KJ2022 Kromatografi Oppsummering av pensum

Transkript

1 KJ2022 Kromatografi Oppsummering av pensum Audun F. Buene 4. mai 2013

2 Innhold 1 Teori om kromatografi Retensjonsparametre Sonespredning van Deemter-ligningen Kolonnematerialet Væske-væske-fordelingskromatografi (LLC) Adsorpsjonskromatografi Krefter Adsjorpsjonsmiddelet Tynnsjiktkromatografi (TLC) Organiske polymere adrorpsjonsmidler Elueringsmiddelet Analyttens innvirkning Temperaturens innvirkning Tørrkolonnekromatografi Lavttrykk og Flash kolonnekromatografi Gasskromatografi (GC) GSC GLC Analyser ved hjelp av kromatografi Kvalitative analyser Kvantitative analyser Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) 26 6 Ionebytterkromatografi (IEC) 28 7 Elektroforese (EF) Teori Varmeutvikling

3 7.3 Elektroosmose Effektivitet og oppløsning Viktige elektroforesemetoder Superkritisk fluid kromatografi (SFC) 35 9 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Elueringsmiddelet Systemets oppbygging Kolonnen Detektorer for HPLC Solvofobe interaksjoner Spesielle kolonnetyper Kobling med MS Forkortelser i KJ

4 1 Teori om kromatografi 1.1 Retensjonsparametre Separasjon skjer som følge av at forskjellige stoffer har forskjellig retensjon. Retensjonen kommer av hvor lang tid et stoff bruker i mobilfasen i forhold til hvor lenge det er i stasjonærfasen. Fordelingskoeffisienten for dette kan oppgis som: K C (X) = Retensjonsfaktoren k for en analytt oppgis som C s,x C MF,X (1.1) k X = W s,x MF, X = C S,X V S C MF,X V MF = K C V S V MF (1.2) Et annet mål på retensjon er retarderingsfaktoren R, som kan uttrykkes som: R = Mengde X i MF Mengde X totalt = C MF,X V MF C MF,X V MF + C S,X V S (1.3) Retensjon i TLC beregnes med R F -verdier, som er et tall som beskriver graden av retensjonen til en flekk eller et bånd. R F (X) = L X L MF (1.4) hvor L X og L MF er vandringslengdene til henholdsvis analytten X og elueringsmiddelet. For å kunne beskrive akkurat hvor separert to stoff er, kan man beregne separasjonsfaktoren α: α = k 2 = t R2 t M F k 1 t R1 t M F (1.5) 1.2 Sonespredning Sonepredning er noe man ønsker å ha minst av i kromtografi. Det gjør at topper flyter over i hverandre, og separasjonen blir dårlig. Effektivitet og sonespredning er 4

5 derfor omvent korrelert. Platetallet N er et mål på effektiviteten av separasjonen, og kan regens ut på flere måter: N = ( tr σ t ) 2 = 16 ( tr w b ) 2 = ( tr w h ) 2 (1.6) hvor t R er retensjonstiden til en analytt, w b er baselinjebredden av toppen, og w h er halvhøyden av toppen. Direkte fra platetallet kan man finne platehøyden H, som også er et mål på kolonnens effektivitet hvis man ser bort fra kolonnens lengde, L. H = L N (1.7) Man kan også komme borti at det er brukt effektive platetall og platehøyder. Den eneste forskjellen er at da har man benyttet justerte retensjonstider, som vil si at t R = t R t 0. Da får man N eff og H eff. Oppløsningen R S mellom to separerte topper kan beregnes. Dette gjøres ved å ta avstanden mellom toppene, og dividere på den gjennomsnittlige baselinjebredden til de to toppene. I Figur 1.1 er dette illustrert. R S = t 2 t (w b,1 + w b,2 ) (1.8) Figur 1.1: Illustrasjon av hvordan man måler oppløsningen mellom to topper i et kromatogram. Det er flere måte å oppgi oppløsningen på, og her er noen flere formler som kan 5

