytter ved at enzymet inosinmonofosfat dehydrogenase (IMPHD) hemmes. Enzymet er avgjørende for at B- og T-celler skal være i stand til å produsere guanin-nukleotider, byggesten for RNA og DNA replikasjon. Andre celler har alternative biosynteseveier for å danne puriner, mens prolifererende B- og T-celler i stor grad er avhengig av nysyntese via IMPDH. Dette gjør at legemiddelet har en selektiv virkningsmekanisme (9). Glukokortikoider Glukokortikoider binder til glukokortikoidreseptorer (GR) i cytosol som diffunderer inn i cellekjernen, hvor det binder til DNA. Bindingen fører til en aktivering av antiinflammatorisk gentranskripsjon. I tillegg hemmer GR:glukokortikoid-kompleks i cellekjernen de proinflammatoriske transkripsjonsfaktorene kjernefaktor-kappa B (NF-κB) og aktivatorprotein 1 (AP-1) uavhengig av DNA binding. Dette hemmer transkripsjon av 7

20 proinflammatoriske gener (2, 10). Glukokortikoider gis til alle pasienter. Etter dagens behandlingsprotokoll gis én høy dose metylprednisolon første dag. Videre gis prednisolon. Ved tegn til avstøtning behandles pasienten med metylprednisolon i høye doser over fire dager (7). Figur 1. Virkningsmekanismen til kalsineurinhemmere, glukokortikoider, mtor-hemmere og IL-2-reseptor-antistoff. (APC: antigenpresenterende celle, TCR: T-celle reseptor, MHC II: major histocompability complex II, IL-2: interleukin 2, IL-2-R: interleukin-2-reseptor, mtor: mammalian target of rapamycin, NF-AT: Nuclear Factor of Activated T cells, AP-1: aktiveringsprotein 1, GR: glukokortikoidreseptor, NF-kB: kjernefaktor-kappa B, Cdk 2: cyclin avhengig kinase 2) 8

21 Farmakodynamikk Kroppens naturlige glukokortikoid, kortisol, produseres i binyrebarken. Regulering av sekresjon styres av hypothalamus-hypofyse-binyrebark-aksen (HPA-aksen) gjennom en feedback-loop som vist i figur 2 (8). hypothalamus CRH hypofyse ACTH binyrebark IL-1 IL-2 IL-6 TNF-α Immunsystemet Kortisol Figur 2. Endogen produksjon av kortisol. Produksjonen reguleres av en negativ feedbackloop. Kortisol senker den proinflammatoriske aktiviteten i immunsystemet Glukokortikoidenes immundempende effekt knyttes hovedsakelig til deres effekt på lymfocytter. De hemmer avstøtning ved å føre til et raskt fall i sirkulerende T- cellekonsentrasjon. Dette gjør de gjennom en kombinasjon av redistribusjon av T-celler, hemme proinflammatoriske cytokiner og indusere apoptose i T-celler. Effektene kan deles inn i genomiske og ikke-genomiske mekanismer (8, 10, 11). De mest undersøkte effektene er de genomiske som skyldes binding til GR i cytosol. GR tilhører superfamilien kjernereseptorer og foreligger i et multiproteinkompleks i cytosol. GR er inaktiv inntil binding med glukokortikoid. Bindingen fører til en konformasjonsendring og oppløsning av komplekset. GR:glukokortikoid-komplekset diffunderer inn i cellekjernen hvor det etter dimerisering binder til glukokortikoid respons element (GRE) på DNA. Bindingen fører til en aktivering av antiinflammatorisk gentranskripsjon. Transkripsjon av proinflammatoriske gener hemmes også via hemming av NF-κB og AP-1 i cellekjernen uavhengig av DNA binding. En annen mulig effekt av glukokortikoider er at de kan virke ved å destabilisere mrna til proinflammatoriske proteiner. Proteinsyntese er avhengig av stabiliteten og halveringstiden til mrna (10). 9

22 GR finnes i ulike isoformer som skyldes ulike spleisevarianter. GRα er den aktive reseptoren, mens GRβ ikke er i stand til å binde glukokortikoider. Det er blitt foreslått at denne reseptoren spiller en rolle i glukokortikoid-terapiresistens (8, 10) Effekter som følger av forandret genuttrykk vil ha en forsinkelse i innsettende effekt. Dette er fordi det er tidskrevende prosesser, og av denne grunn mottar transplantasjonspasienter første dose samme dag som transplantasjon. Ikke-genomiske mekanismer er derimot kjennetegnet av rask innsettende effekt. Det er foreslått at glukokortikoider kan virke både ved å interagere med GR og andre reseptorer, og ved å diffundere inn i cellemembraner og forbli i membranen. Dette endrer de fysikalskkjemiske egenskapene til membranen. Ikke-genomiske mekanismer er en mulig forklaring på hvorfor høye doser glukokortikoider over 250 mg gir god effekt. Genomiske mekanismer er ikke nok til å forklare effekten siden man antar alle GR er mettet ved prednisolondoser på mg (10). Farmakokinetikk Glukokortikoidenes farmakokinetikk varierer for de ulike glukokortikoidene, avhengig av deres fysikalsk-kjemiske egenskaper. De er små, lipofile molekyler og kan administreres oralt eller intravenøst. Glukokortikoider absorberes godt etter oral administrasjon og har en biotilgjengelighet på %. De har moderat proteinbinding og moderat distribusjonsvolum. Kortisol og prednisolon binder til plasmaproteinene transkortin og albumin. Transkortin har høy affinitet og lav kapasitet for kortisol og prednisolon mens albumin har lav affinitet og høy kapasitet. Dette fører til en økning i fri fraksjon når transkortin er mettet og oppnås ved administrasjon av kortisol- eller prednisolondoser over 20 mg. Metylprednisolon binder kun til albumin. Dette har betydningen for kinetikken til forbindelsene (10). Farmakokinetikken til kortisol og prednisolon er ikke-lineær for total plasmakonsentrasjon og skyldes proteinbinding til transkortin. Dette gjelder imidlertid kun total plasmakonsentrasjon og er et argument for å måle ubundet konsentrasjon i plasma, som ikke har en doseavhengig kinetikk. Metylprednisolon har lineær kinetikk, og er følgelig ikke doseavhengig (12). Intracellulær metabolisme via enzymet 11β-HSD, som vist i figur 3, kontrollerer tilgjengeligheten av glukokortikoider som kan binde til reseptor. Enzymet omdanner 10

23 glukokortikoider frem og tilbake mellom aktiv og inaktiv form. Det er kun aktiv form som kan binde til reseptorene. Felles for disse er hydroksylgruppe i C11-posisjon. Type 1 11β- HSD1 virker som en reduktase og omdanner inaktiv kortison til aktiv kortisol. Type 2 11β- HSD2 har høy affinitet for endogen kortisol og omdanner den til inaktiv kortison. Dette beskytter mineralkortikoidreseptorene (MR) fra å bli bundet til kortisol. Flere av glukokortikoidenes bivirkninger er knyttet til stimulering av MR. Ikke alle disse er undersøkt like godt, men man vet at MR spiller inn på regulering av væske- og elektrolyttbalansen (8, 10). aktiv inaktiv Figur 3. Enzymatisk omdannelse av glukokortikoider via 11-beta-hydroksysteroid dehydrogenase Aktiviteten til 11β-HSD2 er ulik for de ulike glukokortikoidene, noe som forklarer de ulike mineralkortikoideffektene til ulike glukokortikoider. Det er foreslått at de uønskede mineralkortikoideffektene er avhengige av doseringsregimet. Ved å dele opp døgndosen i to, og unngå metning av enzymet, forventes en mindre mineralkortikoideffekt enn om man doserer én gang daglig og overstiger kapasiteten. Dersom man ved å dosere to ganger daglig fortsatt overstiger kapasiteten til enzymet, vil det være mindre gunstig enn å dosere én gang daglig. Det er bedre at mineralkortikoidreseptorene stimuleres halve døgnet, enn hele (10). Glukokortikoider metaboliseres i lever, hovedsakelig gjennom CYP 3A4. Nyrene skiller ut den hydrofile, inaktive metabolitten. Glukokortikoider har kort halveringstid, kun 3 timer for prednisolon. Dette gjør at man ved å dosere én gang daglig havner under terapeutisk vindu andre halvdel av døgnet (12). Det er også hevdet at man ved å dele opp døgndosen i to, kan ha lavere total døgndose (12-14). Det er sett positiv effekt på plasmaglukosenivå og nedsatt hyperglykemi hos pasienter som fikk prednisolon/prednison to ganger daglig, kontra én gang daglig (13). Dosering og bivirkninger Glukokortikoider gis til alle pasienter. Etter dagens behandlingsprotokoll gis én høy dose metylprednisolon a 250 mg første dag. Videre gis prednisolon én gang daglig, med oppstart 11

