Individualisering av takrolimusbehandling hos nyretransplanterte pasienter

Transkript

1 Individualisering av takrolimusbehandling hos nyretransplanterte pasienter P-glykoprotein (ABCB1) genotype og genuttrykk Ilona Magdalena Jaszcz Masteroppgave i farmakologi Farmasøytisk institutt, Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO Avdeling for medisinsk biokjemi og Avdeling for farmakologi Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet Juni 2015 I

2 II

3 Masteroppgave i farmakologi for graden master i farmasi Individualisering av takrolimusbehandling hos nyretransplanterte pasienter P-glykoprotein (ABCB1) genotype og genuttrykk Ilona Magdalena Jaszcz Farmasøytisk institutt, Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO og Avdeling for medisinsk biokjemi og Avdeling for farmakologi Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet Veiledere: Sara Bremer, Avd. for medisinsk biokjemi, OUS Stein Bergan, Avd. for farmakologi, Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet og Farmasøytisk institutt, Universistet i Oslo III

4 Ilona Magdalena Jaszcz 2015 Individualisering av takrolimusbehandling hos nyretransplanterte pasienter - P-glykoprotein (ABCB1) genotype og genuttrykk Ilona Magdalena Jaszcz Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo IV

5 Sammendrag Innledning: Standard immundempende regime ved nyretransplantasjon (Tx) består av takrolimus, mykofenolat, glukokortikoider og induksjonsbehandling med basiliximab. Det er store forskjeller i dosebehov og effekt av legemidlene mellom pasienter. Doseringen av takrolimus styres etter konsentrasjonsmålinger i fullblod. Fullblodkonsentrasjoner reflekterer imidlertid ikke nødvendigvis den intracellulære konsentrasjonen og effekten i lymfocytter, og takrolimus assosieres fortsatt med nyretoksisitet samt bivirkninger som bidrar til økt risiko for infeksjoner, kreft og kardiovaskulære hendelser. Det er derfor ønskelig å finne alternative parametere som kan bidra til ytterligere individualisering av legemiddelbehandlingen for å forbedre langtidsresultatene (>1 år) etter transplantasjon. Hensikt: Takrolimus pumpes ut av celler via efflukstransportøren P-glykoprotein (ABCB1). ABCB1-uttrykket i lymfocytter og polymorfisme av ABCB1-genet kan dermed ha betydning for takrolimuskonsentrasjonen på virkestedet og immundempende effekten av legemidlet. Formålet med prosjektet var å undersøke muligheten for ytterligere optimalisering av takrolimusbehandling ved å måle ABCB1-genuttrykk i blodceller fra nyretransplanterte pasienter og se på mulige sammenhenger med takrolimuskinetikk, -dynamikk, genetikk og kliniske parametre. Metode: Studien inkluderte 29 nyretransplanterte pasienter med blodprøver før transplantasjon, samt før (t 0 ) og 1,5 timer etter (t 1,5 ) dosering av takrolimus ved ca. 1, 6 og 52 uker etter transplantasjonen. ABCB1-genuttrykk ble kvantifisert ved revers transkripsjon og sanntids-pcr på LightCycler 480 (Roche, Tyskland). Legemiddelkonsentrasjoner, farmakodynamisk respons (cytokinhemming) og genetikk (dypsekvensering) har blitt analysert i forbindelse med andre delprosjekter i samme studie. Pasientdata ble innhentet fra pasientjournaler, pasientplakater samt laboratoriedatasystemet ved OUS, Rikshospitalet. Resultater: Resultater av kvantitativt uttrykk for 29 pasienter viser betydelig variasjon ( 9,5- fold) i ABCB1-nivå mellom pasientene. Dataene viser også at ABCB1-genuttrykket i fullblod (PAXgene-rør) endrer seg i perioden etter Tx og etter dosering av immunsuppresjonen. Reduksjonen ved t 0 og t 1,5 var kraftigst uke 1 med henholdsvis 30,6 % og 41,3 % lavere verdier enn før transplantasjon (median 0,93 versus t 0 :0,64 og t 1,5 :0,54, P<0,001). Mengden leukocytter i blod var signifikant høyere ved uke 1 og 6 enn før transplantasjon (P 1 <0,001; P 6 = 0,016), men vi kunne se en gradvis reduksjon mellom uke 1 og 6 (P = 0,045) og mellom 6 V

6 uker og 1 år (P = 0,001). Videre var det ingen signifikant korrelasjon mellom mengden leukocytter og kvantitativ ABCB1-genuttrykk over tid, men man så en tendens til invers sammenheng. Ved uke 6 ble det funnet høyere median genuttrykk enn den funnet ved uke 1 for begge prøvetakingstidspunktene, (t 0 : 0,72 versus 0,64; t1,5: 0,71 versus 0,54), men fortsatt signifikant lavere enn nivået før transplantasjonen (P C0 og C1,5 <0,001). Ved 1 år etter Tx så vi en økning i ABCB1 både før dose og 1,5 timer etter dose i forhold til uke 1. Fem pasienter med genotypen CYP3A5*1/*3 hadde 44 % lavere dosenormalisert C 0 av takrolimus, og 43 % lavere C 1,5 enn pasienter uten funksjonelt enzym, det vil si homozygote for CYP3A5*3/*3. Vi har dermed valgt å se på ABCB1-genvarianter i to pasientgrupper (med og uten CYP3A5*1- allel). ABCB1 sekvensvarianten c.1236t>c var assosiert med takrolimuskonsentrasjon i fullblod 1,5 timer etter dose ved 1 uke etter transplantasjon hos pasienter med begge CYP3A5- genvariantene (P = 0,031, n = 28) hvor pasienter med ABCB1 c.1236 C/C og C/T genotyper hadde 60 % lavere gjennomsnittlig C 1,5 sammenlignet med bærere av T/T genotype. Ni pasienter opplevde episoder med polyomavirus-viremi, hvorav syv på et tidspunkt nærmere uke 6 etter transplantasjon. Deres ABCB1-uttrykk før dose ved uke 6 var redusert til 65 % i forhold til pasienter uten polyomavirus-viremi. Tre av ni pasienter med polyomavirus-viremi hadde betydelig høyere mengde DNA-kopier/mL blod og deres median ABCB1-genuttrykk var signifikant lavere enn median uttrykk registrert for resten av populasjonen ved tre tidspunkt (6 uker t 1,5 : median 0,46 versus 0,71, P = 0,029, n = 29; 1 år t 0 : median 0,58 versus 0,92, P = 0,007, n = 28 og 1 år t 1,5 : median 0,41 versus 0,86, P = 0,037, n = 29). Konklusjon: Endringene i ABCB1-genuttrykk skyldes trolig endringer i cellepopulasjoner i fullblod eller regulering på transkripsjonsnivå. Pasienter med klinisk relevant polyomavirusviremi hadde lavere nivåer av ABCB1-genuttrykk enn de resterende pasientene. En mulig forklaring kan være at pasientene med lavt ABCB1-genuttrykk også hadde lavere nivåer P-gp transportprotein og ble eksponert for en høyere intracellulær takrolimuskonsentrasjon, noe som igjen kan øke risikoen for viremi. Det ble videre observert en mulig sammenheng mellom ABCB1 c.1236t>c variant og takrolimuskonsentrasjon der pasienter med T/T-genotype så ut til å ha høyere takrolimus C 1,5 sammenlignet med pasienter med C/T ellere C/C-genotyper. Funnene tyder på at analyser av ABCB1-genotyper og -genuttrykk kan bidra med nyttig informasjon for ytterligere individualisering av takrolimusbehandling hos transplanterte pasienter. Dette kan igjen bidra til å forbedre lantidsresultatene ved takrolimusbehandling etter transplantasjon. Den kliniske nytteverdien av ABCB1-analyser, både på gen- og proteinnivå, må imidlertid kartlegges nærmere i større, prospektive studier. VI

7 Forord Denne masteroppgaven ble utført ved Avdeling for medisinsk biokjemi, OUS, Rikshospitalet under veiledning av forsker Sara Bremer og professor Stein Bergan. Jeg vil rette en enorm takk til min hovedveileder, Sara. Det finnes ikke ord som beskriver din faglige dyktighet, engasjement og gode personlighet. Du har vært uhyre viktig for meg de siste månedene av farmasistudiet, både faglig og sosialt. Tusen takk for din tålmodighet, støtte under hele oppgaven og for at du har vært et eksempel for meg. Jeg ønsker deg alt det beste i fremtiden! Takk til min interne veileder, Stein for praktisk hjelp med studien, interessante innspill samt kollokvier underveis og fin tur til Beitostølen. Stor takk til Rolf Klaasen for utveksling av erfaringer, teknisk hjelp med oppgaven, din oppmuntring og faglige diskusjoner. Takk til Morten Skauby, Pål-Dag Line og Karsten Midtvedt ved Avdeling for transplantasjonsmedisin for hjelp med prøveanskaffelse til studien. Biopsier ble utført ved Avdeling for patologi ved Helge Scott. Takk til pasientene som stilte opp med blodprøver til studien. Videre vil jeg takke alle sammen på Gen. Deres humor, lån av instrumenter og fleksibilitet gjorde oppgaven min mulig. Tusen takk til gjengen på Farm for konsentrasjonsanalyser til studier. Tusen takk til gode venner og familie som jeg ikke hadde klart meg uten. Jeg er virkelig heldig som har dere. Sist, men ikke minst vil jeg også takke min kjære Tor Arne. Du har hatt uendelig tålmodighet og støttet meg ved alle livets grener. Det skal mye til for å være så empatisk og omtenksom som du har vært. Dette har vært et minnerikt år som gav meg mange gode erfaringer. Tusen takk for at jeg fikk avlagt oppgaven min nettopp her. Oslo, 3. juni 2015 Ilona Magdalena Jaszcz VII

8 VIII

9 Innholdsfortegnelse Sammendrag... V Forord... VII Forkortelser... XI 1 Innledning Organtransplantasjon Historisk tilbakeblikk Nyretransplantasjon Immunmediert organavstøtning Blodtypeuforlikelighet HLA-uforlikelighet Cellepopulasjoner i fullblod Aktivering av T-lymfocytter Avstøtningsreaksjoner Immunsuppressiv behandling Glukokortikoider Basiliksimab Antiproliferativa Kalsineurinhemmere Andre immundempende legemidler Infeksjoner forbundet med immunsuppressjon P-glykoprotein Struktur Substrater og funksjon Distribusjon og uttrykk Terapeutisk legemiddelmonitorering Farmakokinetisk monitorering av takrolimus Farmakodynamisk monitorering av takrolimus Farmakogenetiske aspekter ved takrolimusbehandling Problemstilling Materialer og metode Reagenser og utstyr IX

10 3.2 Pilotstudien MarkIt Kvantifisering av ABCB1-genekspresjon Isolering av RNA Revers transkripsjon Polymerasekjedereaksjon (PCR) Relativ kvantifisering av ABCB1-genekspresjon Takrolimuskonsentrasjoner Genotyping Sanntids PCR og smeltekurvanalyse Dypsekvensering Kliniske endepunkter og laboratorieprøver Statistiske metoder Resultater Pasientpopulasjon ABCB1- genuttrykk over tid Leukocytter Farmakogenetikk med relevans for takrolimus Polyomavirus-viremi Analyse av andre variabler Diskusjon ABCB1-genuttrykk i blodceller ABCB1-og CYP3A5-genotyper og takrolimuseksponering ABCB1-genuttrykk og polyomavirus-viremi Veien videre Konklusjon Litteraturliste Vedlegg X