6 brukes: R S = 1 4 N eff α 1 α = 1 4 (α 1) N k 1 + k (1.9) Når R S = 1 tilsvarer det omtrent 3 % overlapp mellom de to toppene, og hvis R S = 1.5 regnes det som fullstendig baselinjeseparasjon. En topp kan være svært asymmetrisk, og dette kan føre til at det blir vanskelig å bestemme riktige retensjonsparametere. For å kunne kvantifisere hvor asymmetrisk en topp er, er asymmetrifaktoren definert: A S = b a (1.10) hvor a og b er avstandene fra senter og ut til henholdsvis venstre og høyre side av toppen, ved 10 % av topphøyden. Dersom A S = 1 betyr det at det er en perfekt symmetrisk topp, men om den er <1 betyr det fronting, og >1 indikerer tailing. Figur 1.2: Asymmetrifaktor for en topp i et kromatogram. 1.3 van Deemter-ligningen Den forenklede van Deemter-ligningen kan settes opp som: HET P = A + B u + C u (1.11) hvor A kommer fra eddy diffusjon, B er fra longitudinal diffusjon, C er fra massetransport og u er lineær gjennomsnittlig strømningshastighet. Leddet fra eddy diffusjon kan skrives som A = c e d p, hvor c e er en proporsjonalitetsfaktor og d p er partikkeldiameteren av pakningsmaterialet. Longitudinalleddet kan forklares ved B = c L D M u u MF, hvor c L er en proposjonalitetsfaktor og D M er diffusjonskonstanten til 6

7 analytten i løsningsmiddelet. Massetransportleddet betegnes også ofte som motstand mot massetransport, og kan utdypes som C u = c MT d 2 p u MF D M proporsjonalitetskonstant., hvor c MT er en Siden van Deemter-ligningen har en variabel, u MF, er det enkelt å plotte de forskjellige leddene som funksjon av strømningshastigheten. Figur 1.3: De forskjellige leddene i van Deemter-ligningen. Det er tydelig at denne ligningen vil nå en optimal platehøyde ved en viss strømningshastighet. 1.4 Kolonnematerialet Pakkematerialet er svært viktig med tanke på å begrense sonespredningen. Det er særlig to egenskaper ved pakkematerialet som er viktig, og det er formen og størrelsen av pakkepartiklene. Små homogene partikler gir ofte best separasjon og høyest effektivitet. Dette kommer av at små partikler ofte er enklere å pakke tett, og at like store partikler gir tilnærmet like lange strømningsveier gjennom kolonnen. Det finnes mange typer pakningsmaterialer. Helt porøse partikler gir stor effektivitet til en liten penge, men dersom de er svært inhomogene kan de bli vanskelige å pakke tett nok. Overflateporøse partikler vil være f.eks. glasskuler belagt med et tynt lag stasjonærfase. Dette gjøres fordi det er en begrensning på hvor langt inn i 7