24 på 20 mg og nedtrapping til 5 mg over seks måneder. Behandlingen fortsetter med 5 mg daglig. Ved tegn til avstøtning behandles pasientene med metylprednisolon i høye doser over fire dager (7). Den kliniske responsen hos pasientene varierer betraktelig og det er vanskelig å forutsi hvem som er utsatt for bivirkninger og hvem som vil oppleve mangelfull effekt og avstøtningsreaksjoner. En mulig forklaring for individuelle variasjoner i effekten av glukokortikoidbehandlingen kan være polymorfisme i CYP 3A4, membrantransportøren P- glykoprotein eller i GR (12). Ved inntak av glukokortikoider nedregulerer kroppen sin egen kortisolproduksjon. Dette kan føre til alvorlige bivirkninger ved for brå seponering av glukokortikoidbehandling. Kroppen kan bruke lang tid på å gjenoppta sin endogene produksjon (8). Formålet med behandlingen er å unngå avstøtning av det transplanterte organet, og derfor er man i utgangspunktet forsiktig med å gi for lave doser eller seponere behandlingen for denne pasientgruppen (12). Bivirkninger av behandlingen er knyttet til dose og lengde på behandling. Høye doser i over én uke, og lave doser over tid er knyttet til toksisitet. GR finnes uttrykt i nesten alle kroppens celler. Dette gjør at behandling med glukokortikoider har bred effekt, og medfølgende bivirkninger. En av risikoene ved immundempende behandling er økt fare for infeksjoner, og gjelder også for glukokortikoider. Glukokortikoider kan indusere eller forverre diabetes mellitus gjennom endret karbohydrat- og proteinmetabolisme. Ved å stimulere lever til økt syntese av glukose og lagring av glykogen, og senke glukoseforbruket i perifert vev, øker glukokortikoider plasmakonsentrasjonen av glukose. Endret lipidmetabolisme er også en vanlig bivirkning. Det skjer en endring i distribusjonen av kroppsfett som er karakteristisk for forhøyede glukokortikoidnivåer. Osteoporose er en bivirkning ved langvarig bruk og skyldes flere mekanismer som påvirker nydannelsen av benvev. Dette skyldes også hemmet vekst hos barn. Hudatrofi som skyldes nedsatt proliferasjon av kutane celler og proteinsyntese starter etter kun noen dager. Andre kjente bivirkninger er magesår, hypertensjon, økt appetitt og myopati (8, 10). Den vanligste dødsårsaken blant organtransplanterte pasienter med funksjonelt organ er kardiovaskulære sykdommer. Det er derfor svært viktig å redusere disse bivirkningene (15). Kroppens kortisolproduksjon følger naturlige døgnvariasjoner, med høyest plasmakonsentrasjon om morgen mellom klokken 6-9, og lavest om kvelden mellom klokken Doseringen av prednisolon er derfor lagt til morgenen for å opprettholde kroppens 12

25 naturlige døgnvariasjon. Dette er blant annet for at pasienter ikke skal oppleve søvnproblemer (10, 12, 16). 1.2 Terapeutisk legemiddelmonitorering På grunn av variasjoner mellom individer kan plasmakonsentrasjonen av et legemiddel variere mye mellom ulike pasienter som inntar samme dose. Dette kalles interindividuell variabilitet og er ulikt for hvert legemiddel. Variabiliteten i plasmakonsentrasjon kan skyldes pasientens kjønn, alder, vekt, mengde kroppsfett, matinntak, sykdomsbilde, andre legemidler og miljøfaktorer som røyking. Genetisk variasjon påvirker pasientens CYP-uttrykk og vil kunne påvirke metabolismen av legemidler i kroppen. Mange pasienter bruker flere legemidler og muligheten for at de påvirker hverandres kinetikk er til stedet (17). I noen tilfeller er en slik variasjon skadelig for pasienter og man bruker terapeutisk legemiddelmonitorering (TDM) for å kompensere for variabiliteten. En forutsetning for bruk av TDM er at det ikke foreligger en helt lineær sammenheng mellom dose og respons. Dersom TDM skal brukes til å oppnå terapeutisk effekt må det foreligge en sammenheng mellom målt konsentrasjon og effekt eller bivirkninger. TDM brukes hovedsakelig for legemidler med smalt terapeutisk vindu eller der hvor farmakologisk effekt er vanskelig å vurdere. En del immunsuppressiva havner under begge disse kategoriene. TDM kan også brukes for å undersøke adherence, effekt av behandling og ved mistanke om toksisitet. Terapiområder hvor TDM er etablert praksis omfatter antiepilekptika, antibiotika, noen hjerte/kar-medikamenter og immunsuppressiva. TDM er en måte å optimalisere behandlingen for hver enkelt slik at pasienten får best mulig effekt med lavest mulig forekomst av bivirkninger. Monitorering omfatter både kvantifisering av legemiddel i en biologisk matriks, tolkning av resultatene og rådgivning. Det er ressurskrevende arbeid, og det er derfor hensiktsmessig at TDM kun benyttes der det er en nytteverdi (18). Det er ofte utfordrende eller umulig å måle konsentrasjonen av legemiddel på virkestedet, derfor er det vanligste å måle legemiddelkonsentrasjon i blod eller plasma. I noen tilfeller måles legemiddelkonsentrasjonen i fullblod, blant annet for kalsineurinhemmere. Man kan enten måle totalkonsentrasjon eller fri konsentrasjon for legemiddelet. Det er mer omfattende å måle fri konsentrasjon, derfor måles totalkonsentrasjon der det korrelerer med effekt eller toksisitet. For enkelte legemidler er sammenhengen bedre med fri konsentrasjon og man 13

26 bruker denne. Der hvor det er dårlig korrelasjon mellom legemiddelkonsentrasjon og effekt kan alternativet være å måle relevante biomarkører (18). I transplantasjonssammenheng utføres TDM for kalsineurinhemmere og mtor-hemmere, og til dels for mykofenolat. Dette er mulig fordi det er påvist sammenhenger mellom legemiddelkonsentrasjon og klinisk effekt, og over tid har man ved hjelp av kliniske studier kommet frem til terapeutiske områder som benyttes. Det er i tillegg smale terapeutiske vindu, stor grad av inter- og intravariabilitet, vanskelig å se om man oppnår god effekt, fare for dårlig adherence og fare for interaksjoner. Prednisolon og metylprednisolon måles ikke rutinemessig. Her gis forhåndsdefinerte doser, ofte basert på erfaring (empiri), i noen tilfeller klinisk evidens (18). 1.3 Legemiddelanalyse i prøver fra pasienter Analysemetoder som brukes til TDM: Vanlige analysemetoder i TDM omfatter immunoassay, væskekromatografi og gasskromatografi, hvor immunoassay og væskekromatografi er mest bruk (19). European Medicines Agency (EMA) har utarbeidet en egen retningslinje for bioanalyse av legemidler, og denne angir anbefalinger for metodevalidering og kvalitetskrav til analyser som utføres i kliniske studier (20). Det er også vanlig å bruke EMA-retningslinjene for analysemetoder som benyttes til TDM (18). Immunoassay Immunoassay er enkle og raske analyser som baserer seg på antistoff-antigenbinding som gir en detekterbar respons. Det finnes utallige forskjellige markører for respons, blant annet radioaktive isotoper og fluorescens. Fordelene med immunoassay er at de er raske, enkle å bruke og kommersielt tilgjengelige. Det krever ikke omfattende opplæring i å utføre analysene. Ulempen med disse metodene er at de ofte ikke er spesifikke nok, man kan få kryssreaksjoner med metabolitter som gir systematiske feil ved kvantitativ analyse (18, 19, 21). 14

27 Gass- og væskekromatografi Kromatografiske metoder har til felles at de separerer stoffer basert på fysikalske- og kjemiske egenskaper. Prøven injiseres i en mobilfase, som vist i figur 4, som beveger seg gjennom en kolonne med et materiale: en stasjonærfase. Gjennom interaksjoner med stasjonærfasen bremses stoffene i ulik grad på kolonnen, og på denne måten separeres stoffene i prøven. I enden av kolonnen sitter en detektor. Det finnes mange ulike detektorer, blant annet UV-detektor, flammeioniseringsdetektor og massespektrometer (18, 19). Figur 4. Generelt oppsett for væskekromatografi Stoffer i prøven som interfererer med hverandre med tanke på detektorrespons bør separeres kromatografisk. Valg av detektor og hvilke stoffer som skal analyseres er avgjørende for hvor godt de må være separert. En selektiv detektor som massespektrometer er mindre avhengig av kromatografisk separasjon, men vil i tilfeller hvor stoffene har lignende molekylmasse dra nytte av separasjon. Valg av mobilfase, stasjonærfase, partikkelstørrelse, kolonnelengde, flowhastighet, temperatur og trykk spiller inn på retensjonstiden (18). For at en forbindelse skal kunne analyseres ved gasskromatografi (GC) må den enten være flyktig eller kunne gjøres flyktig ved hjelp av derivatisering. Mobilfasen i GC er en gass. Dette er en begrensende faktor som gjør at det benyttes i mindre grad enn væskekromatografi (18, 19). I væskekromatografi (LC) er mobilfasen i væskeform. Figur 4 skisserer et generelt oppsett for væskekromatografi. High-performance liquid chromatography (HPLC) og ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) brukes hyppig i bioanalyse (18). UHPLC er en videreutvikling av HPLC med kortere kolonner, som gir raskere separasjon. Kolonnens pakkemateriale har partikkelstørrelse under 3 µm, i motsetning til HPLC hvor partiklene er større. Navnet kommer fra at systemet må tåle et høyt mottrykk. Dette skyldes de små partiklene i kolonnen. Ved å benytte kortere kolonne oppnår man kortere analysetid og lavere 15

28 deteksjonsgrense, i tillegg til lavere injeksjonsvolum og redusert forbruk av mobilfase. Det er vanlig å bruke omvendt-fase-kromatografi, hvor stasjonærfasen er upolar og stoffene retarderes på grunn av van der Waalske-interaksjoner med stasjonærfase. Mobilfasen er gjerne en blanding av metanol og vann eller acetonitril (ACN) og vann, og en buffer. I tillegg til å analysere prøvene, analyseres også standardprøver med kjent konsentrasjon. Ut i fra disse lages en standardkurve som danner bakgrunn for kvantifisering av selve prøvene (19). Massespektrometri Massespektrometer er en type detektor som brukes mye i kombinasjon med kromatografi. Sammen vil de to metodene gi analysesvar med høy grad av sikkerhet. Mens HPLC-kolonnen vil separere stoffene, vil massespektrometeret kunne skille stoffer som har lik retensjonstid på kolonnen men ulik masse. På denne måten vil den også kunne skille metabolitter fra hverandre. For enda høyere sikkerhet er det mulig å koble to massespektrometri (MS) detektorer etter hverandre. Da vil moderionene etter å ha passert gjennom første MS-detektor spaltes i fragmenter, før det igjen detekteres på et av fragmentene (18, 19, 22). Før analytten når massespektrometeret går den gjennom en ionisering. Dette foregår i ionekilden. Det er ulike måter analytten kan bli ionisert på, de vanligste for LC-MS er elektrosprayionisasjon (ESI) og atmosfæretrykk-kjemisk-ionisasjon (APCI). Videre akselereres ionene inn i en masseanalysator og separeres etter masse til ladning-ratio: m/z ved hjelp av varierende elektromagnetiske felt. Deretter detekteres ionene og man kan få både kvalitative og kvantitative svar. Figur 5 viser et generelt oppsett av de ulike trinnene i prosessen. Kvantitative resultater oppnås ved kromatogrammer hvor måleintensitet plottes mot tid (19). Figur 5. Generelt oppsett for massespektrometri 16