11 Forkortelser ABCB1 ATP-avhengig kassett-transportør ALAS1 5-aminolevulinatsyntase 1 APC ATG ATP AUC BKV BPAR B2M1 C 0 C 1,5 Ca 2+ cdna CMV CNI Cp CsA CYP EBV FKBP12 FK 506 FRET GFR HLA Antigenpresenterende celler Antitymocyttglobulin Adenosintrifosfat Area Under Curve BK-virus Biopsy proven acute rejection Beta-2-mikroglobulin Fullblodkonsentrasjon før dose Fullblodkonsentrasjon 1,5 timer etter dose Kalsium Komplementært DNA Cytomegalovirus Kalsineurinhemmere Crossing Point Ciklospori A Cytokrom P450 Epstein-Barr-virus FK506-bindende protein Takrolimus Fluorescens resonans energioverføring Glomerulær filtrasjonsrate Humant leukocyttantigen XI

12 IFN-γ IL-2 IL-2RA IMPDH IVIG JCV GK GM-CSF MDR1 MHC MMF MPA mtor NBD NFAT OUS PBMC PCR P-gp RPL13A SNP TCR TCD4+ TCD8+ TDM Interferon-gamma Interleukin-2 Inlerleukin -2 reseptor A Inosin 5`-monofosfat dehydrogenase Intravenøs immunoglobulin JC-virus Glukokortikoider Granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor Multidrug resistance gene Major histocompatibility complex Mykofenolat mofetil Mykofenolsyre Mechanistic target of rapamycin Nukleotid-bindende domene Nukleær faktor for aktivering av T-lymfocytter Oslo Universitetssykehus Perifere mononukleære blodceller Polymerasekjedereaksjon Permeabilitetsglykoprotein Ribosomal protein L13a Enkeltnukleotidpolymorfisme T-lymfocyttreseptor CD4+ T-lymfocytt CD8+ T-lymfocytt Terapeutisk legemiddelmonitorering XII

13 TMD TNF-α Tx Transmembran domene Tumor nekrose faktor alfa Transplantasjon XIII

14

15 1 Innledning 1.1 Organtransplantasjon Transplantasjon (Tx) er overføring av et organ, celler eller vev, et transplantat, fra et sted til et annet hos samme individ eller mellom individer. Organtransplantasjon kan være en livreddende behandling for pasienter med terminal organsvikt. De vanligste organene som transplanteres er nyre, lever, hjerte, lunge og bukspyttkjertel (figur 1). I tillegg til bruk av avdøde donorer kan nyre- og levertransplantasjon også utføres med organ fra levende giver. Det utføres også transplantasjon av insulinproduserende Langerhanske øyer, et behandlingstilbud aktuelt for pasienter med vanskelig regulerbar type 1-diabetes (1). I tillegg kan transplantasjon av hematopoietiske stamceller være et effektivt behandlingsalternativ ved maligne blodsykdommer (2). Alle organtransplantasjoner i Norge utføres i dag ved Oslo Universitetssykehus, Rikshospitalet, som siden 1983 har vært det nasjonale transplantasjonssenteret. I 2014 fikk 456 pasienter transplantert 509 nye organer i Norge (3). Nyretransplantasjoner utgjorde den høyeste andelen, med 188 transplantasjoner med organ fra avdød og 68 med organ fra levende donor (3). Figur 1 viser en oversikt over transplantasjonsvirksomheten i Norge i perioden Figur 1: Antall organtransplantasjoner i Norge utført i perioden , fordelt på organtype. Data hentet fra Årsrapport for organdonasjon og transplantasjon 1.januar 31. desember 2014, Oslo universitetssykehus, Rikshospitalet. 1

16 1.1.1 Historisk tilbakeblikk Sykdomstilstander forbundet med organsvikt kan gi vesentlig redusert livskvalitet og leveutsikter. I 1954 ble den første vellykkede nyretransplantasjonen utført i Boston, USA. Dette var en isotransplantasjon mellom genetisk identiske eneggede tvillinger. Dette Transplantasjonen var et gjennombrudd og viste for første gang at nyretransplantasjon kunne bli et klinisk behandlingstilbud ved terminal nyresvikt og ble verdsatt til en nobelpris i I Norge ble den første allogene nyretransplantasjonen gjennomført allerede i 1956 av Efskind og kolleger. Nyretransplantatet ble overført fra en ubeslektet, ABO-blodtypeuforlikelig donor til en mann med nyrebekkenkreft. Den immundempende behandlingen bestod av helkroppsbestråling og kortison, og pasienten overlevde 30 dager, noe som på denne tiden ble ansett som et lovende resultat (4). I flere tiår senere og fram til i dag, har organtransplantasjon vært et progressivt forskningsområde, noe som har bidratt til en betydelig forbedring av pasient- og graftoverlevelse (90 % graftoverlevelse) og færre akutte rejeksjonstilfeller (<10 %) i løpet av det første året etter transplantasjon (2). Antall transplantasjoner ble nærmest tredoblet etter at legemidlet ciklosporin A (CsA) ble innført som en del av den immunsuppressive behandlingen ved organtransplantasjon på begynnelsen av 1980-tallet. Utviklingen innen kirurgiske teknikker, immunologiske metoder og legemiddelbehandling har videre bidratt til at antall transplantasjoner økt jevnt (4) Nyretransplantasjon Resultatene etter de første organtransplantasjonene bar et sterkt preg av datidens mangelfulle immundempende behandling. I perioden etter 1956 og fram til 1964 ble det transplantert til sammen 6 nyrer på verdensbasis. Ingen av mottagere overlevde mer enn 40 dager unntatt den siste, som i motsetning til andre, fikk transplantert organ fra en avdød donor. Pasientens nyre var velfungerende i hele 3 år, før vedkommende fikk infeksjon og mistet nyren. Siden oppstarten av det norske transplantasjonsprogrammet i 1969 ble det gjennomført rundt nyretransplantasjoner framtil i dag (5). Omtrent 2/3 av de nyretransplanterte er menn (4). Kronisk nyresykdom utvikles i årevis og karakteriseres av gradvis forverret nyrefunksjon som følge av blant annet diabetes og hypertensjon (6). Flere studier har vist at overlevelse er generelt bedre etter nyretransplantasjon enn ved dialyse, og nyretransplantasjon er derfor ett godt behandlingsalternativ for de fleste pasienter 2

17 med terminal nyresvikt. Nyretransplantasjon med levende donor er assosiert med lavere komplikasjonsrisiko og bedre langtidsresultater og tilstrebes dersom mulig, særlig når mottaker og en potensiell giver er beslektet, men på grunn av den generelle organmangelen er det også vanlig å bruke nyrer fra avdøde donorer. 1.2 Immunmediert organavstøtning Immunsystemet er vår naturlige forsvarsmekanisme mot fremmede inntrengere, som bakterier, virus og sopp. Allo- og xenotransplantasjon innebærer genetiske forskjeller i både blod- og vevstype. Mottakerens immunforsvar vil dermed oppfatte organet som «fremmed» og sette i gang en immunologisk reaksjon som uten behandling vil føre til avstøtning, også kalt rejeksjon, og tap av organet Blodtypeuforlikelighet Blodtypen klassifiseres etter ABO-systemet, hvor A, B og O beskriver uttrykk av blodtypeantigen. Individer med blodtype A, B, AB og O uttrykker henholdsvis blodtypeantigen A, B, både A og B (AB) eller ingen av disse (O). A- og B- blodtypeantigenene er karbohydratkjeder som finnes i cellemembranen til blodplater, erytrocytter og endotelceller. Individer har antistoffer mot blodtypeantigener individet ikke uttrykker selv, dvs. personer med blodtype A har antistoffer mot antigen B, blodtype B har antistoffer mot blodtype A, mens personer med blodtype O og AB har antistoffer mot henholdsvis begge eller ingen av blodtypeantigenene. Blodtypeuforlikelighet vil si eksponering av A- eller B-antigener til personer som har utviklet antistoffer mot disse genene (7). Ved transplantasjon tilstrebes derfor at donor og mottager er ABO-forlikelige, men ABOuforlikelige transplantasjoner er i dag mulige og kan bidra til bedre utnyttelse av transplantasjonsorganer (8, 9) HLA-uforlikelighet Immunresponser mot transplantatet er forårsaket av genetiske forskjeller som gir opphav til ulike makromolekyler mellom donor og mottaker. Den vanligste typen alloantigener som kan sette i gang en rejeksjonsreaksjon er det svært polymorfe vevsforlikelighetskomplekset (major histocompatibility complex, MHC) som kalles humane leukocyttantigener (HLA) hos mennesker. HLA-molekylene er membranglykoproteiner som kodes av mer enn 200 gener i et 3

18 kluster på kromosom 6. HLA-molekylene binder intracellulære og ekstracellulære peptidantigener og presenterer disse for T-lymfocytter. På denne måten fungerer HLAmolekylene som immunapparatets viktigste «informasjonsmolekyler» som holder T- lymfocyttene løpende informert om proteiner som befinner seg i det intra og -ekstracellulære miljøet (10). HLA-molekylene deles inn i tre klasser, klasse I, II og III ut ifra deres struktur, uttrykk og funksjon (11). HLA klasse I-molekylene uttrykkes av de fleste kjerneholdige celler og består av tre α- subenheter og β2-mikroglobulin. Klassen deles videre inn i HLA-A, HLA-B og HLA-C molekyler. Hovedoppgaven til HLA I molekylene er å informere cytotoksiske CD8+ T- lymfocytter (T CD8+ ) om peptider fra intracellulære patogener som virus eller andre fremmede peptider (10). HLA II-molekylene består av to α og to β-subenheter og uttrykkes normalt bare på profesjonelle antigenpresenterende celler (APCer) som monocytter, makrofager, dendrittiske celler og B-lymfocytter. Molekylene deles videre inn i HLA-DR, -DQ og -DP. HLA II-molekyler presenterer peptider fra proteiner tatt opp ved endocytose for CD4+Tlymfocytter (T CD4+ ) (10, 11). HLA klasse III molekyler er ikke involvert i presentasjon av antigener, men har en rekke andre funksjoner forbundet med komplementsystemet og inflammasjon (11). Når T-lymfocyttreseptoren (TCR) kommer i kontakt med peptid:hla-molekylkomplekset dannes et HLA: TCR-kompleks som sammen med nødvendig ko-stimulering vil føre til aktivering av T-lymfocytter. Dette vil igjen stimulere aktiveringen av andre immunceller aktive i en avstøtningsprosess nærmere beskrevet i avsnitt (12). Den store variasjonen i genene som koder for HLA-molekyler innebærer at det finnes over 5000 kjente HLA-antigener uttrykt i befolkningen. I teorien vil faren for rejeksjon reduseres med økende grad av likhet i HLA-type. HLA-DR-identitet har størst betydning og pasienter med mismatch har økt risiko for grafttap (13-15). Variasjon i fem aminosyrer i det peptidbindende setet, mellom mottaker og donor, kan være tilstrekkelig for å framprovosere en graftrejeksjon (13, 14). Før transplantasjon undersøkes derfor både donors og mottakerens HLA-type. I tillegg utføres det en «cross-match»-test for å oppdage eventuelle preformerte antistoffer. 4

