Nye krav til sensitivitet ved kvantitering av HCV

Transkript

1 Nye krav til sensitivitet ved kvantitering av HCV Har det konsekvenser for laboratoriet? Mette Lundstrøm Dahl Mikrobiologisk avd. Sykehuset i Vestfold HF

2 Bakgrunn Kvalitativ HCV RNA PCR fra Roche siden 1995 Prøver til kvantitering og genotyping sendes til mikrobiologisk avdeling på Ullevål Lenge ønske fra infeksjon om kvantitativ test på SiV Beholde HCV-diagnostikk her eller sende alt eller noe fra oss? Fortsette med kvalitativ test eller gå over til kvantitativ? 2

3 Hvorfor ikke bare fortsette som før? To gode grunner for å bestemme seg litt raskt 1. Fikk beskjed fra Roche om at testen på Cobas Amplicor skulle fases ut innen utgangen av 2013 HVA NÅ? 2. Nye anbefalinger om sensitivitet etter innføring av nye behandlingsregimer Høy sensitivitet viktig for å kunne karakterisere virologisk respons Stoppregler for behandling viktig med raske svar! 3

4 Hepatitt C Virus Familie = Flaviviridae Genus = Hepacivirus Et enkelttrådet, positivsense RNA virus 11 genotyper (genotype 1-6 vanligst) Mennesket er naturlig reservoar for HCV Sjimpanser har blitt smittet eksperimentelt; zoonoser ikke beskrevet 4

5 Hepatitt C Virus I den aktive infeksjonsfasen produseres 10 trillioner nye viruspartikler pr. dag! Viruset inneholder 9,6 kb Koder for et polyprotein på ca 3000 aminosyrer Prosesseres videre til ti mindre proteiner Prosessen foregår på endoplasmatisk reticulum (rer) hos vertscellen 5

6 Hepatitt C Virus Husverten (f.eks Ola Nordmann) sørger for produksjon av virale proteiner. Ribosomene hos verten leser virusets RNA Kun en kort RNA-sekvens er nødvendig vanskeligere for immunsystemet å beskytte seg vanskeligere å utvikle effektiv behandling. Å forstå prosessene er viktig for utvikling av effektive antivirale midler ANGREPSPUNKTER? 6

7 7

8 Hepatitt C virus RNA-virus mangler reparasjonsmekanismer Får i snitt 1 feil pr nukleotider for hver deling = høy mutasjonsrate! Fører til antigen drift utvikling og etablering av nye stammer immunsystemet ikke kjenner igjen Antigen drift kompliserer behandlingen fordi angrepspunktene kan endres Testene likevel stabile Primere rettet mot 5 UTR et område nødvendig for replikasjon og koordinering av viral proteinsyntese 8

9 Diagnostikk med NAT HCV NAT (PCR) anses som gullstandard RNA kan detekteres så tidlig som 1 uke etter smittetidspunkt HCV NAT viktig for å kunne kvantitere mhp behandling Alle testene påviser genotype 1-6 Spesifisitet opp mot 99 % De kvantitative testene har etter hvert blitt ultrasensitive Muligheten for høy sensitivitet har resultert i at det stilles helt andre krav til testene mhp behandling enn tidligere 9

10 Standardisering av målebenevnelser Kvantitative verdier ble tidligere utgitt med ulike benevnelser WHO utviklet en internasjonal standard, og verdier utgis nå i IU/ml Hvor mange kopier/ml, dvs. antall virus, det er i 1 IU/ml varierer noe fra test til test Standardisert, kvantitert kontrollmateriale kan fås fra NIBSC /product_catalogue.aspx 10

11 HCV kommersielle tester og instrumenter Leverandør Test Instument Qiagen Qiagen artus HCV QS-RGQ Qiasymphony Roche Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HCV Abbott Abbott RealTime HCV Abbott m2000 AmpliPrep + Taqman48 Kommer på Cobas 4800 og Cobas 6800 (4. kvartal 2014) Siemens Versant kpcr Versant kpcr molecular system sample prep (SP)- og amplifiserings- /deteksjonsmodul (AD) Gen-Probe Real-time TMA Kommer på Panther mulig 4. * Mulig lansering i slutten av 2014 kvartal

12 Limit of Detection og Limit of Quantification LoD = Limit of Detection: Deteksjonsgrense; lavere nivåer enn dette kan man ikke regne med at testen påviser. LoQ = Limit of Quantification: Praktisk sensitivitet den kvantitative verdien skal være pålitelig (dynamic range) LLoQ = Lower Limit of Quantification HLoQ = Higher Limit of Quantification 12

13 EASLs anbefalinger til sensitivitet European Association for the Study of the Liver (EASL) har utarbeidet EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection Sier at testene skal ha LoD <50 IU/ml, men at for behandling er det anbefalt at testene har LoD IU/ml I følge pakningsvedleggene (U.S. Approval) til de antivirale midlene Telaprevir og Boceprevir anbefales det at LoD er IU/ml og LLoQ <25 IU/ml. I de samme pakningsvedleggene står det at (oversatt) Et bekreftet detekterbart, men under LoQ, HCV RNA resultat skal ikke vurderes som et negativt resultat. Det bør da i praksis være greit å forholde seg til LoD siden det er Detectable og Non-detectable som får følge for stopp av behandlingen 13

14 LoD og LoQ for ulike kommersielle tester

15 Behov for enda bedre sensitivitet? Trenger vi enda høyere sensitivitet? F. eks. 10 IU/ml? 2? 1? Når er en prøve egentlig negativ - må den være fri for virus? Kan ulike tester gi forskjellige konsekvenser for behandling? Hvordan påvirker det videre behandling (stoppregler)? Hvis LoD=20 IU/ml kontra LoD=12 IU/ml. Den med lavest LoD vil kunne påvise HCV i flere tilfeller enn den med høyest, og dermed vil man kanskje behandle ulikt i de to tilfellene? Eller kanskje vi ikke trenger kvantitering i samme grad når det kommer enda nye medikamenter f.eks interferon-frie? 15

16 Framtidens tester? LAMP-teknologi Loop-mediated isothermal amplification Potensiale til å utvikles til bruk i pasientnær analysering Kombinasjon av LAMP og mikrochip tar i bruk <1 μl prøvemateriale og er ferdig på en time. Nanopartikkelbasert diagnostiske tester Quantum dots (QD) Gullnanopartikler Aptamerer Korte enkelttrådige oligonukleotider Kan lage 3D-strukturer som kjenner igjen molekyler, proteiner og celler 16

17 Kilder Ogawa E., et.al Early phase viral kinetics of chronic hepatitis C patients receiving telaprivir-based triple therapy: A comparison of two real-time PCR assays. Antiviral Research 99, Carrere-Kremer, S. et.al Regulation of Hepatitis C Virus Polyprotein Processing by Signal Peptidase Involves Structural Determinants at the p7 Sequence Junctions The Journal of Biological Chemistry, 279, Kamili S., et.al Laboratory Diagnostics for Hepatitis C Virus Infection. Clinical Infectious Diseases 55(S1), EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology 2011 vol. 55 j Armbruster D. et.al Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clin Biochem Rev Vol 29 Suppl (i), UpToDate HCV Pepsi Project - lest lest lest