29 Det finnes ulike ionekilder og ulike masseanalysatorer. Den vanligste masseanalysatoren er kvadrupol som kan kontrollere hvilke ioner som slipper igjennom ved hjelp av elektriske felt. Dette fungerer som et filter, og kun de ønskede massene slipper igjennom. Den høye selektiviteten man får ved bruk av MS skyldes hvert molekyl sin unike fragmentering. Fragmenteringsmønsteret fungerer som et fingeravtrykk og kan brukes til identifisering av stoffene. Ved kvantitative analyser er det ikke nødvendig å detektere alle fragmentene, man kan velge ut ett eller flere ionefragmenter man måler på, i motsetning til fulle ionescan hvor alle fragmenter detekteres (18). En svakhet med massespektroskopi er variasjon i instrumentresponsen. Responsen kan variere fra prøve til prøve i samme analyseserie, og det er derfor viktig å benytte egnede internstandarder. Hensikten med å bruke en internstandard er å øke presisjon og nøyaktighet, samtidig som metodens robusthet øker. Det kan ha skjedd tap av analytt under pipettering, adsorpsjon, fordamping, variasjon i injeksjonsvolum eller variasjon i instrumentresponsen til massespektrometeret. Ved å tilsette internstandard tidlig i prosessen og bruke analytt:internstandard respons ratio ved kvantifisering vil det meste av den nevnte variasjonen eller tapene kompenseres for (22). Faktorer som påvirker analytten vil påvirke internstandarden i tilsvarende grad. Det ønskelige er å bruke stabile isotopmerkede internstandarder der slike er tilgjengelig. De vil ha svært like kjemiske egenskaper og oppnår derfor tilsvarende retensjonstid. Stabile isotopmerkede internstandarder skiller seg fra analytten i at det er byttet ut ett eller flere atomer med stabile isotoper av samme grunnstoff. Stabile isotoper har ulikt antall nøytroner i kjernen. Det vanligste er å merke forbindelsene med 2 H (deuterium), 13 C, 15 N eller 18 O. Hensikten med isotopmerkingen er å få en internstandard som eluerer samtidig med analytten fra den kromatografiske kolonnen (22). Det er vist at deuteriummerkede internstandarder kan ha noe ulike fysikalsk-kjemiske egenskaper enn sine korresponderende analytter. Dette resulterer i ulik retensjonstid for omvendt-fase-kromatografi. 2 H-atomer binder sterkere til karbon enn hva 1 H-atomer gjør, noe som endrer egenskapene til forbindelsen. Forbindelsen blir noe mer polar og eluerer tidligere. Flere deuterium i samme molekyl vil øke den mulige forskjellen i retensjonstid. Samtidig er det ønskelig at det er minst tre isotopmerkede atomer i molekylet for å unngå interferens mellom analytt og internstandard. Ulik retensjonstid kan ha betydning for korrigering av eventuelle matrikseffekter. Matrikseffekter oppstår når ionesignalene i massespektrometeret 17

30 blir påvirket av komponenter i den biologiske matriksen. Dette er uforutsigbart og vil gi feil analysesvar. Ikke bare antall deuterium, men også plassering i molekylet, molekylstørrelse, molekylstruktur, retensjonsmekanisme og mobilfase ph spiller inn (23-25). Bruk av UHPLC som gir enda mer effektiv separasjon kan ytterligere øke separasjonen mellom isotopet og analytten. Det er også observert ulikt ekstraksjonsutbytte mellom deuteriummerket intern standard og andre isotopmerkede internstandarder. Dette kan skyldes endrede fysikalsk-kjemiske egenskaper eller plassbytte mellom hydrogen og deuterium. I tillegg er det viktig at internstandarden har tilfredsstillende renhet og ikke bidrar til analyttsignalrespons. 13 C, 15 N og 18 O er likere sine respektive analytter enn hva 2 H er, og det anbefales derfor å bruke internstandarder med disse isotopene. Pris og kommersiell tilgjengelighet begrenser ofte muligheten, og derfor er deuterium mest brukt (22). Som ved andre analysemetoder kan man også ved LC-MS oppleve interferens. Et kjent problem er som nevnt matrikseffekter hvor ionesignalene i massespektrometeret blir påvirket av komponenter i den biologiske matriksen. Det vanligste problemet er ionesuppresjon og utgjør særlig et problem i tilfeller der hvor internstandarden ikke påvirkes i samme grad som analytten. Det er derfor viktig å undersøke dette under metodevalidering (18, 22). Fordelene med LC-MS/MS er muligheten til å utføre samtidige, spesifikke analyser av flere analytter med vesentlige konsentrasjonsforskjeller i samme prøve (26). LC-MS/MS gir høy selektivitet på grunn av at identifikasjon er basert på både retensjonstid og molekylmasse/ladning-ratio (19) Prøveopparbeidelse Før man kommer så langt som til selve analysen må prøven gjennom en prøveopparbeidelse. Riktig prøveopparbeidelse er spesielt viktig i bioanalyse. Den biologiske matriksen inneholder mange komponenter det ikke er ønskelig å injisere i analyseinstrumentet. Proteiner i plasma vil felle ut på kolonnen og lage problemer. I tillegg til å forårsake problemer i instrumentet, kan den biologiske matriksen påvirke analyseresultatene gjennom interferens. Matrikseffekter hvor ionesignalene blir påvirket av komponenter i den biologiske matriksen er et potensielt problem ved bruk av MS. Dette er uforutsigbart og vil gi feil analysesvar. Det kan ofte korrigeres med å bruke en intern standard. Dette er en del av valideringen ved metodeutvikling (19, 22). 18

31 Andre ganger er det nødvending å oppkonsentrere analytten for i det hele tatt å kunne detektere en respons. Prøveopparbeidelse er ofte den mest tidskrevende delen av analysen, og også en potensiell feilkilde. Det krever høy nøyaktighet hos den som utfører arbeidet, og nøye vurdering av alle materialer som brukes. For dårlig miksing før pipettering eller krysskontaminasjon er noe av det man må være oppmerksom på. Det er også viktig at analytten bevares og ikke degraderer under prøveopparbeidelsen. Dette er noe av grunnen til at automatisering av prøveopparbeidelse blir mer og mer vanlig. Det sikrer bedre presisjon og er ergonomisk gunstig. Bruk av intern standard er med på å kompensere for uregelmessigheter og gjør enkle metoder som fortynning og proteinfelling attraktive. En helhetsvurdering vil avgjøre hva slags prøveopparbeidelse som velges (19, 22). Fortynning / dilute-and-shoot Fortynning er den enkleste formen for prøveopparbeidelse. Det innebærer kun å fortynne prøven med en løsning som er egnet for LC-MS. Prøveopparbeidelsen gir 100 % utbytte men mangler selektivitet. Metoden fjerner ikke potensielle forurensninger og er mest egnet der matrikseffekter og interfererende forbindelser ikke er et problem. Fordelene med metoden er lave kostnader, enkel å håndtere og bevarer analyttene. Ulempene er at signalene til analyttene kan bli svake og mulighetene for matrikseffekt. Metoden er derfor ikke egnet for matrikser som inneholder proteiner og lipider (22). Væske-væske-ekstraksjon (LLE) LLE baserer seg på prinsippet om hvordan analytten fordeler seg mellom to ikke-blandbare væsker. Analyttens løselighet og ph vil være avgjørende for hvilken fase den befinner seg i. Fordelingen mellom fasene er knyttet til fordelingskoeffisienten (log P) eller distribusjonskoeffisienten (log D) til analytten. Der hvor log P- verdien beskriver ratioen til analyttens fordeling mellom to ikke-blandbare faser på uionisk form, beskriver log D-verdien det samme ved angitt ph-verdi. Ved å blande den vandige plasmafasen med en organisk fase og styre ph slik at analytten foreligger i uladet form, vil analytten ekstraheres ut av den vandige fasen og over i organisk fase. Dette vil imidlertid også andre lipofile stoffer. Derfor utføres det også en tilbake-ekstraksjon, hvor organisk fase blandes med ny vandig fase. Ved å justere ph kan man bestemme hvilken fase analytten foreligger i, så lenge den er mulig å ionisere. Metoden vil isolere analytten, og valg av løsemiddelvolum bestemmer om prøven 19

32 oppkonsentreres, fortynnes eller beholder samme konsentrasjon. Det er viktig å bruke en intern standard for å ha kontroll på utbytte. LLE er en mye brukt metode i bioanalyse. Det er også blitt mulig å automatisere LLE. LLE er ikke egnet for hydrofile stoffer, og det kan være vanskelig å utvikle en metode som klarer å ekstrahere flere analytter med ulik lipofilisitet. En annen ulempe med denne formen for prøveopparbeidelse er at den krever bruk av løsemiddel (19, 22) Fast-fase-ekstraksjon (SPE) SPE ligner på LLE, men istedenfor å ekstrahere analytten over i en ny vannfase brukes et fast stoff (sorbent) som binder analytten. SPE utføres ved hjelp av kolonner som er pakket med utvalgt sorbent. Det er mange ulike kolonner på markeder, med ulike materialer og ulik porestørrelse. Prinsippet baserer seg på at analytten interagerer bedre med sorbenten enn med væsken. Ekstraksjonsprosessen foregår i fire trinn: først kondisjonering av kolonnen. Dette er for å gjøre den klar til å ta i mot prøven. Deretter påsettes prøven. I dette trinnet vil en del av forurensningene vaskes vekk. Stoffer som ikke interagerer med sorbenten vil eluere gjennom kolonnen og ut på andre siden. Det er viktig å velge en sorbent som klarer å fange opp all analytt. Neste trinn innebærer å vaske vekk forurensningene som har festet seg til sorbenten. Her er elueringsstyrken på vaskeløsningen avgjørende. Den må ikke være såpass sterk at den også vasker vekk analytten. I siste trinn elueres analytten ut. Også her er elueringsstyrken viktig. Den må være sterk nok til at all analytt vaskes ut, samtidig som forurensinger med sterkere binding til sorbent forblir på kolonnen. SPE finnes både for normalfaseekstraksjon, ionebytteekstraksjon, blandet-fase-ekstraksjon og omvendt-fase-ekstraksjon. De tre siste brukes for vandige prøver. SPE er egnet for å automatisere og bruker mindre mengde løsemiddel sammenlignet med LLE. Det er derfor en mye brukt metode for prøveopparbeidelse (19, 22). Den største fordelen med SPE er høy selektivitet, allsidighet og mulighet for automatisering. På grunn av ulike pakkematerialer er metoden passende for et stort spekter av stoffer: polare og ikke-polare, sure eller basiske, lav eller høy molekylvekt og ulike matrikser. En optimalisert metode gir høyt utbytte og god selektivitet med god reproduserbarhet. Ulemper er høye kostnader, avhengig av kvaliteten på utstyret og lang metodeutviklingstid. Metoden innebærer også mange steg og godt trent personal (22). 20