19 Figur 2: HLA klasse I og II. HLA klasse I-molekyler består av tre α-subenheter og β2-mikroglobulin og danner et HLA:TCR-kompleks med CD8+ T-lymfocytter. HLA klasse II-molekyler består av to α og to β-subenheter og danner et HLA:TCR-kompleks med CD4+ T-lymfocytter. Vevsforlikelighetskomplekset viser en stor grad av polymorfisme og vil derfor være forskjellig hos to genetisk ulike individer og øke faren for akutt avstøtning av transplantatet. HLA; humant leukocyttantigen, TCR; T-lymfocyttreseptor; CD; cluster of differentiation Cellepopulasjoner i fullblod De røde blodcellene (erytrocytter og trombocytter) utgjør ved siden av plasma den største bestanddelen i fullblod. Disse mangler cellekjerne og inneholder derfor ikke DNA og mrna (med unntak av reticulocytter). Fullblod består i tillegg av leukocytter som har viktige funksjoner i det uspesifikke og spesifikke immunforsvaret. Leukocytter har cellekjerner og deles inn i granulocytter (basofile, eosinofile og neutofile), lymfocytter (T-og B, samt naturlige dreperceller) og monocytter. Nøytrofile granulocytter og lymfocytter utgjør til sammen ca. 85 % av det totale antallet leukocytter, hvorav mellom % tilskrives neutrofile granulocytter alene (16) Aktivering av T-lymfocytter Aktivering av T-lymfocytter er en viktig prosess i vårt spesifikke immunforsvar, og er sentralt ved avstøtningsreaksjoner. T- lymfocyttene kan gjenkjenne alloantigener på tre ulike måter; ved en direkte, indirekte eller semidirekte måte som vist i figur 3. Som en konsekvens av 5

20 dette, vil antigen-spesifikke signaler videreføres til T-lymfocytter gjennom TCR-CD3 (signal 1). Aktivering av naive T-lymfocytter krever imidlertid også ko-stimulatoriske signaler som medieres gjennom binding av B7-molekyler (CD80 og CD86) på APCer til CD28-molekyler på T-lymfocytten (signal 2). Aktiveringen fører videre til økt genekspresjon av cytokiner, deriblant interleukin-2 (IL2), som stimulerer T-lymfocyttproliferasjon og motvirker apoptose (signal 3) (17, 18). Aktiverte T CD4+ påvirker reaktiviteten av effektorcellene i alloimmune responser, som for eksempel T CD8+ og deres gjenkjennelse av fremmede HLA klasse I molekyler på overflaten av graftet og APCer. B-lymfocyttene blir stimulert og vil kunne differensiere til antistoffproduserende plasmaceller som setter i gang større antistoffproduksjon mot HLA-antigener fra donor. Aktivering av T-lymfocytter spiller dermed en sentral rolle både ved T-lymfocyttmediert og ved antistoffmediert rejeksjon (19). De ulike signalene for T-lymfocyttaktivering er skissert i figur 4. Figur 3: T-lymfocyttenes gjenkjennelse av alloantigener direkte, indirekte og semidirekte vei. Direkte allogjenkjennelse innebærer at mottakerens T-lymfocytter gjenkjenner donor HLA-peptid-komplekser på donor-deriverte antigenpresenterende celler (APCer) (a). Indirekte allogjenkjennelse skjer når peptider derivert fra donorens HLA-molekyler blir tatt opp og presenteres av mottakerens egne APCer til mottakerens T-lymfocytter (b). Semidirekte allogjenkjennelse innebærer at mottakerens egne APCer tar opp hele HLA-molekyler fra donor celler og presenterer disse for mottakerens T-lymfocytter (c). HLA; humant leukocyttantigen Avstøtningsreaksjoner Avstøtningsreaksjoner deles vanligvis inn i tre hovedtyper avhengig av tidspunkt etter transplantasjon, henholdsvis hyperakutt, akutt og kronisk og mekanismen som er involvert 6

21 omfatter enten cellulære- eller antistoffmedierte immunresponser eller en kombinasjon av disse to (10). Avstøtning av nyregraftet kan oppdages ved en økning av serumkreatinin 20 % og redusert graftfunksjon, men det er funn i biopsi fra graftet som danner grunnlaget for diagnostisering. Type og alvorlighetsgrad klassifiseres ved hjelp av Banff- systemet (20, 21). Hyperakutt avstøtning Hyperakutt rejeksjon oppstår minutter til timer etter transplantasjon og skyldes preformerte antistoffer mot polymorfe HLA- eller ABO-antigener (18). Det finnes per i dag ingen behandling av hyperakutt avstøtning og det vil derfor være nødvendig å fjerne transplantatet, men takket være cross-match-tester og desensitiviseringsregimer for sensitiviserte pasienter forekommer hyperakutt rejeksjon i dag svært sjelden (8, 22). Akutt avstøtning En akutt rejeksjon oppstår vanligvis dager til uker etter transplantasjon og preges av en omfattende inflammasjon med graftdysfunksjon. Akutt rejeksjon deles ofte inn i tre typer: type I (akutt tubulær nekrose), type II (glomerulær type som likner på trombotisk mikroangiopati), type III (vaskulær type med arteriell inflammasjon) (21). En akutt rejeksjon skyldes hovedsakelig aktiverte alloreaktive T-lymfocytter som reagerer med fremmede peptider/hla-komplekser og kan videre trigge B-lymfocytter og antistoffresponser. Akutt antistoffmediert rejeksjon kan igjen gi vaskulære skader, og karakteriseres av tilstedeværelse av komplementfaktoren C4d og sirkulerende antistoffer (18). Kronisk avstøtning Den tredje typen avstøtningsreaksjon kalles kronisk rejeksjon, og kan oppstå måneder eller år etter transplantasjon. Mekanismen er ikke fullstendig klarlagt, men assosieres med immunologiske skader etter utilstrekkelig immunsuppresjon. Dette kan bidra til at antistoffer forårsaker cellehypertrofi og gradvis dysfunksjon av cellemembraner i graftet (13). Tidligere gjennomgåtte avstøtningsreaksjoner, infeksjoner, iskemisk skade, høy alder hos donor, hypertensjon, diabetes og nyretoksiske legemidler kan medvirke til skaden (23). 7

22 1.3 Immunsuppressiv behandling For å unngå avstøtning av det transplanterte organet så er det nødvendig at transplanterte pasienter får immundempende legemiddelbehandling. Behandlingen må, med unntak av noen få tilfeller hvor det oppnås immunologisk toleranse, vare livet ut. I Norge består standard immundempende regime etter nyretransplantasjon av intravenøs induksjonsbehandling med IL-2 reseptorantistoffet basiliksimab og metylprednisolon, samt per oral vedlikeholdsbehandling med takrolimus, mykofenolat mofetil eller mykofenolsyre, og prednisolon (8). Med «induksjonsterapi» menes potente legemidler gitt kun i løpet av den første perioden etter transplantasjonen for å redusere risiko for rejeksjon. Alternative legemidler som brukes hos utvalgte pasienter er mtor (mechanistic target of rapamycin)- hemmerne sirolimus eller everolimus, eller belatacept. Bruken av kombinasjonsregimer med flere immunsuppressive legemidler med ulik virkningsmekanisme bidrar til at man kan oppnå effektiv immunsuppresjon samtidig som at risikoen for legemiddelspesifikke bivirkninger og toksisitet reduseres ved at man kan gi lavere doser av det enkelte legemiddel. Sensibiliserte pasienter, dvs. pasienter med høyere risiko for rejeksjon på grunn av tilstedeværelse av donor-spesifikke antistoffer før transplantasjon, trenger et mer omfattende immundempende legemiddelregime. Dette innebærer blant annen en forbehandling med rituksimab, prednisolon, intravenøs immunoglobulin (IVIG) og fjerning av immunglobuliner ved immunadsorpsjon (8) Glukokortikoider Glukokortikoider (GK) inngår som en viktig del både av induksjonsbehandling og som en del av det immundempende vedlikeholdsregimet. Virkningsmekanismen til metylprednisolon og prednisolon er ikke fullstendig kartlagt. GK virker immundempende blant annet ved å øke transkripsjonen av antiinflammatoriske cytokiner (IL-10) og hemme produksjonen av proinflammatoriske cytokiner (IL-1, IL-2, IL-6). GK virker også immundempende gjennom direkte effekter på proteiner og cellemembran (24, 25). GK har mange uønskede bivirkninger, men de fleste er doseavhengige og ses først etter langtidsbruk. Effektene kan gi kroppslige forandringer som minner om symptomer ved Cushings syndrom. Diabetes og hjerte-karsykdommer er noen av de mest fryktende bivirkningene som kan utvikles over tid. Man kan dermed prøve å seponere GK hos stabile 8

23 pasienter etter ca. 1 år etter transplantasjon, men seponering er assosiert med økt frekvens av rejeksjoner (26) Basiliksimab Basiliksimab (Simulect ) er et immundempende monoklonalt antistoff (IgG1K) som er rettet mot α-kjeden av interleukin-2 reseptor (IL-2RA). Bindingen mellom IL2 og IL-2RA blokkeres og signaleringen som fører til aktivering og proliferasjon av lymfocytter hemmes (25). Legemiddelet administreres intravenøst 20 mg perioperativt samt 20 mg dag 4 etter transplantasjonen (8) Antiproliferativa Mykofenolat er en selektiv, ikke-kompetitiv og reversibel hemmer av inosin 5 - monofosfat dehydrogenase (IMPDH), det hastighetsbegrensende enzymet i nysyntesen av guaninnukleotider. Legemiddelet hemmer proliferasjonen av T- og B-lymfocytter, som er avhengige av nysyntese av puriner, mens andre celletyper i større grad kan benytte seg av alternative synteseveier (2). Det aktive stoffet mykofenolsyre (MPA) er tilgjengelig som en ester prodrug, mykofenolat mofetil (MMF), som hydroliseres like etter oralt inntak og som et enterodrasjert natriumsalt (27). MMF er den mest brukte formen og administreres i doser på 750 mg eller 1g to ganger daglig avhengig av om den kombineres med henholdsvis enten takrolimus eller CsA (8). De vanligste bivirkningene ved bruk av MPA er gastrointestinale bivirkninger som diaré, kvalme og oppkast. Blødninger i mage-tarmkanalen forekommer relativt ofte. Andre bivirkninger er trombocytopeni og leukopeni, særlig etter langtidsbruk. Den immunsuppressive effekten bidrar også til å øke risiko for infeksjoner og kreft (6, 27). Azatioprin (Imurel ) har siden 1960-tallet blitt brukt som vedlikeholdsterapi hos organtransplanterte pasienter, men har i dag stort sett blitt erstattet av MPA (2). Azatioprin brukes fortsatt av pasienter som har blitt transplantert før MPA ble et etablert behandlingstilbud og samtidig viser god toleranse for legemiddelet. Azatioprin krysser placenta, men konverteres ikke av umodne fosterlevere til den aktive 6-tioguaninnukleotider og vil derfor være et trygt immunsuppressivt alternativ for gravide pasienter (28). 9

24 1.3.4 Kalsineurinhemmere Kalsineurinhemmere, ciklosporin eller takrolimus, inngår i dag som en viktig del av de fleste immundempende regimer etter transplantasjon. Ciklosporin ble først funnet i en jordprøve fra Hardangervidda i 1970 og introdusert som immundempende behandling etter nyretransplantasjon i Takrolimus (FK-506, Prograf ) ble identifisert av japanske forskere i 1984 og kom på markedet som et immundempende legemiddel i 1994 (2). Introduksjonen av CNI har revolusjonert den immundempende behandlingen etter transplantasjon. Insidensen av akutte rejeksjoner har gått kraftig ned og i dag er rundt 10 %, mens graftoverlevelse etter ett år har forbedret seg fra ca. 60 til 90 % (29). Til tross for gode resultater kort tid etter transplantasjon (< 1 år), har man imidlertid ikke klart å oppnå tilsvarende forbedring i resultater på lang sikt, og forekomsten av nyresvikt 5 år etter transplantasjon ligger på rundt 18 % (30). Takrolimus har blitt assosiert med lavere risiko for akutt rejeksjon, bedre nyrefunksjon og økt graftoverlevelse sammenlignet med ciklosporin, og takrolimus er i dag preferert CNI ved nyretransplantasjon verden rundt (2). Takrolimus farmakodynamikk Legemiddelet utøver sin immundempende effekt ved å hemme fosfatasen kalsineurin (CN) etter at det blir dannet et kompleks med immunofilinet FK506-bindende protein (FKBP12) som blokkerer fosfatasens aktive sete (30). Gjenkjennelse av fremmede antigener fra allograftet fører til økt intracellulær konsentrasjon av kalsium (Ca 2+ ). Ca 2+ mobiliserer kalmodulin for å danne et kompleks med CN som igjen defosforylerer transkripsjonsfaktoren NFAT (nukleær faktor for aktiverte T-lymfocytter). NFAT vil da kunne passere inn i cellekjernen hvor den fører til transkripsjon av proinflammatoriske cytokiner, som blant annet interleukin-2 (IL-2), interferon-gamma (INFγ), tumor nekrose faktor alfa (TNF-α) og granulocytt- makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) (31). Hemmingen av kalsineurin reduserer defosforyleringen av transkripsjonsfaktoren NFAT og etterfølgende gentranskripsjon som er viktig for T- lymfocyttaktivering og proliferasjon. 10