8 partikkelen prøvepartiklene faktisk diffunderer. Disse er enkle å pakke, tåler fysisk mye, men de har ikke så høy kapasitet. I det siste er det funnet et nytt pakkemateriale brukt særlig i HPLC og UHPLC. Dette består av svært små partikler (1.5-3 µm), som har en kjerne av fused silika og en stajsonærfase på utsiden. For makromolekyler som analyserer med HPLC kan man bruke kolonnepakningsmateriale som er kompakte sfæriske kuler med størrelse rundt 2 µm. Dette kan lønne seg, siden store molekyler vil diffundere svært sakte, og ikke egentlig trenger porøse overflater på pakkematerialet. Gjennomstrømningsmedia er en fellesbetegnelse på pakkemateriale hvor hele væskestrømmen passerer gjennom makroporer i pakkematerialet. Store partikler med makroporer og mikroporer i kombinasjon, membranfilterstabler og støpte monolittkolonner er eksempler på dette. Monolittkolonnene er veldig greie, med sin ikke-regulære struktur, men de kan løsne fra kolonneveggen, og da dannes kanaler med en gang og kolonnen er ødelagt. 1.5 Væske-væske-fordelingskromatografi (LLC) Denne formen for separasjon kommer av at man lar analyttmolekylene få velge hvilken av to ikke blandbare faser de vil være i. Væske-væaske ekstraksjon er det tidligste eksempelet på denne typen separasjoner. Dersom ett stoff har en preferanse for den organiske fasen, men det andre stoffet trives i vannfasen, så separeres stoffene. Dette ble tidlig gjort i motstrømsoppsett med mange små likevekter. Mangde slike separasjoner kan settes i kontinuerlig system dersom man lar den tyngere av de to væskefasene være stasjonørfase i form av små bobler, og man bruker den lettere fasen som mobilfase som pumpes forbi. Dette kan gjennomføres i praksis ofte ved bruk av sentrifuger som stabiliserer stasjonærfasen med mobilfasen pumpes forbi. En slik teknikk vil gi mange små likevekter, men er en langsom separasjonsteknikk. 8

9 2 Adsorpsjonskromatografi Adsorpsjonskromatografi baserer seg på at det virker tiltrekkende krefter mellom molekyler. Kreftene som virker i adsorpsjonskromatografi kan deles inn i tre: Van der Waals krefter, hydrogenbindinger og Coulombkrefter. 2.1 Krefter Van der Waals interaksjoner kan igjen deles inn i London dispersjonskrefter og dipolkrefter. London dispersjonskrefter virker mellom store lett polariserbare molekyler, ved at det induseres en dipol på hvert atom, som det virker tiltrekkende krefter mellom. Dipolkreftene er delt opp i krefter som virker mellom dipoldipol, og dipol-indusert dipol. Permanente dipoler finner man for eksempel i nitril-, karbonyl-, nitro-, ester- eller syreforbindelser. En illustrasjon av polare vs. upolare molekyler er vist i Figur 2.1 under. Figur 2.1: Oversikt over polare vs. upolare analyttmolekyler. Hydrogenbindinger er sterke bindinger, og kan dannes mellom hydrogen, og et elektronrikt atom (ofte nitrogen eller oksygen). Silikagel er god til å danne hydrogenbindinger, siden denne har mange OH-grupper som kan interagere med proton på prøvestoffene. Coulombkrefter er ioniske interaksjoner mellom ladede partikler. Disse er svært nyttige i for eksempel ionebytterkromatografi, men kan skape problemer andre steder dersom bindingen blir for sterk. 9

10 2.2 Adsjorpsjonsmiddelet Adsorpsjonsmiddelet forbindes ofte med stasjonærfase eller kolonner, i motsetning til mobilfase eller elueringsmiddel. For polare adsorpsjonsmidler virker som regel dipol-dipolkrefter og hydrogenbindinger. For upolare adsorpsjonsmidler er det van der Waalskreftene som dominerer. Adsorpsjonsisotermene beskriver hvordan adsorpsjonen av et stoff varierer med konsentrasjonen av mobilfasen. Adsorpsjonsisotermen skal ideelt sett være lineær, da får man helt symmetriske topper, men er som regel konveks. For konvense adsorpsjonsisotermer får man tailing for toppene. Tailing kan komme av at det er forskjellig styrke på setene hvor molekyler kan adsorbere. Noen av disse er sterke, og der vil adsorpsjonen være sterkest. Det er ønskelig å ha så jevn adsorpsjons som mulig for å forhindre tailing, og derfor er det lurt å prøve å deaktivere de særlig sterke adsorpsjonssetene. Stoffet som da tilsettes kalles moderator, og kan være f.eks. vann på en tørket silikaplate. Surheten av adsorpsjonsmiddelet vil også være viktig for hvilke stoffer som blir sterkt retardert. Dersom adsorpsjonsmiddelet er sterkt surt, vil basiske stoffer retarderes i særlig stor grad, og motsatt med basiske adsorpsjonsmidler Silikagel Silikagel er et av de viktigste adorsjonsmidlene. Silikagel fremstilles ved å reagere kvartssand (SiO 2 ) med Na 2 CO 3 som gir natriumsilikat (Na 2 SiO 3 ). Denne reageres med en syre og vann til den gir kiselsyre (Si(OH) 4 ). Kiselsyren polymeriserer seg til større partikler, og over tid blir den til en eneste stor gel. Denne vaskes, trøkes og knuses til den silikagelen man kjøper og pakker kolonner med. I silikagelen vil det være tre typer adsorpsjonsseter, rangert etter styrke: isolert silanol (Si-OH) > hydrogenbundet silanol (Si-OH-O-Si) > > siloksan (Si-O-Si). Vekselsvirkningene mellom silikagelen og analyttmolekylene skjer ved to proses- 10