33 Proteinfelling (PP) En attraktiv metode for prøveopparbeidelse som er en del enklere enn LLE og SPE, er proteinfelling. Denne metoden benytter kun fellingsreagens som får proteinene til å felle ut, før prøven sentrifugeres og supernatanten injiseres i analyseinstrumentet. Metoden fjerner ikke forurensninger i prøven utover proteiner, og er derfor avhengig av at stoffene separeres godt i analysen og ingen forurensninger gir interferens. Vanlige fellingsreagens er metanol, acetonitril og sinksulfat (22). Fordeler med proteinfelling er at det er en anvendelig metode som passer de fleste små molekyler uavhengig av polaritet, prosessen er rask og lar seg automatisere. Utbytte av analytten er ofte 100 %. Ulempen er at det fortsatt er endogene stoffer igjen i prøven som kan lage problemer for både separasjon på HPLC-kolonne og MS-deteksjon. Metoden kan gi høy matrikseffekt (22) Validering: EMA guideline bioanalytical method validation Alle bioanalytiske metoder, enten de er for klinisk rutinebruk eller forskning, må valideres etter gjeldende regelverk (19). EU har i regi av European Medicines Agency utarbeidet en egen guideline for nettopp dette: guideline on bioanalytical method validation (20). Der dekkes de ulike valideringsparameterne og hvilke krav som stilles. En metodevalidering demonstrerer at den aktuelle metoden er pålitelig og reproduserbar for sin tiltenkte bruk (22). Valideringen dekker områder som selektivitet, carry-over, nedre kvantifiseringsgrense, kalibreringskurve, nøyaktighet, presisjon, fortynning, matrikseffekt og stabilitet (20). Selektivitet Det er viktig at metoden er i stand til å skille analytter og internstandarder fra andre stoffer i matriksen. Det gjelder både andre legemidler og endogene stoffer. Særlig for steroider er det mye endogene stoffer i blodet som kan interferere med analysen. Selektivitet påvises ved å bruke minst seks individuelle kilder til den aktuelle blanke matriksen, og analysere disse for interferens. Kravet er at signalstyrken til eventuelle interfererende stoffer er under 20 % av nedre kvantifiseringsgrense for analytter og 5 % for internstandarder (20). 21

34 Overdragning (carry-over) Overdragning er problemer knyttet til rester av prøvemateriale fra en foregående prøve som påvirker neste analyse og tolkingen av resultatene. Dette vil gi feil analysesvar og må unngås. Under validering sjekker man for overdragning ved å injisere blank prøve etter øverste kalibrator. Kravet er at overdragningen i den blanke prøven ikke er større enn 20 % av nedre kvantifiseringsgrense og 5 % for internstandarden. Overdragning bør vurderes og minimaliseres dersom det er et problem. Dersom overdragning ikke er til å unngå, bør det innføres tiltak for å unngå at dette blir et problem i metoden. Disse tiltakene kan innebære utvasking ved å legge inn blanke prøver etter forventede prøver av høy konsentrasjon, og unngå randomisering av prøver der det er praktisk mulig (20). Nedre kvantifiseringsgrense Nedre kvantifiseringsgrense (LLOQ) angir laveste konsentrasjon metoden kan måle med tilfredsstillende nøyaktighet og presisjon. Laveste kalibrator kan også definere LLOQ. Signalet for LLOQ skal være minst 5 ganger så høyt som signalet i en blank prøve (20). Kalibreringskurve For å bestemme konsentrasjon i prøvene lages en kalibreringskurve. Den angir sammenhengen mellom instrumentrespons og den kjente konsentrasjonen i kalibratorene. Det skal lages en kalibratorkurve for hver analytt og for hver serie som kjøres. Kalibratorene skal fremstilles i samme matriks som de aktuelle prøvene. Blank matriks tilsettes kjente konsentrasjoner av analytt og det lages en standardkurve. Kurven skal dekke fra LLOQ til ULOQ, med minst 6 målepunkter på kurven. I tillegg analyseres en blank prøve: blank uten analytt eller intern standard og en nullprøve: matriks med intern standard. Alle kurvene, men minst 3, skal inngå i valideringen. Den tilbake-kalkulerte konsentrasjonen av kalibratorene og de kalkulerte gjennomsnittlige nøyaktighetsverdiene inngår også. De tilbake-kalkulerte verdiene for kalibratorene skal være innenfor 15 % av nominell verdi og 20 % for LLOQ. Minst 75 % av kalibratorene må møte disse kravene. Minst tre kurver skal inngå i valideringen. Det er foretrukket å bruke nylig tilberedte kalibratorer, men dersom stabilitetsdata tilsier at prøvene kan lagres er dette akseptabelt (20). Det er ved bruk av massespektrometer anbefalt å benytte intern standard for å korrigere for endringer som skjer under prøveopparbeidelse og variasjon i instrumentrespons (22). Kurven bør dekke det 22

35 forventede konsentrasjonsområdet. Parameterne stigningstall og skjæringspunkt rapporteres, i tillegg til tilbakekalkulerte verdier og gjennomsnittlig nøyaktighet (20). Nøyaktighet Nøyaktighet undersøkes ved å analysere kvalitetskontroller med kjent konsentrasjon. Matriks tilsettes kjent konsentrasjon av analytt og analyseres ved hjelp av kalibreringskurven. Nøyaktighet oppgis som prosent av nominell verdi. Det bestemmes både innen-serienøyaktighet og mellom-serie-nøyaktighet. Nøyaktighet valideres ved å analysere minimum fem prøver ved hver av følgende konsentrasjonsnivåer: LLOQ - lav kvalitetskontroll - medium kvalitetskontroll - høy kvalitetskontroll. Lav kvalitetskontroll skal være maks tre ganger konsentrasjonen til LLOQ, medium kvalitetskontroll skal være innen % av høyeste kalibrator, mens høy kvalitetskontroll skal være minst 75 % av høyeste kalibrator (20). EMAs retningslinjer angir minst fire konsentrasjonsnivåer, men man kan undersøke flere. Krav til nøyaktighet for innen-serie-nøyaktighet er at gjennomsnittskonsentrasjonen faller innenfor 15 % av nominell verdi for kvalitetskontrollene, mens LLOQ skal være innenfor 20 % (20). For mellom-serie-nøyaktighet brukes de samme konsentrasjonsnivåene som over. Kravet er å evaluere minst tre kjøringer analysert på minst to ulike dager. Gjennomsnittskonsentrasjon skal være innenfor 15 % av nominell verdi for kvalitetskontrollene, mens LLOQ skal være innenfor 20 % (20). Metodens nøyaktighet beskriver hvor mye den avviker fra sann verdi. Dette er for å forhindre systematiske feil i metoden. Alle resultater skal inngå i dokumentasjonen (20). Presisjon Presisjon angir spredning i analyseresultatene, og demonstreres for LLOQ og lav, medium og høy kvalitetskontroll i en enkelt kjøring og mellom ulike kjøringer, tilsvarende nøyaktighet. Alle resultater skal inngå i dokumentasjonen (20). 23

36 For innen-serie-presisjon analyseres minst fem prøver per konsentrasjonsnivå for de nevnte fem konsentrasjonene. EMAs krav til godkjent validering er at resultatene faller innenfor 15 % variasjonskoeffisient (VK) for kvalitetskontrollene og 20 % VK for LLOQ (20). For mellom-serie-presisjon skal de samme fem konsentrasjonsnivåene fra minst tre kjøringer på minst to ulike dager evalueres. Kravet til presisjon er at prøvene faller innenfor 15 % VK for kvalitetskontrollene og 20 % VK for LLOQ (20). Fortynningsintegritet Fortynning av prøver må ikke påvirke nøyaktighet og presisjon. Dersom det er relevant demonstreres fortynningsintegritet ved å tilberede en prøve med konsentrasjon høyere enn ULOQ, og deretter fortynnes prøven med blank matriks. Nøyaktighet og presisjon for de fortynnede prøvene skal være innenfor kravet, ± 15 %. For hver faktor prøven fortynnes skal minst fem analyser gjøres (20). Matrikseffekter Matrikseffekt må undersøkes når massespektrometri benyttes. Det gjøres ved å bruke minst seks prøver blank matriks fra individuelle donorer, og undersøkes for alle analytter og internstandarder. Matriksfaktor beregnes ved å finne ratio av arealet til forbindelsen i matriks mot arealet av forbindelsen i ren løsning. Videre beregnes internstandard-normalisert matriksfaktor ved å dividere matriksfaktor for analytt på matriksfaktor for internstandard. Variasjonskoeffisienten for internstandard-normaliserte matriksfaktor skal ikke være mer enn 15 % for de seks prøvene. Undersøkelsene bør gjøres ved lave og høye konsentrasjoner tilsvarende maksimum tre ganger nedre kvantifiseringsgrense og nær øvre kvantifiseringsgrense (20). Stabilitet For å være sikker på at konsentrasjonen til analyttene ikke endres i løpet av oppbevaring, prøveopparbeidelsestiden eller analysen, gjøres en vurdering av stabilitet. Stabilitet bør sikres for hvert steg i metoden, og det er ikke tilstrekkelig å henvise til litteratur (20). Stabilitet vurderes ved å bruke kvalitetskontrollprøver av lav og høy konsentrasjon som analyseres umiddelbart etter fremstilling og etter lagring ved de aktuelle betingelser. 24