25 Figur 4: Virkningsmekanismen til kalsineurinhemmeren takrolimus. A: Binding av peptid-hla-kompleks til TCR med samtidig kostimulering fører til økt intracellulær Ca 2+ konsentrasjon, aktivering av kalsineurin, defosforylering av transkripsjonsfaktoren NFAT og økt transkripsjon av pro-inflammatoriske cytokiner, blant annet interleukin-2 (IL-2), interferon-gamma (IFNG) og kolonistimulerende faktor 2 (CSF2). Dette fører til videre aktivering av immunsystemet. B: Takrolimus (rød sirkel) hemmer kalsineurin slik at defosforyleringen og translokasjonen av NFAT til cellekjernen forhindres. Transkripsjonen av NFATregulerte cytokiner og aktiveringen av immunsystemet blir hemmet. APC; antigenpresenterende celler, Ca 2+ ; kalsium, CD4; cluster of differentiation, HLA; humant leukocyttantigen, MHC; major histokompatibility complex, NFAT; Nukleær Faktor for Aktiverte T-lymfocytter, TCR; T-lymfocyttreseptor, mtor; Mechanistic target of rapamycin Takrolimus farmakokinetikk Takrolimus absorberes i mage-tarmkanalen og oppnår maksimal blodkonsentrasjon 1-3 timer etter dosering. Takrolimus bindes i stor grad til erytrocytter og plasmaproteiner med en fri fraksjon på omtrent 1 %. Det er dermed kun en liten andel av legemidlet som er ubundet og kan distribueres til vev og inn i lymfocyttene hvor legemidlet utøver virker (6, 31). Takrolimus metaboliseres av cytokrom P450 (CYP)-enzymene CYP3A4 og CYP3A5 i tarm, lever og nyrer. Uttrykket av CYP3A5-enzymet er i stor grad genetisk betinget. Den vanligste CYP3A5 genvarianten i europeiske populasjoner er CYP3A5*3 som gir manglende eller minimalt uttrykk av funksjonelt CYP3A5-enzym. Pasienter som er CYP3A5*3/*3 homozygote (ca %) vil dermed bare ha takrolimusmetabolisme via CYP3A4. Dette innebærer at pasienter uten funksjonelt CYP3A5-enzym har lavere takrolimus dosebehov enn pasienter hvor takrolimus metaboliseres av begge CYP3A-enzymene (32). Takrolimus har en variabel halveringstid som vanligvis vil ligge rundt timer. Dette innebærer at det vil ta ca. 3-5 døgn etter behandlingsstart eller doseendringer før man vil 11

26 oppnå likevektskonsentrasjon (8). Eliminasjonen foregår hovedsakelig via gallen, 2 % via urin og omtrent 0,5-1 % elimineres uforandret (33). Hovedutfordringene ved bruk av takrolimus er bivirkningene, særlig nyretoksisitet som etter hvert kan utvikle seg til irreversibel nyreskade (34). Bivirkningsprofilen til takrolimus er videre preget av økt risiko for flekkvis håravfall, tremor, nyoppstått diabetes mellitus, nevrotoksisitet, hypertensjon, hyperglykemi, diaré, kvalme, infeksjoner og malignitet. Mange av bivirkningene er reversible eller doseavhengige (2) Andre immundempende legemidler Standard immundempende behandling er ikke egnet for alle pasienter og i ulike situasjoner brukes også andre immunsupprimerende legemidler. Signalhemmere «Mechanistic target of rapamycin» (mtor)- hemmerene sirolimus (Rapamune ) og everolimus (Certican ) tilhører legemiddelgruppen makrolidantibiotika og er eksempler på nyere immundempende legemidler utviklet i håp om å minimalisere CNI-bruken og dermed unngå nyretoksisitet (35). Begge legemidlene virker ved å hemme kinasen mtor og den intracellulære signaleringen nedstrøms for IL-2R som er essensiell for cellesyklusprogresjon og lymfocyttproliferasjon. Det er vist at mtor-hemmere i tillegg har antifibrotiske egenskaper og kan hemme angiogenese i kreftceller, noe som kan være en fordel ved behandling av pasienter med kreft eller med høyere risiko for utvikling av malignitet (6). Flere studier har imidlertid vist høyere frekvens av rejeksjoner, dårligere nyrefunksjon og ugunstige bivirkninger som blant annet forsinket sårtilheling og dårligere graftfunksjon med mtor-hemmere sammenlignet med CNI, og mtor-hemmere benyttes derfor hovedsakelig i tilfeller hvor CNI er kontraindisert (2). Blokade av ko-stimulatorske signalveier. Belatacept (Nulojix ) er det første biologiske legemiddelet i vedlikeholdsterapi etter nyretransplantasjon (36). Legemidlet er et fusjonsprotein mellom et modifisert domene fra humant cytotoksisk T-lymfocyttassosiert antigen 4 (CTLA4) og en del av Fc-domenet fra humant immunoglobulin G1 (IgG 1 ). Fusjonsproteinet blokkerer CD28-mediert ko-stimulering av T-lymfocytter og dermed aktiveringen av disse cellene (6, 25). Studier har vist at pasienter som behandles med belatacept har høyere glomerulær filtrasjonsrate (GFR) og bedre 12

27 metabolsk profil sammenlignet med pasienter som får kalsineurinhemmere (CNI). Økt insidens av lymfoproliferativ sykdom, behov for intravenøs administrasjon og høyere rejeksjonsfrekvens har imidlertid bidratt til at bruken av belatacept så langt er begrenset (25). Utsletting av lymfocytter Antitymocyttglobulin (ATG) er et polyklonalt antistoff rettet mot humane T-lymfocytter. Den immundempende effekten til ATG skyldes hovedsakelig utsletting av T-lymfocytter, men den fullstendige effekten er ikke kjent. ATG kan brukes som et alternativ til basiliksimab, men bruken er i stor grad begrenset til høy-risiko pasienter på grunn av økt frekvens av malignitet, kardiovaskulære hendelser og cytomegalovirus (CMV) (37). 1.4 Infeksjoner forbundet med immunsuppressjon Langvarig immunsuppressiv behandling øker risiko for bakterie-, virus- og soppinfeksjoner (38). Immunsupprimerte pasienter er utsatte for infeksjoner som har lav forekomst blant immunkompetente personer. Infeksjonskildene relateres til både intensitet av immundempende behandling samt epidemiologisk eksponering av både donor- og mottaker. Smitten kan skje både før transplantasjon og under sykehusopphold. Dette gjelder både kjente og udiagnostiserte patogener og er relevant særlig den første måneden etter transplantasjon. Opportunistiske infeksjoner som cytomegalovirus (CMV), BK-virus (BKV) og JC-virus (JCV) (begge polyomavirus), Epstein-Barr-virus (EBV), Herpes simplex virus forekommer ofte i perioden 1 6 måneder etter transplantasjon. Etter ett halvt år er man mest utsatt for smitte fra omgivelsene og reaktivering av latente infeksjoner. Hyppigst forekommende er urinveisinfeksjoner, pneumonier og virusinfeksjoner (39). Alle nyretransplanterte pasienter får profylaktisk behandling med trimetoprimsulfametoksazol (Bactrim ) i 6 måneder etter transplantasjon for å redusere risikoen for Pneumocystis jiroveci pneumoni (8). CMV er den vanligste virale komplikasjonen etter organtransplantasjon og assosieres med dårlig graft- og pasientoverlevelse. De vanligste symptomene er feber og sykdom i gastrointestinaltraktus (40). For å forebygge CMV-infeksjon blir det ved OUS gitt profylakse med 450 mg valganciklovir (Valcyte ) 1 gang i uken fra 1. dag etter transplantasjon. CMVkopitall monitoreres ukentlig de første ti ukene etter transplantasjon (8). 13

28 BKV kan føre til nyreskade og begrenser derfor gode langtidsresultater etter nyretransplantasjon. JCV kan føre til progressiv multifokal leukoencefalopati (PML) og hjerneskade. Det finnes i dag ingen godt dokumentert antiviral legemiddelbehandling av polyomavirus infeksjoner og tiltakene for å motvirke eller begrense polyomavirus-viremi består vanligvis av redusert/modifisert immunsuppresjon (39). 1.5 P-glykoprotein Permeabilitetsglykoprotein (P-glykoprotein, P-gp), er den mest studerte legemiddeltransportøren og ble først beskrevet av kanadiske forskere Juliano og Ling i 1976 som oppdaget at overuttrykk av transportøren kunne bidra til cytostatikaresistens (41). Proteinet er en adenosintrifosfat (ATP)-avhengig kassett (ABC)-transportør i ABCB-familien som kodes for av genet ABCB1, også kalt multidrug resistance gene (MDR1) (42) Struktur P-glykoprotein består av ca aminosyrer med en intracellulær amino-terminal ende og to ATP-bindende domener, også kjent som nukleotid-bindende domener (NBD1 og NBD2), som befinner seg i cytosol (43). Videre har P-gp to transmembrane domener (TMD1 og TMD2) med 6 segmenter hver (44). NBD1 og NBD2 er essensielle for binding av ATP som funksjonen til P-gp er avhengig av. 14

29 Figur 5: P-glykoprotein (P-gp) som molekyl og transportprotein. P-gp uttrykkes blant annet på overflaten av lymfocyttene hvor den bidrar til å pumpe blant annet takrolimus ut av cellen. Den består av to strukturelt identiske halvdeler med et nukleotidbindende domene (NBD) som binder adenosintrifosfat (ATP) og et transmembran domene (TMD) med 6 segmenter. TMD1 og 2 medierer substratenes passasje gjennom membranen. NBD består av Walker A - og Walker B-regioner lokalisert intracellulært. Halvdelene er koblet sammen med gjennom C-motif Substrater og funksjon P-glykoprotein utnytter energi fra ATP til å frakte molekyler gjennom biologiske membraner mot en konsentrasjonsgradient. Forbindelsene som interagerer med transportøren deles gjerne inn i substrater, inhibitorer og modulatorer. Stoffer som aktivt transporteres ved hjelp av P-gp klassifiseres som substrater. Inhibitorer hemmer transportaktiviteten, mens modulatorer binder seg på et annet sted på molekylet enn det aktive setet og skaper en negativ allosterisk interaksjon, noe som igjen reduserer substratbinding (45). P-gp er en multisubstrat-transportør av hovedsakelig hydrofobe, endogene og eksogene substanser fungerer som beskyttende efflukspumpe. Substratene omfatter blant annet steroider, deriblant hormoner, lipider og xenobiotika. Disse forbindelsene er strukturmessig svært ulike og substratmangfoldet kan tyde på at P-gp har ulike bindingsseter. 15

