Immunstimulanter for potensiering av torskens naturlige immunsystem

Transkript

1 Store programmer HAVBRUK - En næring i vekst Faktaark Immunstimulanter for potensiering av torskens naturlige immunsystem Prosjekt: Immunostimulation of Atlantic cod (Gadus morhua L.) larvae Immunstimulanter som beta-1,3-glukan og polymannuronsyrealginat ga bedre overlevelse og vekst i tørrfôrtilvenningsfasen. Baktericidalt permeabilitetsøkende protein (BPI) er et molekyl i det naturlige immunforsvaret hos torsk. Glukan og alginat ga økt syntese av dette molekylet i de fleste organer som ble studert. Bakgrunn og mål: Antimikrobielle peptider/proteiner er viktige komponenter i forsvaret mot mikrobielle infeksjoner. Baktericidalt permeabilitetsøkende protein (Bactericidal permeabilityincreasing protein, BPI) er et antimikrobielt peptid som tilhører lipopolysakkarid (LPS)- bindende proteinfamilien. BPI er en viktig del av det naturlige (innate) immunforsvaret mot Gram-negative bakterier. Potensialet til det naturlige immunsystemet er en hurtig, sterk og ikke-spesifikk respons mot en rekke patogener. LPS, beta-glukaner og polymannuronsyrealginat spiller en viktig rolle i aktiveringen av det naturlige immunsystemet. Oppdrett av torsk ligger i startgropen. Yngelproduksjonen er i dag preget av høy dødelighet som til dels er forårsaket av opportunistiske bakterier. For å redusere dødeligheten kan en mulig strategi være å stimulere det uspesifikke immunsystemet. Prosjektets mål var å undersøke de to immunstimulantene, β-1,3-d-glukan (chrysolaminaran isolert fra marine diatomeer) og polymannuronsyre alginats innvirkning på forskjellige immunparametre, vekst og overlevelse. Resultater: Immunstimulering av torskelarver ved forskjellige agens. Undersøkelse av vekst, overlevelse og mikrobiologi Rotatoriene; levende fôr ble anriket med immunstimulantene (chrysolaminaran og polymannuronsyre alginat) og tilført torskelarvene på forskjellige tidspunkter etter klekking. Larvene ble tilvent tørrfôr fra dag 18 og forsøkene varte i 4 uker. Den tidlige tørrfôrtilvenningen ga kraftig redusert vekst og økt dødelighet. Larver som fikk tilført glukan ga fortsatt vekst i tørrfôrtilvenningsfasen samt bedre overlevelse enn kontrollfisk (Figur 1). Også polymannuronsyre alginat hadde positiv effekt på overlevelsen (Figur 1). Det ble ikke funnet økt uttrykk av BPI i torskelarver etter administrasjon av levende fôr med inkorporert alginat eller beta-glukan, men det ble funnet økt overlevelse av larver ved tilvenning til tørrfôr etter at larvene hadde vært fôret på alginat/beta-glukan. I tillegg viste larvene som fikk beta-glukan bedre vekst (Figur 1). Larver som fikk beta-

2 glukan og alginat hadde et konstant innhold av bakterier i tarmen, mens de ikkestimulerte larvene hadde økt bakterietall. Figur 1. Overlevelse, daglig vektøkning, relativ overlevelseskurve og vekst hos torskelarver gitt Høy-M alginat (MA), glukan fra en marin diatome (CM) og i kontrollgruppen (Skjermo et al., 2006). Immunstimulering av voksen torsk. Analyse av BPI genekspresjon etter stimulering med beta-1,3-d-glukan og polymannuronssyre alginat Torsk ble injisert intraperitonealt med β-1,3-d-glukan (4 mg) og polymannuronsyre alginat (4 mg), kun 0.5 ml fosfatbufret saline (PBS) som kontroll og 5 fisk pr gruppe. Etter forskjellige tidspunkter ble fisken avlivet og blod ble lagt på lysisbuffer, mens nyre, milt, lever og hjerte ble lagt på RNA later. I tillegg ble blod frosset ved -80 o C. RNA ble isolert, cdna syntetisert og kvantifisert ved real-time PCR. Studiet har også inkludert kloning og evaluering av flere housekeeping gener som kontroller (18S, GAPDH, Cyclophilin A, og b-actin). Vi fant at 18S og cyclophilin var de beste kontroller i vårt system. Immunstimulering av torsk (ca. 100 g) ved intraperitoneal injeksjon ga økt uttrykk av BPI i blodet og dette uttrykket var størst 2 dager etter stimulering (Figur 2). Beta-1,3-Dglukan ga en høyere stimulering enn polymannuronsyre alginat. Både 18S og cyclophilin A ble brukt som housekeeping gener og disse ga omtrent samme relative stimuleringsuttrykk.

3 400 (n=5) Rel ati ve lev el of BPI /LB P mr NA Control β-glucan Alginate Control β-glucan Alginate Control β-glucan Alginate Day Day Day Figur 2. Uttrykk av BPI i blod hos torsk til forskjellige tidspunkter etter intraperitoneal injeksjon av β-1,3-d-glukan og polymannuronsyre alginat. Figur 3 viser at intraperitoneal injeksjon av beta-1,3-d-glukan resulterte i en kraftig stimulering av BPI produksjon i blod 2 dager etter injeksjon. Det var en viss variasjon mellom de 5 forskjellige individene (snitt 157.5). Figur 3. Uttrykk av BPI i blod (målt mot 18S og cyclophilin A). Torsk (ca. 100 g) ble injisert intraperitonealt med β-1,3-d-glukan. Etter 2 dager ble blodet høstet og analysert for uttrykk av BPI.