11 ser. Sorpsjon er prosessen hvor analyttmolekylene adsorberes utenpå ett eller flere lag med løsningsmiddel. Fortrengning er prosessen hvor molekylene fortrenger de løsningsmiddelmolekylene som allerede er adsorbert, og tar plass direkte på adsorpsjonssetet. I separasjoner med silikagel er det hovedsaklig hydrogenbindinger som står for retensjon og separasjon. Derfor er det tydelig at stoffer separeres på bakgrunn av deres evne til å danne hydrogenbindinger. Dersom man bruker sterk base i en silikagelkolonne, risikerer man at silanolgruppene deprotoneres slik at man får siliat anioner. Da vil coulombinteraksjoner ta over, og alt går i dass Aluminiumoksid Det er γ-formen av alumina Al 2 O 3 som er aktivt adsorpsjonssete. Eksponerte aluminiumatomer er lewissyrer, og vil derfor adsorbere lewisbaser svært godt. Aluminiumsoksid er mer stabil enn silika ved basiske betingelser, men har generelt litt lavere adsorpsjonsstyrke. Separasjonen skjer hovedsaklig på grunn av funskjonelle grupper i molekylene som skal separeres Andre adsorpsjonsmidler Eksempler på andre adsorpsjonsmidler er f.eks. Florisil som er syntetisk magnesiumsilikat. Polyamid er mye brukt som polar stasjonærfase med upolare løsningsmidler for separasjon av naturstoffer, og polart aktivt kull kan også benyttes til noen separasjoner f.eks. i hjemmebrenning for å bli kvitt organiske illluktende forurensinger. Silikagel har mange silanolgrupper somd et er enkelt å derivatisere. Et vanlig triks er å derivatisere de med klorsilaner, som i praksis fester på store upolare grupper som (Si(CH 3 ) 2 R). Dette vil gjøre at man får en omvendt fase silikagel hvor upolare stoffer vil retarderes mest. R-gruppen er ofte en alkylgruppe, og når lenden på denne økes, vil man bevege seg fra adsropsjon til absorpsjon. Det er også et problem at ikke alle silanolgruppene derivatiseres, slik at man vil oppleve noe tailing grunnet dette. 11