30 1.5.3 Distribusjon og uttrykk P-gp er uttrykkes i stor grad i kroppens beskyttende barrierer, som blod-hjernebarrieren, gallegangen, tarmslimhinnen, lever, nyrer, placenta og blod-testis-barrieren, samt leukocytter (46). Uttrykk av P-gp i tarmen bidrar til å begrense absorpsjonen av legemidler som takrolimus ved å pumpe legemidlene tilbake til tarmlumen, noe som kan være en medvirkende årsak til den forholdsvis lave biotilgjengeligheten av legemiddelet (ca %) (42). På denne måten kan P-gp styre intracellulær passasje og akkumulering (44, 47). Betydningen av P-gp i lymfocytter for takrolimuseksponering er imidlertid mindre kjent. Uttrykket av P-gp kan reguleres av flere faktorer, blant annet cytokiner som IL-2 og IL-4 (48). Det er også vist at økt uttrykk av TNF-α, GK og ABCB1-genvarianter, kan påvirke aktiviteten og uttrykket av transportøren (46). Dette kan igjen ha betydning for graden av legemiddeleksponering, økt legemiddeltoleranse samt utvikling av ulike kliniske tilstander som for eksempel kronisk inflammatorisk tarmsykdom (46, 49). 1.6 Terapeutisk legemiddelmonitorering De fleste immundempende legemidlene brukt ved nyretransplantasjoner, inkludert takrolimus karakteriseres av smalt terapeutisk konsentrasjonsområdet. Sub-terapeutiske konsentrasjoner kan føre til utilstrekkelig immundempende behandling med stor fare for avstøtning av det transplanterte organet, mens for høy eksponering kan gi bivirkninger og toksisitet (50). I tillegg varierer farmakokinetikken til takrolimus mellom pasientene og over tid for samme pasient, blant annet på grunn av faktorene som alder, hematokrit, andel av fettvevet, farmakokinetikk, enzymaktivitet, nyrefunksjon, kosthold og inntak av andre legemidler (51). For å redusere variabiliteten blir takrolimusdoseringen styrt ved hjelp av terapeutisk legemiddelmonitorering (TDM; therapeutic drug monitoring) (50, 52) Farmakokinetisk monitorering av takrolimus Takrolimus monitoreres i dag ved hjelp av måling av legemiddelkonsentrasjonen i fullblod før dose (C 0 ). Den mest presise parameteren for legemiddeleksponering er imidlertid gjentatte konsentrasjonsmålinger og beregning av areal under konsentrasjons-tids-kurven (AUC). Behovet for hyppig prøvetakning og mange analyser gjør imidlertid at AUC-målinger ikke er egnet for klinisk rutinemonitorering. Det har blitt foreslått flere alternative farmakokinetiske 16

31 parametre for estimering av takrolimuseksponering (C 2, forkortet AUC), men rutinemonitorering baseres fortsatt på C 0 -målinger (8, 53). SYMPHONY-studien var et gjennombrudd som viste at et immundempende regime med «lavdose» takrolimus var assosiert med lavere forekomst av akutte rejeksjoner og bedre nyrefunksjon enn regimer med ciklosporin (standard og «lavdose») og sirolimus («lavdose»)(53, 54). Funnene førte til at det terapeutiske målområdet for takrolimus ved OUS redusert til C ng/ml (8-12 ng/ml hos høy-risiko pasienter). Takrolimuseksponeringen blir vanligvis monitorert med konsentrasjonsmålinger 3-4 ganger per uke i den tidlige, postoperative fasen inntil pasienten skrives ut fra Rikshospitalet etter ca. 10 uker. Videre oppfølging foregår lokalt 1 gang i måneden fram til ett år etter transplantasjon (8). Takrolimus bindes i stor grad til plasmaproteiner og erytrocytter, og konsentrasjonmålinger utføres derfor vanligvis i fullblod. Til tross for legemiddelmonitoreringen basert på konsentrasjonsmålinger opplever mer enn 10 % av nyretransplanterte pasienter minst en rejeksjon innen de 6 første måneder etter transplantasjon (55). Den langsiktige graftoverlevelsen har heller ikke bedret seg og en stor andel av pasientene opplever CNIassosiert nyretoksiksisitet og nyresvikt innen ti år etter transplantasjon (56). CNI-assosiert toksisitet er også en viktig årsak til kardiovaskulære hendelser og økt risiko for infeksjoner og maligne tilstander (2). Det er derfor ønskelig å finne alternative metoder som kan bidra til ytterligere individualisering av den immundempende behandlingen etter transplantasjon. Målinger i fullblod gjenspeiler imidlertid ikke nødvendigvis den intracellulære konsentrasjonen av takrolimus i lymfocytter, og måling av intracellulære legemiddelkonsentrasjoner kan være en bedre parameter for prediksjon av farmakodynamisk effekt (57). Den intracellulære konsentrasjonen av takrolimus i lymfocytter avhenger trolig av blant annet P-pg uttrykk. Flere studer har videre vist at farmakodynamisk monitorering av takrolimus kan være en alternativ eller komplementerende strategi for individualisering av behandlingen (58). Et interessant funn beskrevet av Masuda et al. i 2005 gav et nytt perspektiv for terapi med takrolimus som var rettet mot rollen av ekspresjonsnivåer til P-gp i tarm. Studien ble utført på levertransplanterte pasienter og visste en god invers korrelasjon mellom takrolimuskonsentrasjon/dose ratio (C/D) og ekspresjon av ABCB1 mrna i enterocytter (59). 17

32 1.6.2 Farmakodynamisk monitorering av takrolimus Farmakodynamisk monitorering av takrolimus kan deles inn i to strategier; enzymatisk og immunologisk. Enzymatiske tester er legemiddelspesifikke biomarkører som tillater direkte bestemmelse av intracellulær CN fosfataseaktivitet. Immunologiske strategier måler derimot nedstrøms immunologiske responser på ulike nivåer, som uttrykk av cytokiner (f.eks. IL-2) eller overflatemolekyler som markør for lymfocyttaktivering (f.eks. CD25 i CD3+ T- lymfocytter) eller lymfocyttproliferasjon (55, 60). En annen metode for monitoriering av takrolimusrespons kan være måling av NFAT-regulerte cytokiner (IL-2, IFNy og GM-CSF) ved bruk av kvantitativ sanntids PCR. Flere studier har rapporter at grad av cytokinhemming i større grad korrelerer med kliniske endepunkter som rejeksjon og infeksjon enn takrolimus konsentrasjonmålinger (58, 61). Den kliniske nytteverdien av farmakodynamisk monitorering må imidlertid undersøkes nærmere i videre studier Farmakogenetiske aspekter ved takrolimusbehandling Variasjonen i takrolimuskinetikk skyldes delvis genetiske faktorer, og farmakogenetiske analyser kan være et nyttig tilleggsverktøy for å ytterligere individualisere takrolimusbehandlingen blant nyretransplanterte pasienter. Variasjon i gener som koder for metabolismeenzymer (CYP isoenzymer 3A4 og 3A5) og legemiddeltransportører (ABCB1) har fått mye oppmerksomhet, hvorav CYP3A5 er den best karakteriserte (62, 63). Flere studier har bekreftet at individer med funksjonelt CYP3A5-enzym (CYP3A5*1/*3- og CYP3A5*1/*1-genotype) vanligvis vil ha høyere samlet metabolisme av CYP3A-substrater sammenlignet med individer som mangler CYP3A5. Pasienter med funksjonelt CYP3A5 oppnår lavere fullblodkonsentrasjoner av takrolimus etter per oral administrasjon sammenlignet med ikke-bærere (CYP3A5*3/*3) og vil dermed trenge 1,5-2 ganger så høy startkonsentrasjon av takrolimus for å oppnå terapeutisk konsentrasjon (64). CYP3A5- genotyping før transplantasjon kan bidra til ytterligere individualisering av immunsuppressiv terapi og er fra inkludert i standard protokoll før oppstart av takrolimusbehandling ved nyretransplantasjoner ved OUS (8). Flere studier har også rapportert om assosiasjoner mellom P-glykoprotein transportaktivitet og ABCB1-genvarianter. Sekvensering av ABCB1-genet har vist mer enn

33 enkeltnukleotidvarianter (SNV) per pasient, noe som varierer mellom folkegrupper. De tre mest studerte SNVene (også kjent som enkeltnukleotidpolymorfisme, SNP) er c.1236t>c i ekson 11, c.2677t>(a/g) i ekson 21 og c.3435t>a/c i ekson 26. T-varianten ved en eller flere posisjoner har blitt assosiert med lavere ABCB1-uttrykk redusert transportaktivitet av substrater (64). En sammenheng mellom enkelte genvarianter av ABCB1 og nyretoksisitet er også beskrevet i litteraturen og viser at P-gp i tubulære epitelceller kan påvirke lokal akkumulering av takrolimus i nyrene (47). Andre studier har imidlertid ikke funnet noen sammenheng mellom ABCB1-genvarianter og takrolimuskinetikk eller effekt. 19

34 2 Problemstilling Organtransplantasjoner krever livslang immunsuppresjon for å unngå avstøtning av graftet. Kjernen i dagens immundempende regime er kalsineurinhemmeren takrolimus (Prograf, Tacni, Advagraf ). Introduksjonen av kalsineurinhemmere har ført til en betydelig forbedring av korttidsresultatene (<1 år) etter transplantasjon. Langtidsresultatene (>5 år) har imidlertid ikke forbedret seg i samme grad og ca. 40 % av pasienter opplever nyresvikt innen ti år etter transplantasjon. Bruken av takrolimus er knyttet til utfordringer som smalt terapeutisk vindu som kan medføre konsekvenser ved under eller overeksponering, samt utbredt farmakokinetisk variasjon mellom pasienter og over tid for samme pasient. I dag doseres legemiddelet derfor ved hjelp av hyppige konsentrasjonsmålinger. Blodkonsentrasjoner gjenspeiler imidlertid ikke nødvendigvis den faktiske immundempende effekten av takrolimus og det er ønskelig å finne alternative eller komplementære metoder for individualisering av takrolimusbehandling etter transplantasjon. Takrolimus er et substrat for metaboliserende enzymer i CYP 3A-familien, særlig CYP3A5 samt legemiddeltransportøren P-glykoprotein flere steder i kroppen, noe som kan påvirke dets biotilgjengelighet og effekt intracellulært på virkestedet. ABCB1-nivå og funksjon har blitt assosiert med behandlingsrespons av andre P-gp substrater og har mulig relevans for takrolimus. Individuelle forskjeller i P-gp uttrykk og aktivitet er sett i sammenheng med blant annet genetiske variasjoner i ABCB1-genet som koder for P-gp. Særlig enkeltnukleotidpolymorfismer c.1236t>c, c.2677t>a/g, c.3435t>a/c har blitt assosiert med forskjeller i P-gp uttrykk og funksjon og kan dermed ha betydning for CNI-dosebehov. Hensikten med dette mastergradsprosjektet var å kvantifisere P-glykoprotein genuttrykk i hvite blodceller hos nyretransplanterte pasienter før og etter transplantasjon, og å undersøke mulige sammenhenger med ABCB1 genvarianter, farmakodynamisk respons og kliniske utfall etter transplantasjon som videre kunne bidra til optimalisering av klinisk praksis ved nyretransplantasjon. 20

35 3 Materialer og metode 3.1 Reagenser og utstyr Tabell 1: Oversikt over reagenser Reagens/Kit Produsent Katalognr. LightCycler 480 Probes Master Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland MagNA Pure LC RNA Isolation Kit- High Performance Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland MS2 RNA Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Primere og prober (sekvenser gitt i Tabell 11 og 12) TIB MOLBIOL Syntheselabor GmbH, Berlin, Tyskland Egendesignet TE-buffer 1X, Molecular Biology Grade Promega Corporation, Madiso, WI, USA V6231 Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland

36 Tabell 2: Oversikt over utstyr Utstyr Produsent Kat.nr. LightCycler 480 Instrument LightCycler 480 Multiwell Plate 96, 4 bar codes LightCycler 480 Sealing Foil LightCycler 480 Software, Version 1,5 MagNA Pure LC 2.0 Instrument MagNA Pure LC Cartridge Seal MagNA Pure LC Cooling block, 96-well PCR plate MagNA Pure LC Cooling block, Reaction tubes MagNA Pure LC Greasing Set MagNA Pure LC Medium Reagent Tube 20 MagNA Pure LC Medium Reagent Tube 30 MagNA Pure Processing Cartridge MagNA Pure LC Reaction Tips (large) MagNA Pure LC Reaction Tips (small) MagNA Pure LC Reagent Tubs (large) MagNA Pure LC Sample Cartridges MagNA Pure LC Tip Strands Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Applied Science Mannheim, Tyskland Roche Applied Science Mannheim, Tyskland Roche Applied Science Mannheim, Tyskland Roche Applied Science Mannheim, Tyskland Roche Applied Science Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland

37 MagNA Pure LC Tub Lid Seals MagNA Pure LC Tub Lids (small, medium) Microtubes, 1,5 ml Multiply Pro cup 0,2 ml Natrium-heparinrør, 4 ml PAXgene Blood RNA Tube Thermal-cycler Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland Sarstedt, Numbrecht, Tyskland Sarstedt, Numbrecht, Tyskland Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Østerrike PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon,Sveits MJ Research, Watertown, Mass., USA PTC-150 I tillegg til utstyret nevnt i tabellen ovenfor ble det benyttet standard laboratorieutstyr som pipetter, pipettespisser, sentrifuge, desinfeksjonsmidler. For å redusere risiko for kontaminasjon eller mrna-degradering ble det brukt rene hansker under arbeid med RNA/DNA. Utstyret som kom i kontakt med prøvene eller reagenser, var sterilt og fritt for ribonukleaser. Reagenser og vann var av PCR-kvalitet. 3.2 Pilotstudien MarkIt Pilotstudien «Molekylære biomarkører for immundempende behandling hos nyretransplanterte» (MarkIt) er en deskriptiv kohortstudie som utføres ved Avdeling for farmakologi og Avdeling for medisinsk biokjemi ved OUS, Rikshospitalet. Pilotstudien er godkjent av Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk (REK, 2011/1282 D). Inklusjonskriteriene var alder 18 år, organ fra levende donor og planlagt takrolimusbasert immundempende regime. Pasienter ble ekskludert dersom transplantasjonen ble avlyst, dersom pasienten ikke fikk takrolimus eller dersom det av medisinske eller tekniske årsaker ikke var mulig å gjennomføre prøvetakningen. Pasientene ga skriftlig informert samtykke til deltakelse i studien og kunne deretter når som helst trekke seg fra studiedeltagelsen. Pasientene som ble inkludert ble nummerert fortløpende fra 1 til 33. Takrolimusbehandlingen ble innledet med en startdose på 0,04 mg/kg som doseres 2 ganger 23

38 om dagen. Det ble ikke foretatt CYP3A5-genotyping av alle pasienter før behandligsstart da analysen ikke var en del av standardprotokollen ved inklusjon av de første pasientene. 3.3 Kvantifisering av ABCB1-genekspresjon ABCB1-genekspresjonen ble analysert i fullblodprøver som ble tatt i RNA PAXgene -rør. Rørene inneholder en lyseringsbuffer som gir umiddelbar stabilisering av RNA-profilen i blod etter prøvetakning. Det ble tatt blodprøver før transplantasjon og både før dose (t 0 ) og 1,5 timer etter dose (t 1,5 ) ved et tidspunkt i periodene 6-9 dager, 5-7 uker og ca. 1 år etter transplantasjon som vist i figur 6. Figur 6: Blodprøvetakning i PAXgene - rør til ABCB1- genekspresjonsanalyse. t 0 = før dose, t 1,5 = 1,5 timer etter dose. Kvantifiseringen av ABCB1-genekspresjon omfatter fire hovedtrinn: Isolering av RNA, revers transkripsjon, sanntids PCR og dataanalyse som vist i figur 7. 24

39 Figur 7: Hovedtrinnene for kvantifisering av ABCB1-genekspresjon i fullblod. Trinn 1: Total-RNA isoleres fra fullblodprøver. Trinn 2: RNA fungerer som templat for cdna-syntese. Trinn 3:Sanntidsamplifisering av målgenet ABCB1 og tre referansegener. Trinn 4: Beregningen av relativ genekspresjon er basert på amplifikasjonskurvene til mål-og referansegener. Forkortelser: ABCB1, ATP-bindende kasett, subfamilie B; ALAS, 5- aminolevulinatsyntase 1; B2M, beta-2-mikroglobulin; RPL13A, ribosomal protein L13a (Modifisert figur: Sara Bremer) Isolering av RNA Total-RNA ble isolert ved bruk av instrumentet MagNA Pure LC, reagenser fra MagNA Pure RNA Isolation Kit og protokollen RNA High Performance blood external lysis i henhold til produsentens anvisninger (65). PAXgene -rør ble tint og cellemateriale fra 1 ml prøveløsning ble resuspendert i 800 μl Lysis/binding Buffer og overført til 32-brønners brett for RNA-isolering. Lysis/Binding Buffer innholder kaotrope salter og sikrer fullstendig cellelysering slik at RNA frigis og ribonukleaser denatureres. Protokollen for RNA-ekstraksjonen omfatter videre tilsetning av Proteinase K, DNAse, isopropanol, paramagnetiske silikapartikler, vaskebuffer og elueringsbuffer. Proteinase K bryter ned gjenvarende proteiner og nukleaser, mens DNase fjerner genomisk DNA. Total RNA bindes til overflaten på paramagnetiske silikapartikler som separeres magnetisk fra det resterende prøvematerialet. Ubundne substanser fjernes gjennom flere vasketrinn. Total-RNA elueres til slutt fra silikapartiklene ved 70 C. 25

40 Ekstraksjonsvolumet ble satt til 720 µl og elueringsvolum var 50 µl. I hver isolering ble det også tatt med negativ kontrollprøve uten RNA. RNA-eluatet fra isoleringen overført til Sarstedt-rør (1,5 ml) og frosset ved -70 C inntil videre bearbeidelser undersyntesen av komplementært DNA Revers transkripsjon Total-RNA fungerte som templat for syntese av cdna som ble utført ved bruk av Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit og Thermal-cycler etter produsentens anvisning (66). Transcriptor revers transkriptase er en RNA-spesifikk DNA polymerase som syntetiserer DNA med RNA som templat. Det ble brukt en kombinasjon av to ulike primerstrategier, oligo (dt)18 primere og random heksamere primere. Den første bindes selektivt til poly (A) halen i 3 -ende av mrna-molekyler, mens random heksamere primere bindes tilfeldig til alt RNA og bidrar til revers transkripsjon av RNA-sekvenser uavhengig av poly (A)-hale. Reaksjonen startet med at RNA og primere ble inkubert ved ca. 65 C for å denaturere RNAsekundærstruktur og deretter raskt avkjølt på is for å la primere binde seg til RNA (trinn 1). Deretter ble det tilsatt RT-buffer, RNase-hemmer, nukleotider (dntp) og revers transkriptase (trinn 2). Temperaturen ble deretter økt til C i trinnene for selve cdna-syntesen (trinn 3-6). Til slutt ble Revers transkriptase enzymet inaktivert (trinn 7) før reaksjonsblandingen ble avkjølt til 4 C (trinn 8). For hver prøve ble det utført to parallelle reaksjoner på 20 μl i 0,2 ml PCR-rør. De ulike syntesetrinnene er beskrevet i tabell 3. Produktet fra de to parallelle reaksjonene ble slått sammen (40 µl) og tilsatt vann (PCRkvalitet) med stabiliserende MS2-RNA (10 ng/μl). Prøvene ble deretter frosset ved -20 C i inntil videre analyser. 26

41 Tabell 3: Oversikt over trinnene i cdna-syntesen Trinn Temperatur (ºC) Tid (min) Reagenser Volum til hvert Sarstedt-rør (0,2 ml) Vann m/ MS2 RNA 6 % 5 µl 1 65 forever Oligo dt primer Random primer Primermiks 6 µl 3 µl RNA-eluat fra MagNA- 5 µl pure RT buffer 12 µl 2 25 forever RNAse inhibitor Nukleotid mix Master Mastermiks 1,5 µl 6 µl RT enzym 1,5 µl Slope: +30, 0,3 ºC/sek forever Polymerasekjedereaksjon (PCR) Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en viktig genteknologisk teknikk for å amplifisere, eller kopiere små, spesifikke DNA-biter. Dersom metoden kombineres med revers transkripsjon 27

42 for analyse av RNA så brukes ofte begrepet revers-transkripsjon PCR. PCR-reaksjonen innebærer kopiering av DNA-sekvenser gjennom gjentatte sykluser med temperaturregulering. Oppkopieringen av DNA-sekvenser krever tilstedeværelse av DNApolymerase, primere, nukleotider og en buffer med salter. Primere er korte DNA-sekvenser som bindes til templatsekvens og fungerer som startsted for syntesen av en ny DNA-tråd som lages fra 3`-enden av primeren. Reagenser og prøvemateriale ble pipetter til 96-brønners PCR-brett ved hjelp av «Postelution» funksjon på MagNA Pure LC instrumentet. Kvantifiseringen av ABCB1-genuttrykk ble deretter utført på sanntids PCR-instrumentet LightCycler 480. Sanntids kvantitativ-pcr Sanntids kvantitativ-pcr, også kjent som «real-time» qpcr, er en rask og sensitiv metode for kvantitativ bestemmelse av nukleinsyrer. Sanntids PCR innebærer at amplifikasjonen monitoreres ved hjelp av fluorescerende molekyler og fluorescensmålinger underveis. Deteksjonsprinsippet som ble brukt i denne metoden er to hybridiseringsprober som sender ut signal som følge av «fluorescens resonans energioverføring» (FRET). Hybridiseringsprobene består av et par sekvensspesifikke oligonukleotider som har bundet ulike fluoroforer. Fluorescenssignalet som måles krever energioverføring fra «donorproben» til «akseptorproben» og dette vil bare skje dersom begge probene bindes selektivt til målsekvens med 1 5 bp mellomrom. PCR-programmet som ble brukt til ABCB1-genekspresjonsanalysen er vist i figur 8. Reaksjonen startet med et denatureringstrinn ved 95 ºC. Den høye temperaturen gjør at dobbelttrådet DNA denatureres til to enkelttråder. I det neste bindingstrinnet («annealing») ble temperaturen senket til 57 ºC. Reduksjonen i temperatur gjør at primerne kan binde seg til cdna-templatet og initiere syntesen av en ny DNA-tråd. I elongeringstrinnet ble temperaturen økt til 72 ºC som er optimal temperatur for DNA-polymerase og dermed kjedeforlengelse. Temperaturreguleringen ble gjentatt 45 ganger før reaksjonblandingen ble avkjølt. 28