4 Uttrykk av BPI i lever, hjerte, milt og nyre (målt mot 18S). Det var også økt uttrykk av BPI i organer som lever, hjerte, milt og nyre med relative gjennomsnittsverdier på henholdsvis 48.6, 30.0, 13.9 og 5.7. Figur 4 viser uttrykk av BPI i blod i torsk etter intraperitoneal injeksjon av polymannuronsyre alginat 2 dager etter injeksjon. Som figuren viser, var det meget store individuelle variasjoner i uttrykk av BPI. Nivået av BPI uttrykk etter alginatstimulering (21.4) var lavere enn ved beta-1,3-d-glukanstimulering. Figur 4. Uttrykk av BPI i blod (målt mot 18S og cyclophilin A). Torsk (ca. 100 g) ble injisert intraperitonealt med polymannuronsyre alginat. Etter 2 dager ble blodet høstet og analysert for uttrykk av BPI. Uttrykk av BPI i lever, hjerte, milt og nyre ble målt mot 18S. Uttrykk av BPI i lever (snitt 135.4) var høyere enn i blod og lavt i hjerte (snitt 14.7) etter alginatstimulering og lavere enn ved glukanstimulering. Det var ubetydelig stimulering av BPI uttrykk i milt (snitt 2.1) og nyre (snitt 2.7) ved alginatstimulering. Analyse av naturlige ( innate ) forsvarsgenekspresjon etter immunstimulering Analyse av uttrykk av innate forsvarsgener etter in vivo stimulering innbefattet kloning og evaluering av forskjellige housekeeping gener som kontroller: I vårt system har 18S og cyclophilin A vært de beste kontrollene. Analysen ble etablert i samarbeid med prosjektet Marine biomolecules; properties and mechanisms for kvantifisering av nivået av BPI/LBP mrna i voksen fisk etter injeksjon av bakterier. Det ble forsøkt å finne sekvenser for tumor nekrose faktor alfa (TNF-α), transferrin og komplementfaktor C3. Fra et tidligere/pågående prosjekt ble sekvensen for BPI funnet. Det lyktes ikke å finne sekvenser for TNF-α og transferrin ved såkalt PCR-basert homologikloning. Derimot ble komplementfaktor C3 identifisert ved såkalt heterolog hybridisering av et lever cdna bibliotek med en DNA-probe av steinbit C3. Ved

5 sekvensanalyse av et større antall kloner ble det funnet 3 ulike C3-varianter. Disse er foreløpig ikke fullstendig sekvenserte. Det ble etablert spesifikke realtime-pcr assays for hver av disse og uttrykket ble undersøkt i lever hos torsk ved ulike tidspunkt etter injeksjon av bakterier (Figur 5). Her ble det ikke funnet noen klar økning i C3-uttrykket som følge av bakterieinjeksjonen (Figur 5). Heller ikke i andre organer ble det sett en økning. De tre variantene lavt, middels og høyt uttrykk av C3 var imidlertid uttrykt hos alle individer, noe som tyder på at det her er tre ulike isotyper av torsk C3 framfor tre alleler. Det ble videre etablert et kvantitativt realtime-pcr assay for torsk Toll-liknende reseptor 1 (TLR-1) i samarbeid med et annet pågående prosjekt. Heller ikke dette genet så ut til å bli indusert ved immunstimulering h 3h 6h 12h 1d 2d h 3h 6h 12h 1d 2d h 3h 6h 12h 1d 2d Figur 5. Uttrykk av 3 ulike C3 varianter (C3#2, C3#6, C3#15) i lever hos torsk til forskjellige tidspunkter etter intraperitoneal injeksjon av døde Vibrio anguillarum bakterier (bakterier: lysgrønne søyler, kontroll: mørkegrønne søyler). Metodikk for karakterisering av bakteriesamfunn i larver basert på PCR av 16S rdna ble forsøkt brukt til å karakterisere forskjeller. Selv om det er påvist og publisert klare forskjeller mellom ulike behandlingsregimer, var det ikke mulig å påvise forskjeller i bakteriesamfunnet som respons på immunstimulering i det materialet som ble undersøkt. Nytteverdi og anvendelse: Oppdrett av torsk ligger i startgropen. Yngelproduksjonen er i dag preget av høy dødelighet som til dels er forårsaket av opportunistiske bakterier. For å redusere dødeligheten kan en mulig strategi være å stimulere det uspesifikke immunsystemet. Glukan fra mikroalger ser ut til å ha en struktur som gjør det egnet som immunstimulant i torsk. Dette prosjektet har vist at glukan i fôr har potensiale til å gi økt overlevelse og vekst i en kritisk fase i livet til torsken.

6 Ny metodikk for karakterisering av mikrobielle samfunn tilknyttet larvers tarm og effekter av ulike anrikningsmedier på mikrobielle samfunn tilknyttet arvens tarm er utviklet. Metodikken er basert på PCR av 16S rdna fra hele bakteriepopulasjoner og vil kunne brukes i målinger av bakteriesamfunnets respons på ulike behandlinger /120 Ansvarlig: Norges fiskerihøgskole, Universitetet i Tromsø Prosjektleder: Jarl Bøgwald Kontaktperson: Jarl Bøgwald, Norges fiskerihøgskole, Universitetet i Tromsø Adresse: Breivika, 9037 Tromsø Telefon: jarlb@nfh.uit.no Lenker: Samarbeidende institusjoner: SINTEF, Havforskningsinstituttet i Bergen