Bruk av genteknologiske analyser ved diagnostikk av luftveisinfeksjoner. Gardermoen Svein Arne Nordbø

Transkript

1 Bruk av genteknologiske analyser ved diagnostikk av luftveisinfeksjoner Gardermoen Svein Arne Nordbø

2 Aktuelle genteknologiske metoder Hybridiseringsmetoder Ampifikasjonsmetoder PCR Konvensjonell Nested Multiplex Real-time NASBA SDA TMA Microarray

3 Amplifikasjonstester Meget sensitive og spesifikke metoder Kontaminasjonsfare dutp/ung Internkontroll Spiking med fremmed DNA/RNA før ekstraksjon Egne primere (separat kjøring/multiplex) Tilsetting av internkontroll til PCR-mix Samme primere som målsekvensen Deteksjon av housekeeping genes

4 Real-time PCR Like sensitiv som nested PCR Meget god reproduserbarhet Betydelig raskere enn konvensjonell PCR Semikvantitativ metode Automatisert deteksjon med fluoroforer Betydelig bedre presisjon og mye større dynamisk område for kvantitative analyser Egner seg godt for multiplex PCR

5 Real-time PCR: SYBR green

6 Real-time PCR: Hybridiseringsprober (FRET)

7 TaqMan probe

8 Molecular beacons

9 Molecular beacons

10

11 Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) Primer 1 RT 3 RNase H Primer 2 RT Primer T7 RNA Polymerase Cyclic Phase RT RNase H Primer 1 5 RT

12 Strand Displacement Amplification (SDA) ssdna with restriction site Amplification primer binds DNA polymerase extends primer dsdna with restriction sites

13 Transcription-Mediated Amplification (TMA)

14 Focus on Technology Microarray & DNA Chips What are the steps? [1] Choose cell population [or sample for diagnosis] [2] RNA extraction, purify [3] Fluorescent label cdna [4] Hybridize with PROBE on Microarray or DNA Chip [5] Scan [6] Interpret image

15 Prøvemateriale Nasofaynksaspirat Nese/halsprøve Bronkialaspirat Annet materiale fra luftveiene Serum/plasma Fæces Urin

16 Nukleinsyreekstraksjon Evt. forbehandling av prøven Manuell ekstraksjon Automatisert ekstraksjon Separat DNA eller RNA ekstraksjon Kombinert DNA/RNA ekstraksjon (Boom) Sensitiviteten avhengig av prøvevolum og elueringsvolum

17 cdna syntese (RNA/RT-PCR) Random primers Evt. tilsetting av spesifikk primer Separat trinn eller kombinert med PCRkjøringen?

18 The study shows that after the onset of symptomatic respiratory infection enterovirus RNA may take 2 3 weeks and rhinovirus RNA 5 6 weeks to disappear from nasal mucus.

19 Luftveisprosjekt ved St. Olavs Hospital 27 n = 857 Rhinovirus-RNA ble påvist i 196 prøver (22,9%). Median Ct-verdi 31,1 Rhinovirus påvist i cellekultur i 8 prøver (,9%) I 13 av prøvene (52,6%) ble kun rhinovirus-rna påvist Resten av prøvene inneholdt 1-5 andre agens påvist med PCR

20 Luftveisprosjekt ved St. Olavs Hospital 27 (rhinovirus positive prøver n=196) Entero 24 B. pertussis 2 Bocavirus 23 Para 3 2 Adenovirus 22 P. jiroveci 2 CMV 11 Para 2 2 RSV 11 Para 1 1 Metapneumovirus Cororona OC43 HHV-6 EBV Parechovirus B. parapertussis C. pneumoniae Corona 229E HSV 1 og 2 Corona NL63 4 Influensa B Influensa A 3 Legionella

21 Luftveisprosjekt ved St. Olavs Hospital 27 Kontrollgruppe (barn til elektiv kirurgi n=6) 3 av prøvene (5%) inneholdt rhinovirus- RNA! Median Ct-verdi 33,8 13 av disse prøvene (43%) var rhinovirus- RNA alene positive 17 av prøvene (57%) inneholdt 1-3 andre agens (PCR positive) 14 av kontrollprøvene (23%) var PCR negative for alle agens

22 Luftveisprosjekt ved St. Olavs Hospital 27 Kontrollgruppe (barn til elektiv kirurgi n=6) 17 av 3 av rhinovirus-rna positive prøver inneholdt følgende agens Adenovirus (n=8) Enterovirus (n=8) Bocavirus (n=6) Coronavirus OC43 (n=1)

23

24

25 Journal of Clinical Virology 41 (28) 45 48

26 Journal of Clinical Virology 41 (28) The median time interval between NPAs taken at admission and discharge was 7 (2 15) days, while the median interval between admission and the first medical visit after discharge was 21 (17 29) days.

27 Clinical Infectious Diseases 27; 44:94 1

28 Clinical Infectious Diseases 27; 44:94 1

29 (35,7%) (9,5%) Allander et al., Clinical Infectious Diseases 27; 44:94 1

30

31

32 Ukesoversikt luftveisagens 27 Uke 6 8 Uke 7 8 Uke 8 8 Positive Negative Positive Negative Positive Negative Positive Negative Adenovirus Bordetella pertussis Chlamydia pneumoniae Coronavirus OC Coronavirus NL Coronavirus 229E Enterovirus Humant bocavirus Humant metapneumovirus Influensavirus type A Influensavirus type B Mycoplasma pneumoniae Parainfluensavirus type Parainfluensavirus type Parainfluensavirus type Respiratorisk syncytialt virus (RS-virus) Rhinovirus Publisert:

33 (4,9%) (4,3%)

34

35 Fordeler ved en bred screening på luftveisagens Gir en god oversikt over den aktuelle epidemiologiske situasjonen Sjansen for å finne etiologisk agens øker Treffsikkerheten på etterrekvirerte analyser øker Nyttig korrektiv til tolkningen av serologiske tester Nyttig tilbakemelding for klinikerne Kan redusere antibiotikaforbruket

36 Ulemper ved en bred screening på luftveisagens Meget ressurskrevende Tolkningen kan være problematisk

37

38