43 x 45 syklus 95 C 95 C 72 C Primer bindes til templatet 57 C 40 C 1: Denaturering av DNA-tråd 2: PCR 3: Avkjøling Figur 8: Skjematisk fremstilling av sanntids PCR-program på LightCycler. 1: Denaturering ved 95 C. 2: Primere og prober bindes ved 57 C, ny DNA-tråd syntetiseres ved 72 C og denaturering ved 95 C før syklusen gjentas. 3: Avkjøling til 40 C. For hver prøve ble sekvenser fra ABCB1 (målgen) og de tre referansegenene ALAS1, B2M og RP-L13A amplifisert i separate reaksjoner. Reagenssammensetningen for de ulike reaksjonene er angitt i Tabellene 6-9 (se vedlegg). Det ble inkludert negative kontroller i alle kjøringer. For å redusere betydningen av tilfeldig variasjon ble det for hver prøve kjørt tre parallelle PCR-reaksjoner, både for mål - og referansegener Relativ kvantifisering av ABCB1-genekspresjon Kvantitativ sanntids-pcr baserer seg på teorien om at det skjer en dobling av molekyler i hver PCR-syklus. Dersom man kjenner til antall molekyler etter et bestemt antall sykluser kan man dermed beregne hvor mange molekyler som var tilstede ved start. Parameteren som kvantifiseres i hver reaksjon er «crossing point» (Cp)-verdien. Cp-verdien representerer den PCR-syklusen hvor fluorescenssignalet stiger over en bestemt terskelverdi. Cp er inverst proporsjonal med cdna-templatkonsentrasjonen ved start. Fordi man ved Cp-verdi har oppkopiert et bestemt antall molekyler så kan man bruke denne verdien til å beregne antall molekyler ved start vha. ligning A. I praksis vil effektiviteten vanligvis være lavere enn 100 % (E<2), noe som innebærer at det ikke skjer en dobling av antall molekyler i hver syklus. Det reelle PCR-effektiviteten for 29

44 amplifikasjon av ABCB1, ALAS1, B2M og RPL13A ble estimert basert på stigningstallet til standardkurver generert ved seriefortynning av templat (E = 10-1/stigningstall ). De estimerte verdiene for effektivitet angitt i tabell 10 (se vedlegg) ble videre inkludert i beregningen av genuttrykk som vist i ligning B. ABCB1-genekspresjonen ble kvantifisert relativt i forhold til et geometrisk snitt av genuttrykket av de tre referansegenene 5-aminovulinatsyntase (ALAS1), beta-2-mikroglobulin (B2M) og ribosomal protein L13a (RPL13A) (ligning C). Referansegenene koder for viktige endogene produkter essensielle for normal cellefunksjon. Normalisering til referansegener bidrar til å korrigere for forskjeller i prøvemengde, pipettering, utbytte ved RNA-isolering og effektiviteten til revers transkripsjon reaksjonen. I tillegg til normaliseringen til referansegener så ble relativt genuttrykk i hver prøve normalisert til genuttrykket i en kalibratorprøve som ble inkludert i samme kjøring. Kalibratoren fungerer som et konstant kalibreringsmål mellom ulike kjøringer og samtidig også som en positiv kontroll på at kjøringen fungerer som den skal. A: N Cp = N 0 x 2 Cp B: N Cp = N 0 x E Cp C: Relativ genekspresjon = 3.4 Takrolimuskonsentrasjoner Takrolimuskonsentrasjonenen ble målt i 200 µl EDTA-fullblod som en del av rutineanalysen ved Enhet for Farmakologiske analyser, Rikshospitalet. Analysene ble utført ved bruk av kjemoluminesens mikropartikkel immunoassay med Architect Tacrolimus Reagent Kit (katalognr.: 1L7-25) på Architect i2000sr instrument (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA). Konsentrasjonen av takrolimus i prøven er indirekte proporsjonal med mengde relative lysenheter målt av optikken. Analytisk måleområdet for analyse av takrolimus konsentrasjon er 1,0 30,0 µg/l. 30

45 3.5 Genotyping Analyse av DNA-sekvensvarianter ble utført basert på EDTA-fullblod prøver tatt før transplantasjon. For noen av analysene (dypsekvensering) ble prøvematerialet supplert med EDTA-fullblod fra prøver tatt etter transplantasjon for å få nok materiale Sanntids PCR og smeltekurvanalyse Analyse av CYP3A4*22 (NM_ :c C>T, rs ) og CYP3A5*3 (NM_ :c A>G, rs776746) genvarianter ble utført som rutineanalyser ved Enhet for spesialanalyser, Rikshospitalet. Metoden omfatter isolering av DNA ved bruk av MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I og DNA1 Blood Cells Fast protokoll på MagNA Pure LC instrument. Selve genotypingen blir deretter utført ved hjelp av sanntids PCR og smeltekurveanalyse på LightCycler 480 Bruk av allelspesifikke hybridiseringsprober og smeltekurveanalyse gjør at man kan skille mellom sekvensvarianter som følge av forskjeller i bindingsstyrken mellom probe og målsekvens med og uten sekvensvariant Dypsekvensering Informasjon om ABCB1 genotyper ble hentet fra resultatene fra et annet delprosjekt i MarkItstudien som omfatter utvikling av dypsekvenseringsmetoder for farmakogenetiske analyser. Etter DNA-ekstraksjon ble DNA fragmentert til sekvenser på inntil ca bp før utvalgte gener ble fanget ut («capture») fra genomet. Det ble i dette tilfellet designet et spesifikt «capture» kit for gener relatert til immunfarmakologi (både kodende og ikke-kodende sekvenser). De utvalgte genene ble amplifisert ved bridge PCR og deretter analysert med dypsekvensering på MiSeq-sekvensator (Illumina) ved Avdeling for medisinsk genetikk, OUS. Prinsippet for dypsekvenseringen er massiv parallell sekvensering. Til slutt ble alle de sekvenserte fragmentene satt sammen og tolket ved hjelp av programvaren Integrative Genomics Viewer (Broad Institute). Til dette delprosjektet ble det hentet ut informasjon om ABCB1 sekvensvariantene NM_ :c.1236T>C (rs ), c.2677t>a/g (rs ) og c.3435t>a/c (rs ). Det ble også undersøkt om pasientene hadde andre ABCB1-sekvensvarianter som sannsynligvis ville påvirke ABCB1-funksjon (varianter som gir leserammeskift, stoppkodon, spleisefeil o.l.). 31

46 3.6 Kliniske endepunkter og laboratorieprøver Relevant informasjon om pasientkarakteristika, kliniske parametere, legemiddelbruk og laboratoriesvar ble hentet fra pasientjournaler, legemiddelplakater og laboratoriedatasystemet ved OUS, Rikshospitalet. Faste parametere omfattet blant annet demografiske data og kliniske data som komorbiditet, sykdomsbeskrivelse, legemiddelbruk utenom standard immunsuppresjon, HLA og ABO-forlikelighet og legemiddelkonsentrasjoner til takrolimus og mykofenolat. Ytterligere oppfølging inkluderte pasient- og graftoverlevelse, biopsier, polyomavirus-viremi og bivirkninger som følge av legemiddelbruk samt andre laboratoriske prøver. Deteksjonsgrensen for polyomavirus var 60 DNA-kopier/mL, mens måleområdet var 230-2,3 x 10 7 DNA-kopier/mL. Alvorlighetsgraden av polyomavirus-viremi defineres ut fra kopitall og klassifiseringen som brukes ved OUS er: <1000 DNA-kopier/mL: lav mengde i blod. Ingen klinisk betydning DNA-kopier/mL: moderat mengde i blod. Usikker klinisk betydning. > DNA-kopier/mL: høy mengde i blod. Kan ha klinisk betydning. Biopsi-bekreftet akutt rejeksjon (BPAR) klassifiseres etter Banff-systemet og utføres ca. 6 uker og 1 år etter transplantasjon, mens viruskontroll i blod foretas ved OUS, Rikshospitalet 1 gang per måned fra uke 7-8 til 6 måneder etter transplantasjon, deretter hver tredje måned til det er gått 2 år etter transplantasjon (8). Totalt antall leukocytter ble målt i EDTA-fullblod ved hvert prøvetakingstidspunkt. GFR ble estimert ved hjelp av Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration (CKD-EPI-formelen) (67): GFR = 141 x min (Scr /κ, 1) α x max (Scr /κ, 1) x 0,993 Age x 1,018[for kvinner] x [for mørkhudet person] Hvor: S cr er serum kreatinin i µmol/l, Қ er 61,9 for kvinner og 79,6 for menn α er -0,329 for kvinner og -0,411 for menn, min. indikerer minimum av S cr /қ eller 1 maks. indikerer minimum av S cr /қ eller 1 32

47 3.7 Statistiske metoder Statistiske analyser ble gjort ved hjelp av statistikkprogrammet IBM SPSS Statistics, versjon 21. Wilcoxon Signed rank test ble brukt for sammenligning av data mellom avhengige grupper, mens Mann-Whitney s U test og ble brukt for sammenligning av data mellom uavhengige grupper. Grafisk fremstilling av den deskriptive statistikken ble gjort ved hjelp av boxplot som beskriver utvalgt populasjon i 5 punkter: minimum (Q1 1,5 x IQR), kvartil 1 (Q1), median, kvartil 3(Q3) og maksimum (Q3 + 1,5 x IQR), hvor IQR = (Q3 Q1). Uteliggere merkes som sirkler, mens ekstreme verdier blir fremstilt som stjerner. Ikke-lineære korrelasjoner ble undersøkt ved hjelp av Spearmans korrelasjonstest der korrelasjonen oppgis som r s. Der det var forventet lineær sammenheng ble det brukt Pearson korrelasjonstest. Alle tester var tosidige og signifikansnivå ble satt lik P< 0,05. 33

48 4 Resultater 4.1 Pasientpopulasjon I perioden februar mars 2015 ble det samlet inn fullblodprøver fra til sammen 29 nyretransplanterte pasienter som en del av MarkIt-studien, Fire av opprinnelig 33 inkluderte pasienter ble ekskludert i løpet av studien. Årsakene var henholdsvis ABO-uforlikelig transplantasjon (n = 1), ciklosporin-basert immunsuppresjon (n = 1) og avlyste transplantasjoner (n = 2). Demografiske data er oppsummert i Tabell 4. Fem pasienter mottok graft fra HLA-«identisk» søsken og fikk et legemiddelregime uten MPA. Fravær av HLAmismatch tillater legemiddelregime uten MPA. En pasient (nr. 4) ble klassifisert som «høy risiko» og dermed forbehandlet med desensibiliserende behandling med rituximab 30 dager før transplantasjon, MabThera 750 mg som engangsdose umiddelbart før transplantasjon, høydose metylprednisolon (500 mg) og humant normalt immunoglobulin (Baxter ) i 5 påfølgende dager etter det operative inngrepet. I tillegg fikk pasienten standard kvadruppel immunsuppressiv vedlikeholdsbehandling med en høyere takrolimuskonsentrasjon fra oppstart (takrolimus C µg/l dag 0-30 og 6-10 µg/l dag 30-60, deretter 3-7 µg/l) (8). En rekke pasienter fikk startdose takrolimus basert på KMI, CYP3A5-genotyping og risiko som avviket fra standarddosen, slik at pasientene kom raskere inn i anbefalt terapeutisk konsentrasjon. Deretter ble takrolimuskonsentrasjoner styrt etter konsentrasjonsmålinger. Induksjonsbehandlingen med GK bestod i de fleste tilfellene av høydose (250 mg) intravenøs metylprednisolon som ble gitt før operasjonen. For fire pasienter med vekt over 90 kg, ble det initialt administrert 350 mg. Etter transplantasjon brukes prednisolon per oralt en gang daglig. Doseringen ble vanligvis startet med 20 mg per dag og trappet deretter gradvis ned til ca. 5 mg daglig i løpet av 6 måneder i henholdt til protokoll. Ved 1-årskontrollen hadde 22 pasienter fullført nedtrappingen av prednisolon til 5 mg per dag. 34