37 Kontrollprøve av lav konsentrasjon skal bestå av blank matriks tilsatt analytt av maks tre ganger så høy konsentrasjon som LLOQ. Kontrollprøve av høy konsentrasjon tilberedes på tilsvarende måte men med konsentrasjon nær ULOQ (20). Prøvene analyseres mot en kalibreringskurve og gjennomsnittskonsentrasjon ved hvert konsentrasjonsnivå skal være innen +-15 % av nominell konsentrasjon (20). Stabilitet skal kartlegges for alle trinnene i analyseprosessen, fra prøvetaking til autosampler. EMA angir hvilke områder som bør stabilitetstestes. I tillegg angis områder som bør testes der det er aktuelt (20) Analyse av glukokortikoider Glukokortikoider tilhører steroidfamilien og består av det karakteristiske steroidskjelettet. Forbindelsene har ulike funksjonelle grupper, men felles for alle biologisk aktive glukokortikoider er hydroksylgruppe i C11-posisjon (8). I figur 6 er det oversikt over strukturene til glukokortikoider i bruk ved nyretransplantasjon, prednisolon og metylprednisolon, og deres inaktive metabolitter prednison og metylprednison. Det er i tillegg vist strukturen til kortisol og dens inaktive metabolitt kortison. Kortisol, prednisolon, metylprednisolon og deres inaktive metabolitter kortison, prednison og metylprednison har meget like kjemiske egenskaper. Tidligere ble disse forbindelsene analysert ved hjelp av immunoassay, men på grunn av kryssreaksjon mellom prednisolon og kortisol er ikke denne metoden optimal for kvantifisering av glukokortikoider (12, 27). LC-MS/MS-analyse fremstår som et godt alternativ for kvantifisering av disse forbindelsene. På grunn av tilnærmet lik molekylvekt på flere av stoffene må de skilles kromatografisk fra hverandre før de kan analyseres ved hjelp av massespektrometri (12, 28). Det finner allerede flere publiserte metoder for LC-MS analyse av glukokortikoider. Felles for disse er at de har en omfattende prøveopparbeidelse. SPE, LLE og PP brukes alle som prøveopparbeidelsesmetoder ved analyse av steroider. Mange metoder er publisert, men ikke alle er egnet for rutinebruk (26, 28). Også flere av metodene som benytter PP, har flere påfølgende steg med inndamping og reoppløsning. Lang run-tid og omfattende prøveopparbeidelse er gjennomgående (26, 29-32). 25

38 Figur 6. Struktur av glukokortikoidene kortisol, kortison, prednisolon, prednison, metylprednisolon og metylprednison, og deres molekylvekt. 26

39 2 Hensikt Hensikten med prosjektet var å utvikle en enkel LC-MS/MS-metode for å kvantifisere glukokortikoider i plasma, og dersom mulig også mykofenolat. De aktuelle glukokortikoidene er prednisolon, prednison, kortisol, kortison, metylprednisolon og metylprednison. Prøveopparbeidelsen var bestemt til proteinfelling. Det viste seg å være vanskelig å sette opp en metode for både glukokortikoider og mykofenolat. For mange kompromisser gjorde at metoden ikke ble tilfredsstillende for noen analytter. Avdelingen skal også gå til anskaffelse av en UHPLC-UV som skal brukes i rutineanalyse av mykofenolat. Behovet for en LC-MS/MS-metode var derfor ikke lenger til stedet og mykofenolat ble tatt ut av metoden tidlig i prosessen. Arbeidet bygger videre på en tidligere publisert metode utarbeidet av Ingjerd Sæves. Hun har i sitt masterarbeid utarbeidet en LC-MS/MS-metode for de samme glukokortikoidene, og senere publisert en artikkel med de samme glukokortikoidene, med unntak av metylprednison. Metoden benytter seg av proteinfelling etterfulgt av væske-væske-ekstraksjon og inndamping. Siden den gang har avdelingen gått til innkjøp av mer sensitive måleinstrumenter koblet til UHPLC. Der den forrige metoden tok lang tid med ekstraksjon og run-tid på over 10 minutter, vil de nye måleinstrumentene ikke lenger være avhengig av ekstraksjon og run-tiden går betraktelig ned med UHPLC. Det er i tillegg publisert flere metoder for måling av glukokortikoider ved hjelp av LC- MS/MS. Felles for alle er mer omfattende prøveopparbeidelse enn ønskelig. Det vil også være en fordel om metoden kan automatiseres og utføres ved hjelp av robot slik som andre analyser i rutinearbeidet. 27

40 3 Materialer og metode 3.1 Reagenser og utstyr Tabell 1 viser oversikt over hvilke reagenser, med tilhørende kvalitet og produsent, som er brukt i forbindelse med denne masteroppgaven. Tabell 2 viser en oversikt over utstyr. Tabell 1. Oversikt over reagenser Bruksnavn Produktnavn Kvalitet Leverandør Acetonitril Acetonitrile HPLC Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway Ammonium-acetat Ammonium acetate LC-MS Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway D2-kortison Cortisone d2 99,4 % CDN Isotopes, Quebec, Canada D4-kortisol Cortisol-D4 sol. 100 ug/ml 99,2 % Sigma-Aldrich, Norway AS, Oslo, Norway D4-metylprednisolon 6α-methyl-prednisolone-d4 100,0 % Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D4-prednison Prednisone-d4 100 % Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D6-metylprednisolon Methyl-prednisolone D6 98,6 % Clearsynth, Mumbai, India D6-prednisolon Prednisolone d6 97,0 % CDN Isotopes, Quebec, Canada D8-prednisolon Prednisolone-d8 (major) Ikke oppgitt Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D8-prednison Prednisone-d8 Ikke oppgitt Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada Kortisol Cortisol sol. 1.0 mg/ml 100 % Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway Kortison Cortisone sol. 100 µg/ml 100 % Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway Maursyre Formic acid LC-MS Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway Metanol Methanol LC-MS Rathburn, March, Storbritannia Metanol Methanol HPLC Rathburn, March, Storbritannia Metylprednisolon 6α-Methyl Sigma-Aldrich Norway AS, 98 % prednisolone Oslo, Norway Metylprednison 6α- Methyl prednisone 98,0 % Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada Prednisolon Prednisolone 99 % Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway Prednison Prednisone 98,40 % Sigma-Aldrich Norway AS, Oslo, Norway sfbs Stripped Fetal Bovine Sigma-Aldrich Norway AS, Ikke oppgitt Serum Oslo, Norway Sinksulfat Zinc sulfate solution 0,1 M Volumetrisk Sigma-Aldrich Norway AS, titrering Oslo, Norway Vann Vann Milli-Q 18,5 MΩ/cm Millipore egetprodusert 28

41 Tabell 2. Oversikt over utstyr Beskrivelse Produktnavn Leverandør Kjølesentrifuge 4 C Rotana 460 Robotic Hettic Kolonne LC-MS/MS Raptor Biphenyl 2,7 µm 50x2,1 mm Restek LC-MS/MS Trandscend II LX-2 TSQ Quantiva Thermo Scientific Mikrosentrifugerør 1,5 ml Micro tube 1,5 ml Sarstedt Pipetter Finnpipette LabSystems Pipettespisser Art tips Thermo Scientific Plate 96 brønner 96 deep well plates, 2 ml Hamilton Platerister Multi Plate Shaker BioSan Plastfilm til plate Rapid Slit Seal Bio Chromato Rør 50 ml, sterile Tube 50 ml Sarstedt Rør 2,5 ml CryoTubes Nunc Rør 4 ml CryoTubes Nunc 3.2 Tillaging av reagenser Mobilfaser Mobilfasene består av to løsninger. Løsning A ble laget ved å tilsette 2000 µl mausyre til 2,00 L vann av UHPLC-MS kvalitet. Deretter ble 0,308 gram ammoniumacetat veid inn og tilsatt. Løsning B ble laget ved å tilsette 2000 µl maursyre til 2,00 L metanol av UHPLC-MS kvalitet, som deretter tilsettes 0,308 gram ammoniumacetat. Dette gir følgende konsentrasjoner: - A: vann med 2,0 mmol/l ammoniumacetat og 0,1 v/v % maursyre - B: metanol med 2,0 mmol/l ammoniumacetat og 0,1 v/v % maursyre 29

42 3.2.2 Stamløsninger og arbeidsløsninger Ved små mengder er det ikke praktisk mulig å veie inn tørrstoff, og det ble da valgt å kjøpe nøyaktig mengde innveid stoff. Stamløsningene ble deretter tilberedt i originalglassene med tørrstoff. Tabell 3 viser en oversikt over tillaging av stamløsninger. Stamløsningene ble etter fremstilling oppbevart ved 70 C. Tabell 3. Tillaging av stamløsninger Substans Konsentrasjon Mengde tørrstoff Type løsemiddel Sluttvolum Prednisolon 1130 mg/l 11,3 mg Metanol 10 ml Prednison 1080 mg/l 10,8 mg Metanol 10 ml Kortisol 1000 mg/l Innkjøpt løsning Metanol 1 ml Kortison 100 mg/l Innkjøpt løsning Metanol 1 ml Metylprednisolon 1000 mg/l 10,0 mg Metanol 10 ml Metylprednison 1019,1 mg/l 25,5 mg Metanol 25 ml D2-kortison 430 mg/l Ferdig tillaget Metanol 1 ml D4-metylprednisolon 100 mg/l Ferdig tillaget Metanol 1 ml D4-kortisol 100 mg/l Ferdig tillaget Metanol 1 ml D4-prednison 1000 mg/l 1,0 mg Metanol 1 ml D6-metylprednisolon 1000 mg/l 1,0 mg Metanol 1 ml D6-prednisolon 2000 mg/l 10 mg Metanol 5 ml D8-Prednisolon 100 mg/l 1,0 mg Metanol 10 ml D8-Prednison 50 mg/l 0,25 mg Metanol 5 ml Alle forbindelser under 10 mg er kjøpt ferdig veid inn. Kortisol og kortison er kjøpt som løsninger. D2-kortisol D4-metylprednisolon og D4-kortisol var ferdig tillaget fra tidligere. 30