12 2.3 Tynnsjiktkromatografi (TLC) Tynnsjiktkromatografi er en planar kromatografiteknikk, og finnes i to versjoner: TLC og HPTLC. TLC er raskt, effektivt, billig, kan gjennomføres både analytisk og preparativt og man kan eluere mange prøver samtidig. Metoden baserer seg på at en mobilfase eluerer flekker med analytt oppover et tynt sjikt av stasjonærfase. For å sikre seg gode elueringsforhold er det viktig å ha en mettet atmosfære i elueringskammeret hvor man kjører TLC. TLC har mange fordeler i forhold til kolonnekromatografi, men det er visse ulemper også. Mobilfasen vil ikke ha en homogen vandringshastoghet, da det vil være avdamping fra platen. Dersom en blanding av to mobilfase benyttes, vil det kunne skje en selektiv avdamping, slik at konsentrasjonen endrer seg langs platen Deteksjon Deteksjon kan være en utfordring ved TLC. Det er i hovedsak fire forskjellige deteksjonsteknikker som benyttes for TLC: i) Fluorescerende stoffer kan detekteres med en UV-lampe i en mørk boks. Flekkene vil da lyse opp, og man kan tegne rundt med en blyant. ii) Dersom stoffene ikke er fluorescerende, kan man tilsette et flouescerende stoff i stasjonærfasen. Dette vil gjøre at alt lyser opp i UV-lys bortsett fra der det er stoffer, som vises som mørke flekker. iii) Dersom man eluerer organiske stoffer på uorganiske sjikt vil man kunne bruke joddamp til å detektere stoffene. De vil da vises som brune flekker. iv) Man kan kjemisk derivatisere flekkene, ofte med syrer som reduserer alt organisk materiale. Fosformolybdensyre med oppvarming vil gjøre organisk stoff grønnbrunt og platen elles blir gul Preparativ bruk TLC kan også gjennomføres for å preparativt separere to stoffer. Man bruker da gjerne selvlagde plater med et mye tykkere sjikt, gjerne på glassplater. En stor mengde stoffblanding appliseres i en lang strekbortover platen, som deretter elueres, slik at streken splittes i to bånd. Når prøven skal hentes ut skraper man enkelt av området hvor båndet man er interessert i er, og ekstraherer stoffet fra denne stasjonærfasen. Stoffmengdene som kan separerers ligger på rundt 1 gram 12

13 per plate, og det er relativt enkelt å oppskalere antall plater ved å eluere mange samtidig HPTLC Gjennomføres ofte automatisk, på tynnere sjikt, med finere partikler, mindre prøvevolum og kortere vandringslengder. Det vil likevel være mye høyere effektivitet for HPTLC, og den anses å være på høyde med HPLC. Det er mange forskjellige måter HPTLC faktisk gjennomføres på, men det meste er automatisert, og veldig avansert. HPTLC er ofte omvendt-fase (polare MF), og benytter seg ofte av oppkonsentreringssoner for å gjøre runde flekker til tynne bånd. 2.4 Organiske polymere adrorpsjonsmidler Cellulose Cellulose er et tidligere mye brukt adsorpsjonsmiddel for fordelingskromatografi, papirkromatografi, papirelektroforese og kirale separasjoner. Det er et sterkt kjemisk og mekanisk materiale, og alle OH-gruppene gjør det mulig med omfattende derivatisering. Figur 2.2: Celluloses polymerstruktur med mange OH-grupper Agarose Agarose har et ganske smalt bruksområde, rundt nøytrale ph (4-9). Den er brukt i gelfiltreringer, gel-elektroforese, og som matrix i ionebytter- og bio-affinitetskromatografi. 13

14 2.4.3 Polydekstran (Sephadex G) Er et naturlig polysakkarid, hvor OH-gruppene kan brukes til derivatisering for å endre egenskapene til gelen. Brukes hovedsaklig til gelfiltrering. Er kjemisk svært stabil, men ikke så mekanisk stabil Polystyren-gel Syntetisk gel, som brukes hovedsaklig i gelpermeasjonskromatografi og som upolart adsorpsjonsmiddel i HPLC og GSC. Dersom fenylringene derivatiseres kan denne brukes som matrix for ionebyttere og i omvendt fase HPLC Polyakrylat Lages fra konjugerte estere. Vil lage en tredimensjonal gel med kryssbindinger dannet av en diester. Ved å variere hva R-gruppen i esterene er, vil man kunne modifisere gelen. Hvis R=CH 3 blir gelen upolar, hvis R=H blir den sur, og kan brukes som kationbytter. 2.5 Elueringsmiddelet Elueringsmiddelet er svært viktig, og ofte det som enklest å endre for å påvirke separasjonen. For polare adsorpsjonsmidler kan elueringsmidlene settes inn i en eluotropisk serie, etter elueringsstyrken: Vann > AcOH > MeOH > EtOH > pyridin/acetonitril > AcOEt/aceton > EtO- Et/MeOtBu > CH 3 Cl/CH 2 Cl 2 > benzen/toluen > CCl 4 /CS 2 > alkaner > fluoralkaner For omvendt fase separasjonssystemer kan man generelt sett snu den eluotropiske rekken på hodet. For å kunne si noe kvantitativt om adsorpsjonen i LSC kan man bruke Snyders formel: log K ads,x = log V a(mf ) + α (S X A X ε ) (2.1) 14