49 Tabell 4: Demografiske og kliniske data for pasientene i MarkIt-studien Antall (prosent) Median (range) Alder ved Tx (år) 58 (20-74) Kjønn (kvinne/mann) 5/24 (17 % / 83 %) KMI (kg/m²) før Tx 25,7 (18,7-32,5) HLA- identisk donor og mottaker 5 (17 %) HLA- mismatch - Totalt >2 - DR >1 7 (0-4) 5 (0-2) Takrolimuskonsentrasjon (µg/l) - Uke 1 - Uke 6 - Uke 52 C 0 5,0 (2,5-10,6) 6,0 (3,5-10,4) 5,4 (3,2-8,8) C 1,5 10,5 (3,5-33,4) 8,3 (5,0-18,7) 9,1 (3,8-19,6) CYP 3A4*22 CYP 3A5*1 1 (3,4 %) 5 (17 %) Polyomavirus-viremi > DNA-kopier < DNA-kopier 3 (10 %) 9 (31 %) Pas. med biopsiverifisert rejeksjon 6 (21 %) egfr (ml/min/1,73m^2) - Før Tx - Uke 1 - Uke 6 - Uke 52 8 (2-16) 52 (5-100) 49 (7-100) 47 (30-90) KMI=kroppsmasseindeks. Tx=transplantasjon. egfr=estimert glomerulær filtrasjonshastighet 35

50 4.2 ABCB1- genuttrykk over tid Vi har funnet funnet store forskjeller i relativt ABCB1-genuttrykk i fullblod mellom pasientene før transplantasjon og for den enkelte pasient over tid. Median genuttrykk før transplantasjon var 0.93 (0,29-2,76, n = 29) og det var nesten 10-fold forskjell mellom pasienten med det laveste og høyeste genuttrykket. En uke etter transplantasjon var ABCB1-genuttrykket før og etter dosering henholdsvis 30,6 % og 41,3 % lavere enn før transplantasjon (P<0,001, n = 29) (figur 9). Pasientene som hadde hatt det høyeste genuttrykket før transplantasjon hadde den kraftigste reduksjonen, vist som korrelasjon mellom ABCB1-genuttrykk før transplantasjon og grad av reduksjon til nivå ved uke 1 (Pearson = 0,76). Det så også ut til å være en tendens til lavere ABCB1-genuttrykk etter dosering av immunsuppresjon, men forskjellen mellom genuttrykk før og etter dose var ikke signifikant (P = 0,062, n = 29). Median ABCB1-genuttrykk ved uke 6 var høyere enn den ved 1 uke etter transplantasjon for begge prøvetakingstidspunktene (C 0 : 0,72 versus 0,64; C 1,5 : 0,71 versus 0,54), men fortsatt signifikant lavere enn nivået før transplantasjon (P C0 <0,001, n = 29 og P C1,5 <0,001, n = 29). Ett år etter transplantasjon var ABCB1-genuttrykk ikke signifikant forskjellig fra genuttrykket før transplantasjon. Vi så derimot en økning i ABCB1 fra uke 1 til 1 år etter transplantasjon, både før dose (P<0,001, n = 28) og 1,5 timer etter dose (P<0,001, n = 29). På grunn av tekniske problemer var det ikke mulig å kvantifisere ABCB1-nivået ved t 0 for en av 1-års prøvene. 36

51 Figur 9: ABCB1-genekspresjon før transplantasjon (Pre-Tx) samt før (t 0)- og 1,5 timer etter (t 1,5) legemiddeldosering ved ca. 1, 6 og 52 uker etter transplantasjon. P a: Pre-Tx versus uke 1 t 0 og t 1,5 (P<0,001). P b: uke 1 t 0 versus uke 1 t 1,5 (P = 0,062). P c: Pre-Tx versus uke 6 t 0 (P<0,001). P d: uke 1 t 0 og t 1,5 versus uke 52 t 0 og t 1,5 (P<0,001). Pasient nr.17 hadde relativt ABCB1-genuttrykk på 2,76 før transplantasjon, noe som var i nesten 3-ganger høyere enn median genuttykk. På tidspunktet før prøvetaking hadde pasienten serumkreatinin på 1350 µmol/l og estimert GFR på 3 ml/min/1,73m 2. Pasient nr. 8 hadde 90 % lavere ABCB1-genuttrykk ved 1 uke sammenlignet med uttrykket før dose. De relative nivåene av ABCB1-genuttrykk ved 1 uke var 0,06 ved t 0 og 0,03 ved t 1,5 og lavere enn for de resterende pasientene (figur 9). Pasienten hadde i løpet av de første dagene etter transplantasjonen fått påvist moderat vaskulær og lett cellulær rejeksjon (klassifisert som Banff 2B) og var under rejeksjonsbehandling ved tidspunktet for prøvetaking. Behandlingen bestod av en kombinasjon med metylprednisolon (dag 1: 500mg, dag 2: 250mg, dag 3: 500mg, dag 8: 125mg) og ATG (dag 3: 200mg, dag 8: 200mg). 37

52 4.3 Leukocytter Det var store forskjeller i leukocyttkonsentrasjon mellom pasientene (< 4-folds variasjon). Leukocyttkonsentrasjonen endret seg også i løpet av det første året etter transplantasjon (figur 10). Pasientene hadde signifikant høyere leukocyttkonsentrasjon 1 uke etter transplantasjon sammenlignet med nivåer før transplantasjon med henholdsvis median 8,9 x 10 9 celler/l versus 6,9 x 10 9 celler/l (P<0,001, n = 23). Leukocyttkonsentrasjonen ble deretter gradvis redusert og var ved uke 52 på nivå med konsentrasjonen før transplantasjon (figur 10). Pasient 7 og 28 hadde ved uke 1 etter transplantasjon to høyeste verdier av leukocytter (>12,5 x 10 9 celler/l). På samme tidspunkt hadde disse pasientene detekterbare mengder polyomavirus som for pasient nr. 7 var av klinisk betydning. Informasjon om leukocyttkonsentrasjon manglet for til sammen seks prøver. Det var ingen signifikant korrelasjon mellom leukocyttkonsentrasjon og ABCB1-genuttrykk i fullblodprøver for de ulike tidspunktene etter transplantasjon. Det så imidlertid ut til å være en tendens til et inverst forhold mellom ABCB1-genuttrykk og leukocyttkonsentrasjoner i pasientpopulasjonen (figur 10). 38

53 Figur 10: Leukocyttkonsentrasjon (x 10 9 celler/l) før transplantasjon (Før-Tx) samt ved ca. 1, 6 og 52 uker etter transplantasjon. P a: Før-Tx versus uke 1 (P<0,001). P b: uke 1 versus uke 6 (P = 0,045). P c: Før-Tx versus uke 6 (P = 0,016). P d: Uke 1 versus uke 52 (P = 0,001). 4.4 Farmakogenetikk med relevans for takrolimus Fem pasienter var heterozygote for CYP3A5*1-allelet som gir uttrykk av funksjonelt CYP3A5-enzym. En av disse pasientene var også heterozygot for CYP3A4*22-allelet. De øvrige pasientene var homozygote for CYP3A5*3 og CYP3A4*1. Pasient nr. 24 var tidligere stamcelletransplantert og ble derfor ekskludert fra genotypeanalysene. Median dosenormalisert takrolimuskonsentrasjon før dose var 44 % lavere blant pasienter med funksjonelt CYP3A5-enzym sammenlignet med pasienter uten CYP3A5 (median 0,1 vs. 0,18, P = 0,013, n = 28) (figur 11). Tilsvarende konsentrasjon var 43 % lavere for pasienter med (*1/*3) versus uten (*3/*3) funksjonelt CYP3A5-enzym (median 0,24 vs. 0,42, P = 0,016, n = 28) (figur 11). 39

54 Figur 11: Dosenormalisert takrolimuskonsentrasjon før dose (C 0) og 1,5 timer etter dose (C 1,5) 1 uke etter transplantasjon for pasienter med og uten CYP3A5*1-allel. Dypsekvenseringen viste at hver pasient hadde rundt 100 sekvensvarianter i ABCB1-genet. Ingen av genvariantene så ut til å påvirke leserammen, mrna-spleising eller start- /stoppkodon. Videre analyser fokuserte derfor på de tidligere rapporterte ABCB1-variantene c.1236t>c, c.2677t>g og c.3435t>c. Genotypene for de ulike posisjonene er oppsummert i Tabell 5. 40

55 Tabell 5: Fordeling av ABCB1-genvariantene i MarkIt-populasjonen (n = 28*). Genvariant Antall pasienter c C/C - C/T - T/T c G/G - G/T - T/T c C/C - C/T - T/T * Stamcelletransplantert pasient er ekskludert fra analysen av dypsekvensering ABCB1 sekvensvarianten c.1236t>c var assosiert med takrolimuskonsentrasjon i fullblod 1,5 timer etter dose ved 1 uke etter transplantasjon (P = 0,031, n = 28). En uke etter transplantasjon hadde pasienter med ABCB1 c.1236 C/C og C/T genotyper median C 1,5 på 20,2 µg/l (fra - til) versus median 8,1 µg/l blant pasientene med T/T genotype (figur 12A). Det tilsvarer 60 % høyere gjennomsnittlig fullblodkonsentrasjon for bærere av T/T-varianten. Høy-risiko pasientens C 1,5 nådde 33,4 µg/l. Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i takrolimus C 0 mellom genotypegruppene, men T/T-genotype gir noe høyere konsentrasjonsnivå enn C/T og C/C genotyper ved uke 1, som vist i figur 12A (median 5,3 µg/l vs. median 5,0 µg/l, P = 0,398, n = 28). Separat analyse av de 23 pasientene uten funksjonelt CYP3A5-et viste en lignende tendens med høyere takrolimus C 1,5 for pasientene med ABCB1 c.1236 T/T genotype (P = 0,052, n = 23) (figur 12B). Det er observert nesten 4-folds økning i takrolimuskonsentrasjoner fra C 0 til C 1,5 for ABCB1 c.1236 T/T og i undekant av 2-folds økning fra C 0 til C 1,5 for C/T eller C/C (P= n.s., n = 28). 41

56 Figur 12: Takrolimuskonsentrasjoner før dose (C 0) og 1,5 timer etter dose (C 1,5) ved uke 1 blant pasienter med ABCB1 c.1236 T/T og C/T eller C/C genotyper. A: Pasientpopulasjonen med alle CYP3A5-alleler. B: Pasientpopulasjonen ekskludert bærere av CYP3A5*1-allelet. Etter dosekorreksjon og eksklusjon av pasienter med kjent avvikende dosering eller metabolisme (CYP3A5, høy KMI, høy immunologisk risiko, pågående rejeksjonsbehandling) var det imidlertid ingen signifikant forskjell mellom pasienter med ABCB1 c.1236 T/T (n = 5) og C/T eller C/C genotyper (n = 16, P C0 = 0,130 og P C1,5 = 1,0). 4.5 Polyomavirus-viremi Vi har i denne pilotstudien sett på alle tilfeller polyomavirus-viremi over deteksjonsgrensen. I løpet av det første året etter nyretransplantasjon, opplevde ni pasienter polyomavirus-viremi av ulik grad. Den laveste mengden DNA-kopier av polyomavirus registrert var <230 per ml, mens den høyeste DNA-kopier per ml. Det ble i alle tilfellene påvist BKV. Tre av pasientene fikk i tillegg påvist JCV. Blant pasientene med polyomavirus-viremi oppstod viremien i 7 av 9 tilfeller mellom 8-25 uker etter transplantasjon, definert i oppgaven som et tidspunkt nærmere uke 6. To pasienter utviklet viremi nærmere uke 52. Det ble funnet signifikant forskjell i ABCB1-genuttrykk før dose mellom pasienter uten viremi og de ni pasientene med enten BKV eller JCV (median 0,86 vs. 0,56, P = 0,008, n = 29) 6 uker etter transplantasjon. Høy-risikopasienten hadde det høyeste ABCB1-genuttrykket som 42