43 Arbeidsløsninger ble fortynnet i metanol med utgangspunkt i stamløsningene. Tabell 4 gir en oversikt over hvordan de aktuelle arbeidsløsningene ble tillaget. Tabell 4. Tillaging av arbeidsløsninger Substans Sluttkonsentrasjon Uttaksvolum Type Sluttvolum stamløsning løsemiddel Prednisolon 49,7 mg/l 44 μl sfbs 1 ml Prednison 49,7 mg/l 46 μl sfbs 1 ml Kortisol 50,0 mg/l 50 µl sfbs 1 ml Kortison 5,0 mg/l 150 µl sfbs 3 ml Metylprednisolon (mellomløsning) 305,7 mg/l 306 µl Metanol 1 ml Metylprednisolon 25,1 mg/l 82* µl sfbs 1 ml Metylprednison 49,9 mg/l 49 µl sfbs 1 ml D2-kortison 22,0 mg/l 100 µl Metanol 2 ml D4-metylprednisolon 100,0 mg/l 1000 µl Metanol 1 ml D4-kortisol 20,0 mg/l 100 µl Metanol 0,5 ml D4-prednison 10,0 mg/l 20 µl Metanol 2 ml D6-metylprednisolon 0,071 mg/l 36 µl Metanol 5 ml D6-prednisolon 20 mg/l 20 µl Metanol 2 ml D8-Prednisolon 0,28 mg/l 14 µl Metanol 5 ml D8-Prednison 0,29 mg/l 29 µl Metanol 5 ml *Uttak fra mellomløsning Fellingsreagens Ulike sammensetninger av fellingsreagenser ble testet under utviklingen, både med hensyn til løsemiddelinnhold og type internstandarder. Det endelige fellingsreagenset bestod av metanol (HPLC kvalitet) og sinksulfat i et 2:1 forhold (v/v) inneholdende internstandarder. Arbeidsløsning med internstandarder ble tilsatt fellingsreagenset. Ved tillaging av 50 ml fellingsreagens ble det tilsatt 1000 µl internstandard-arbeidsløsning. Sluttkonsentrasjon av internstandardene var følgende: D8-prednisolon 28 µg/l, D8-prednison 29 µg/l og D6- metylprednisolon 7,1 μ/l. 31

44 3.2.4 Kalibratorer og kontroller Måleområdet ble tilpasset til forventede konsentrasjonsnivåer i predose-prøver hos transplanterte. Dette var basert på publikasjoner og uttesting i et begrenset antall kliniske prøver. Istedenfor blank human plasma ble det benyttet strippet kalveserum (sfbs) til tillaging av kalibratorer og kontroller. Dette serumet er kullbehandlet for å fjerne endogent kortisol og kortison. Strippingen vil også fjerne andre lipofile stoffer fra serumet. Kalibratorer og kontroller ble tillaget i sfbs som vist i tabell 5. Høyeste kalibrator eller kontroll ble videre fortynnet 1:1 i sfbs. De benyttede sluttkonsentrasjonene er oppgitt i tabell 6. Tabell 5. Tillaging av høyeste kalibrator (eller kontroll) Analytt Sluttkonsentrasjon Uttaksvolum Uttaksvolum Sluttvolum sfbs (µg/l) Stamløsning (µl) Arbeidsløsning (µl) (ml) Prednisolon ,00 ml Prednison 74,5 9 6,00 ml Kortisol ,00 ml Kortison ,00 ml Metylprednisolon ,00 ml Metylprednison ,00 ml Tabell 6. Konsentrasjoner i kalibratorer og kontroller Navn Prednisolon Prednison Kortisol Kortison Metylprednisolon Metylprednison Kalibrator 1 0,62 0,15 1,48 0,39 0,75 0,50 Kalibrator 2 1,23 0,29 2,96 0,78 1,50 1,01 Kalibrator 3 2,46 0,58 5,92 1,56 3,00 2,02 Kalibrator 4 4,92 1,16 11,85 3,13 6,01 4,03 Kalibrator 5 9,84 2,33 23,7 6,25 12,0 8,06 Kalibrator 6 19,7 4,66 47,4 12,5 24,0 16,1 Kalibrator 7 39,4 9,32 94,8 25,0 48,0 32,3 Kalibrator 8 78,7 18,6 189,6 50,0 96,1 64,5 Kalibrator , Kalibrator , Kontroll 1 0,61 0,14 1,46 0,39 0,75 0,49 Kontroll 2 1,22 0,28 2,93 0,78 1,50 0,98 Kontroll 3 9,77 2,22 23,5 6,25 12,0 7,80 Kontroll , Kontroll , Konsentrasjoner i µg/l 32

45 3.3 LC-MS/MS metode for glukokortikoider Grunnlaget for kromatografiske og massespektrometriske betingelser ble utviklet i forkant av denne mastergradsoppgaven. Dette inkluderte testing av ulike kolonnetyper og mobilfasegradienter. Anders M. Andersen ved Seksjon for klinisk farmakologi Rikshospitalet utførte denne delen av metodeutviklingen. I denne mastergradsoppgaven skulle det fokuseres på prøveopparbeidelse og tilpasning av UHPLC-MS/MS-metoden. Enkelte metodebetingelser var helt eller delvis låste på grunn av at analyseinstrumentene brukes til rutineanalyser, og det ville være for tidkrevende å gjøre om på instrumentoppsettet avhengig av analysemetode. Det var derfor en forutsetning at samme mobilfaser, vaskeløsninger og ioniseringsteknikk (ESI) ble benyttet som i rutinesammenheng. Videre var det ønskelig å benytte en kolonnetype som allerede var i bruk på instrumentene. Formatet for prøveopparbeidelse skulle egne seg for fremtidig automatisering på laboratoriets pipetteringsrobot, noe som la føringer for type 96 brønners plate og anvendte volumer. De endelige metodebetingelsene presenteres under kapittel 3.3 mens metodeutviklingen i masteroppgaven presenteres under Prøveopparbeidelse Proteinfellingen ble utført i 96-brønners plate (dype brønner 2 ml). Hundreogtjuefem µl serum eller plasma ble pipettert til brønn og 375 µl fellingsreagens ble tilsatt. Blank, kalibratorer, kontroller og prøver ble behandlet på samme måte. Fellingsreagenset inneholdt metanol:sinksulfat i vann (0,1 mol/l) i forholdet 2:1 og internstandardene D8-prednisolon, D8-prednison og D6-metylprednisolon. Platen ble forseglet med plastfilm og satt på ristemaskin i 2 minutter ved RPM. Deretter ble platen sentrifugert 10 minutter ved 2000 g og 4 C, og så overført til analyseinstrumentets autosampler Kromatografi Injeksjonsnålen var programmert til å suge opp supernatant ca. 5 mm over pellet i bunn av brønn. Injeksjonsvolumet ble satt til 20 µl. Nålen ble vasket sekvensielt mellom hver 33

46 injeksjon. Vaskeløsning 1 består av ACN:metanol:isopropanol i forholdet 50:25:25 og vaskeløsning 2 består av vann:acn 95:5. Mobilfase A og mobilfase B ble blandet i en gradient, se figur 7. Gradienten ble bestemt ut ifra hva som ga tilfredsstillende separasjon og toppfasong i kromatogrammene under metodeutvikling. Mobilfasehastigheten var 0,500 ml/min. Ved start utgjorde mobilfase B 45 %. Fra 0,33 min til 2,50 min økes mobilfase B lineært til 60 %. Ved 2,50 min økes mobilfase B umiddelbart til 99 %, og ved tid 3,00 min reduseres mobilfase B umiddelbart til 45 %. Total kromatografitid per injeksjon var 3,33 minutter. Analyseinstrumentet har to parallelle injeksjonsporter og to parallelle LC-pumper/kanaler som er koplet mot samme massespektrometer. Dette muliggjør vekselvis injeksjon og tidsmessig overlappende kromatografi i de to kanalene, noe som styres ved hjelp av såkalt multiplex-funksjonalitet i programvaren. Ved å benytte dette prinsippet ble effektiv analysetid per prøve ca. 1,75 min for denne analysemetoden. Kolonnen var plassert i en kolonnevarmer satt til 50 ºC. Valgt gradient er vist i figur 7: Figur 7. Mobilfasegradient. Ved oppstart er mobilfase B 45 %. Fra tid 0,33 til tid 2,50 min økes mobilfase B lineært til 60 %. Ved 2,50 min økes mobilfase B umiddelbart til 99 %, før den ved tid 3,0 umiddelbart reduseres til 45 %. Mobilfase B: metanol tilsatt 2,0 mmol/l ammoniumacetat og 0,1 v/v % maursyre. Mobilfase A: vann tilsatt 2,0 mmol/l ammoniumacetat og 0,1 v/v % maursyre 34

47 3.3.3 Massespektrometri Metodens generelle betingelser Ioniseringsteknikken som er valgt er elektrospray (ESI) i positivt modus. Massespektrometerets generelle metodebetingelser er oppført i tabell 7. Tabell 7. Massespektrometerets generelle innstillinger Ionekilde ESI Kapillærspenning positiv modus 3400 Sheath Gas (Arb) 30 Aux Gas (Arb) 5 Sweep Gas (Arb) 4 Ion Transfer Tube Temp ( C) 270 Vaporizer Temp ( C) 440 Dwell Time (ms) 30 Q1 Resolution (FWHM) 0,7 Q3 Resolution (FWHM) 0,7 CID Gas (mtorr) 1,5 Stoffspesifikke betingelser Det ble valgt å bruke deuteriummerkede internstandarder hvor ett eller flere hydrogenatomer er byttet ut med deuterium. Deuterium er én masseenhet tyngre enn hydrogen. På bakgrunn av hva som er kommersielt tilgjengelig samt utprøving ble D6-metylprednisolon, D8-prednison og D8-prednisolon valgt som internstandarder. Analyttenes tilhørende internstandarder er oppført i tabell 8. 35

48 Tabell 8. Analytter og tilhørende internstandarder Analytt Internstandard Prednisolon D8-prednisolon Prednison D8-prednison Kortisol D8-prednisolon Kortison D8-prednison Metylprednisolon D6-metylprednisolon Metylprednison D6-metylprednisolon Stoffenes masseoverganger (m/z) og kollisjonsenergi er oppsummert i tabell 9: Tabell 9. Stoffenes fragmentering og kollisjonsenergi Analytt Moderion Produktion Kollisjonsenergi (V) RF Linse (V) Prednisolon 361,3 147, Prednison 359,3 147, Kortisol , Kortison 361,29 163, Metylprednisolon 375,3 161, Metylprednison 373, , D8-Prednisolon 369,29 150, D8-Prednison 367,27 150, D6-Metylprednisolon 381,3 163, Programvare og databehandling Analyseinstrumentets programvare Tracefinder ble brukt til å utføre analyser og bearbeide signalene (kromatogrammene), inkludert justering av kalibreringskurve (regresjonstype og vekting). En innebygd algoritme ble brukt til å glatte ut de kromatografiske toppene (smoothing), og integrasjonsparametere ble tilpasset hvert enkelt stoff (retensjonstid, toppbredde). Programvaren Xcalibur ble brukt innledningsvis til vurdering av signaler/topper. 36

49 Aria ble brukt til å kontrollere LC-betingelser i forkant av analyse (kondisjonering av systemet). 3.4 Metodeutvikling Prøveopparbeidelse Det finnes allerede flere publiserte metoder for å analysere glukokortikoider i plasma, men disse har generelt omfattende prøveopparbeidelse som inkluderer ekstraksjon (27-30). En forutsetning for den nye metoden var at den skulle være enkel, ressursbesparende og rask å utføre. I denne sammenheng var det en målsetning å få til en prøveopparbeidelse som omfattet kun proteinfelling (ikke ekstraksjon eller inndamping). Det var også ønskelig at metodeoppsettet skulle designes slik at den kunne automatiseres på pipetteringsrobot dersom det skulle bli aktuelt senere. Alle prøvene ble preparert i 96-brønnsplate (2 ml DWP) med ristingvortex i 2 minutter ved 1400 RPM og sentrifugering i 10 minutter ved 2000 G og 4 ºC. I forbindelse med utvikling av prøveopparbeidelse ble både ulike fellingsreagens og injeksjonsvolum testet. Prøvevolum Prøvevolumet fastsettes ut ifra hva som er praktisk å pipettere med tilstrekkelig presisjon, hva som er tilgjengelig av aktuelt klinisk prøvemateriale, og hva som er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig signalstyrke. Prøvevolumer i området 50 µl til 125 µl ble undersøkt, der sluttvolumet var 500 µl etter tilsetning av fellingsreagens. Sammensetning av fellingsreagens Innledningsvis ble det gjort visuell inspeksjon av fellingsegenskaper der plasma ble tilsatt fellingsreagens med ulike mengder metanol. Femti μl plasma fra to ulike pasienter ble tilsatt 450 μl fellingsreagens. Prøvene ble preparert i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Det ble testet følgende metanolinnhold i fellingsreagenset: 0, 50, 75, 90 og 100 %. Resterende mengde var ACN. Prøvene ble observert umiddelbart etter tilsetning av fellingsreagens. Deretter ble de stående noen minutter før de ble vortexet i 15 sekunder og vurdert igjen. Til slutt ble prøvene sentrifugert i 2 minutter ved 4980 RPM, 2350 g og 4 ºC før de igjen ble vurdert. 37

50 Analytter ble tilsatt i sfbs og humant serum i følgende konsentrasjoner: prednisolon, prednison, kortisol, kortison: 250 µg/l og metylprednisolon 500 µg/l. Metanol, metanol:acn 3:1 og metanol:sinksulfat i vann (0,1 mol/l) 2:1 ble undersøkt. Både kvalitativ visuell vurdering av proteinfelling, bunnfallets fasthet og signalstyrke ble vurdert. Injeksjonsvolum Når man anvender en enkel prøveopparbeidelse som proteinfelling alene, vil sammensetningen i injeksjonsløsningen ofte ikke være optimal med hensyn til de kromatografiske betingelsene. Dette legger ofte begrensninger på injeksjonsvolumet. Strategi for å oppnå lavest mulig målegrenser for glukokortikoidene var likevel å bruke et forholdsvis stort injeksjonsvolum. Analytter ble tilsatt i sfbs og humant serum i konsentrasjonene 250 µg/l for prednisolon, prednison, kortisol og kortison. Metylprednisolon ble tilsatt i konsentrasjonen 500 µg/l. Proteinfelling ble utført ved hjelp av metanol, metanol:acn 3:1 og metanol:sinksulfat i vann (0,1 mol/l) 2:1 Ulike blandingsforhold mellom prøve og fellingsreagens ble også testet. Injeksjonsvolumer i området 5 25 µl ble undersøkt (der 25 µl var maksimalt mulig injeksjonsvolum slik instrumentet var konfigurert). Toppfasonger ble vurdert kvalitativt ved inspeksjon av kromatogrammer. Vurdering av signalstyrke ble basert på topphøyder og areal. Internstandarder-interferenser Det ble i første omgang tatt utgangspunkt i de isotopmerkede internstandardene som hadde blitt benyttet ved tidligere LC-MS/MS-metode i laboratoriet (27, 31): D2-kortison, D4- metylprednisolon og D6-prednisolon. Det var imidlertid enkelte problemstillinger knyttet til disse. D2-kortison har kun to masseenheters forskjell fra endogen kortison, noe som kan medføre overlapp mellom analytt og internstandard. D4-metylprednisolon viste seg å være meget vanskelig å anskaffe siden produktet var gått ut av sortimentet til opprinnelig leverandør. Signalstyrken til D6-prednisolon i lagrede metanolløsninger avtok uforventet raskt, noe som indikerte utilstrekkelig stabilitet. Med bakgrunn i dette ble alternative internstandarder forsøkt: D4-kortisol, D4-prednison, D6-metylprednisolon, D8-prednisolon, D8-prednison. D2-kortison, D4-metylprednisolon og D6-prednisolon ble også testet. 38

51 Det er viktig at en internstandard gir minimale signaler i analyttenes kromatogrammer. Samtidig bør ikke internstandardene interferere med hverandre, og analyttene bør heller ikke gi betydelige signaler i internstandardenes kromatogrammer. Denne type interferenser ble derfor grundig undersøkt ved separate injeksjoner av hvert stoff og dannet grunnlag for valg av internstandarder. Stoff-spesifikke betingelser for de nye internstandardene ble først stilt inn (tunet) i massespektrometeret. Deretter ble det tillaget injeksjonsløsninger som ble analysert ved standard metodebetingelser. D2-kortison, D4-kortisol, D4-metylprednisolon, D4-prednison, og D6-prednisolon ble testet med 375 µl fellingsreagens metanol:sinksulfat i vann 2:1 og 115 µl vann i følgende konsentrasjoner: 25,8 µg/l D2-kortison, 24,0 μg/l D4-kortisol, 120 µg/l D4- metylprednisolon, 25 μg/l D4-prednison, og 24 μg/l D6-prednisolon. D8-prednisolon og D8-prednison ble testet i metanol:vann 50:50 tilsatt internstadarder i konsentrasjoner tilsvarende 0,5 mg/l D8-prednisolon og 0,5 mg/l D8-prednison. Endring av kromatografi Ved uttesting av internstandarder ble det oppdaget en interferens mellom kortison og D6- metylprednisolon. Dette gjorde at det var behov for å forbedre metodens kromatografiske separasjon. Mobilfasegradienten ble justert inntil tilstrekkelig separasjon ble oppnådd. 3.5 Validering Validering av analysemetoden ble gjort i henhold til EMA sin retningslinje: Guideline on bioanalytical method validation (20). Valideringen ble ikke ferdigstilt i denne mastergradsoppgaven. Valideringen skal utføres i den matriksen som prøvene vil foreligge i ved senere analyser, som her er plasma. I valideringen ble strippet kalveserum benyttet som substitutt. I noen av forsøkene er det valgt å analysere alle prøver på begge LC- kanaler for å kartlegge om det utgjør noe forskjell. 39

52 3.5.1 Selektivitet Selektivitet for analytter og internstandarder ble undersøkt ved å analysere plasma fra pasienter som ikke brukte prednisolon eller metylprednisolon. Selektivitet for kortisol og kortison ble ikke undersøkt siden dette er endogene stoffer som vil være til stede i de kliniske prøvene. Hensikten var å vise at det ikke detekteres signalrespons for analyttene eller internstandardene i de aktuelle pasientprøvene. Plasma fra seks individer og LLOQ ble analysert under valideringen. I dette forsøket ble ikke internstandard tatt med. Fellingsreagenset besto derfor av metanol og 0,1 mol/l sinksulfat i et 2:1 forhold. Kvalitetsmål for analytter:potensielle interfererende topper skulle ha toppareal under 20 % av LLOQ. Kvalitetsmål for internstandarder: Potensielle interfererende topper skulle ha toppareal under 5 % av regulært internstandardsignal Overdragning Under validering ble overdragning evaluert ved å injisere en prøve med høy konsentrasjon av analytten etterfulgt av en blank prøve bestående av kun sfbs og fellingsreagens uten intern standard. Det ble valgt å bruke prøver med konsentrasjon tilsvarende øverste kvantifiseringsgrense, i samsvar med EMAs retningslinjer. ULOQ-prøvene ble i forsøket tilsatt intern standard. Retningslinjene sier ikke noe om hvor mange ganger forsøket skal gjentas. Det ble valgt å analysere fem sekvenser (paralleller) på hver LC-kanal (dvs. hver injeksjonsport) hvor hver sekvens bestod av følgende: laveste kvantifiseringsgrense (laveste kalibrator), øverste kvantifiseringsgrense (øverste kalibrator) og to blanke prøver. Innledende tester indikerte at det var ulik overdragning på de to kanalene, derfor ble det valgt å gjøre forsøket på begge kanaler for å kartlegge mulige problemer med overdragning. Overdragning ble undersøkt i blank-prøven som kom umiddelbart etter ULOQ. Den eventuelle signalresponsen som måtte være i overdragningsprøven ble sammenlignet med signalresponsen til LLOQ som ble analysert i samme serie (toppareal vs. toppareal). Tre blanke prøver ble analysert på starten av batchen for å verifisere at det ikke var signalrespons i systemet. Vi observerte at strippet FBS ga et lite målbart signal for kortisol. Ved beregning av overdragning trekkes dette fra ved å beregne gjennomsnittsverdien av topparealet i de tre 40

53 første blank-prøvene (sfbs), og trekke dette fra topparealet for LLOQ og overdragningsprøvene. Gjennomsnittsverdien for de tre første blank-prøvene regnes da som endogen verdi. Relativ overdragning = * 100 % Kalibreringskurve Det lages en kalibreringskurve for hver analytt og for hver batch som analyseres. sfbs ble brukt som matriks i kalibratorene. Det ble valgt å lage kalibreringskurver med 10 konsentrasjonsnivåer siden måleområdene var forholdsvis vide, samt at det ville være mulig å ekskludere de laveste kalibratorene dersom det skulle være behov for å justere LLOQ. Laveste anvendte kalibrator bør være LLOQ og øverste bør være ULOQ. Konsentrasjonsområdene som er valgt er: Prednisolon: 0, µg/l Prednison: 0,15-74,5 µg/l Kortisol: 1, µg/l Kortison: 0, µg/l Metylprednisolon: 0, µg/l Metylprednison: 0, µg/l I tillegg analyseres en blank prøve og en nullprøve: blank prøve inneholder sfbs tilsatt fellingsreagens uten analytt eller intern standard, og nullprøve består av sfbs tilsatt intern standard. Det brukes tre ulike internstandarder, alle er deuteriummerkede glukokortikoider: D6-metylprednisolon for metylprednisolon og prednison, D8-prednisolon for prednisolon og kortisol, og D8-prednison for prednison og kortison. Konsentrasjonen av internstandard er lik i alle kalibratorene, mens konsentrasjonen til kalibratorene er økende. Kurven fremstilles ved å plotte areal kalibrator/ areal intern standard mot konsentrasjon. Standardkurvene vurderes med tanke på stigningstall, skjæringspunkt og korrelasjon. Kvalitetsmål for kalibreringskurven er at tilbakekalkulert konsentrasjon av kalibratorene skal være maksimum +/- 15 % av nominelle verdier. Ved nivået som tilsvarer LLOQ tillates avvik 41

54 på +/- 20 % av nominell verdi. Analyttene vurderes uavhengig av hverandre. Flere serier hvor kalibreringskurver inngår bør undersøkes før validering av kalibreringskurver anses som endelig ferdigstilt Nøyaktighet Nøyaktighet ble validert for å vise at metoden måler riktig verdi, og for å kartlegge eventuelt avvik fra sann verdi. Det gjøres for å forsikre at det ikke er systematiske feil med metoden og at metoden gir riktige målinger gjentatte ganger. Nøyaktighet ble bestemt i prøver tilsatt kjent mengde analytt: kvalitetskontroller. Disse kontroll-prøvene ble analyserert mot en kalibreringskurve og målt verdi sammenlignes med nominell verdi. Nøyaktighet rapporteres som prosent av nominell verdi. Nøyaktighet skal ifølge EMA undersøkes for både innen-serie analyser og mellom-serie analyser. Validering av innen-serie-nøyaktighet ble utført ved å analysere seks paralleller ved fem konsentrasjonsnivåer i én og samme analysebatch. Kalibrator 1-10 ble analysert på starten av batchen og utgjør kalibreringskurven. Konsentrasjon til kalibratorer og kontrollprøver er listet opp i tabell 6 tidligere i kapittelet og dekker kalibreringskurven. I dette forsøket ble internstandarder tilsatt fellingsreagenset. Kvalitetsmål: Gjennomsnittlig avvik fra nominell verdi skal ikke være større enn +/- 15 %. Ved LLOQ tillates gjennomsnittlig avvik +/- 20 %. Validering av nøyaktighet mellom serier er foreløpig ikke utført Presisjon Presisjon ble validert for å vise spredning i gjentatte analyseresultater. Presisjon oppgis som variasjonskoeffisienten (VK) og demonstreres for LLOQ og kontroll-prøvene 1-5. Presisjon ble validert med samme forsøksoppsett som oppgitt under Nøyaktighet. Variasjonskoeffisienten finnes ved å dividere standardavvik på gjennomsnitt og multiplisere med 100 %. Da får man et uttrykk for spredningen i forhold til gjennomsnittet. Lav VK indikerer god presisjon. Validering av innen-serie-presisjon: Seks prøver ved fem konsentrasjonsnivåer ble analysert i én og samme kjøring. 42

55 3.5.6 Nedre kvantifiseringsgrense Signal/støy ved nedre kvantifiseringsgrense (LLOQ) skal ha forholdstall som er minst fem. Kvalitetsmål for nedre kvantifiseringsgrense (LLOQ) er at variasjonskoeffisient skal være maksimum 20 %, og avvik fra nominell konsentrasjon skal være maksimum +/- 20 %. Dette ble foreløpig validert samtidig med nøyaktighet og presisjon innen serie og mellom serier. Valideringen må senere utvides med mellom-serier data Ikke-validerte punkter Validering av nedre kvantifiseringsgrense, nøyaktighet og presisjon, samt kalibreringskurver må ferdigstilles ved mellom-serier forsøksoppsett. Fortynningsintegritet vil sannsynligvis ikke være aktuelt å validere siden testede pasientprøver ligger innenfor kalibreringskurven med god margin. Matrikseffekter må valideres før metoden tas i bruk til analyse av studieprøver. Stabilitet er ikke validert. 43

56 4 Resultater 4.1 Prøveopparbeidelse Prøvevolum For alle de testede analyttene ble arealet av signalresponsen i humant serum doblet ved å øke prøvevolumet fra 50 til 100 µl (gjennomsnittlig økning 112 %). Topparealet økte ytterligere ved å øke prøvevolumet til 125 µl (gjennomsnittlig økning 19 %). Figur 8 viser signalrespons for hvert stoff ved de ulike prøvevolumene. Figur 8. Signalrespons ved økende prøvevolum. Analyttene ble tilsatt humant serum i konsentrasjonene 250 µg/l for prednisolon, prednison, kortisol og kortison, og 500 µg/l for metylprednisolon. Endogent kortisol og kortison ble subtrahert. Dataene er basert på gjennomsnittsverdier av to målereplikater. Sammensetning av fellingsreagens Fra forsøket med visuell inspeksjon ble det ikke observert synlige forskjeller i rørene ved metanol:acn 90:10 og 100:0 som fellingsreagens. I disse to tilfellene var utfellingene meget finpartikulære. Ved metanol:acn 75:25 ble det observert småpartikulær utfelling mens det ved 50:50 og 0:100 ble observert aggregatdannelse. Etter 15 sekunder vortex ble det gjort følgende observasjoner: 44

57 Metanol:ACN 100:0 og 90:10 ga en homogen suspensjon som sedimenterte langsomt. Metanol:ACN 75:25 ga lignende observasjoner som for 90 og 100 % metanol, med unntak av en av prøvene som hadde aggregatdannelse på siden av røret som ikke lot seg virvle opp. Metanol:ACN 50:50 ga en ikke-homogen blanding. Det ble observert større partikler eller aggregater i begge rørene. Metanol:ACN 0:100 ga en klar løsning med store klumper. Etter 10 minutter henstand ble prøvene observert igjen. Observasjonene er gjort før sentrifugering: Metanol:ACN 100:0 og 90:10 ga en uklar supernatant, men prøvene var noe sedimentert. Dette er før sentrifugering. Metanol:ACN 75:25 ga omtrent like mye sedimentasjon som ved 90 og 100 % metanol men med klarere supernatant. Metanol:ACN 50:50 ga omtrent like klar supernatant som for 75 % metanol, men med noe mer sedimentasjon. Metanol:ACN 0:100 ga klar supernatant og klumper i bunnen av vialene. Etter 2 minutter sentrifugering var alle prøvene sedimentert og de lot seg riste opp igjen. Fra forsøkene med ulike fellingsalternativer ble det fortsatt observert dårlige toppfasonger for fellingsreagenset med kun metanol og fellingsreagenset med metanol:acn. Sammenligninger av topphøyder og areal er illustrert i figur 9 og 10 (10 µl injeksjonsvolum). Det kommer frem at toppene var betydelig høyere når 0,1 mol/l sinksulfat var tilsatt fellingsreagensene, samtidig som at arealene var forholdsvis like. Bruk av sinksulfat medførte altså smalere topper, og i figur 11 ser man at sinksulfat også ga mer symmetriske topper. 45

58 Figur 9. Signalrespons for ulike sammensetninger av fellingsreagens. Topphøyde er brukt som mål på signalrespons. Analyttene ble tilsatt sfbs i følgende konsentrasjoner: prednisolon, prednison, kortisol og kortison 250 µg/l. Metylprednisolon: 500 µg/l. Dataene er basert på gjennomsnittsverdier fra tre målereplikater. Figur 10. Signalrespons for ulike sammensetninger av fellingsreagens. Toppareal er brukt 46 som mål på signalrespons. Analyttene ble tilsatt sfbs i følgende konsentrasjoner: prednisolon, prednison, kortisol og kortison 250 µg/l. Metylprednisolon: 500 µg/l. Dataene er basert på gjennomsnittsverdier av tre målereplikater.

59 µl serum µl MeOH 100 µl serum µl MeOH:ACN 3:1 Figur 11. Toppfasong for prednisolon ved ulike prøvevolum, fellingsreagens og injeksjonsvolum. Ved bruk av metanol og metanol:acn som fellingsreagens blir toppfasongene bredere og unøyaktige ved økende injeksjonsvolum. Ved bruk av metanol:sinksulfat 0,1 mol/l i vann oppnås ønskelig fasong på toppene også ved høyere injeksjonsvolum µl serum µl MeOH:0,1 M ZnSO4 2:1 125 µl serum µl MeOH:0,1 M ZnSO4 2:1 47