15 hvor K ads,x er adsorpsjonskoeffisienten for analytten X (C ads /C MF ), V a er arealeat av adsorpsjonsmiddelet, α er adsorpsjonsmiddelaktivitetsparameter (proporsjonal med overflateenergi), S X er adsorpsjonsenergi per overflateareal for analytten X, A X er molekylarealet til X og ε er løsemiddelstyrken. Løsningsmiddelstyrken ε er et mål på polariteten av løsningsmiddelet, og er definert lik null for n-pentan, og en stor ε betyr god evne til å forflytte analytten fordi den okkuperer flere adsorpsjonsseter. For kombinasjoner av løsningmidler finnes det formler for å regen ut ε, men det er 1000 ganger enklere å lese av i en tabell. 2.6 Analyttens innvirkning Prøvemolekylene har stor påvirkning på adsorpsjonen gjennom deres molekylareal A X og deres adsorpsjonsenergi S. Arealet har en viss påvirkning, men ikke i like stor grad som adsorpsjonsenergien. Denne påvirkes hovedsaklig av hvilke funksjonelle grupper et molekyl har, og lar seg estimere fra tabellverdier for forskellige funskjonelle grupper. SX = iq i (2.2) hvor Q i er gruppeadsorpsjonsenergien til de forskjellige funksjonelle gruppene i molekylet. Disse er additive, og kan derfor enkelt summeres for å gi molekylets totale adsorpsjonsenergi. Generelle trender i Q i er at karboksylsyrer, amider, aminer og hydroksylgrupper har høye Q i, mens metyl, halogener, tioler og etere har lave verdier for Q i. 2.7 Temperaturens innvirkning I Snyders formel er det adsorpsjonsmiddelaktivitetsparameteren som påvirkes av økt temperatur, og man har funnet en formel som korrigerer for dette: α T = α RT 297 T (i K) (2.3) 15

16 2.8 Tørrkolonnekromatografi Er hovedsaklig en preparativ teknikk. Kolonnen pakkes tørt, og prøven appliseres på toppen av kolonnen. Deretter eluerer man med en mobilfase som er optimalisert fra TLC, til denne når bunnen av kolonnen. Da stoppes elueringen, og man lokaliserer de områdene i kolonnen som inneholder stoffer av interesse og graver disse ut. Dette kan gjennomføres i pølseskinn, som er lette å kutte opp i riktige seksjoner etter eluering. Dette blir kolonneversjonen av preparativ TLC. 2.9 Lavttrykk og Flash kolonnekromatografi Lavtrykkskolonnekromatografi gjøres som regel med tyngdekraften, og kolonnene kan være tørrpakkede elller oppslemmede med stasjonærfasen i elueringsmiddelet. Man velger et elueringssystem som gir R F -verdier på TLC mellom 0.15 og 0.35, da dette ofte gir god separasjon og retensjon for kolonnekromatografien. Deteksjonen kan gjøres enten ved kontinuerlig deteksjon, eller fraksjonsvis. Det er ofte UV/VISspektroskopi som brukes i deteksjonen. Partikkeldiameteren for pakkematerialet i gravitasjonskolonner ligger i området over 50 µm, og er ikke-sfærisk. Flashkromatografi er egentlig kun en gravitasjonskolonne med et lett overtrykk av en inert gass. Siden væskehastigheten er noe høyere, vil også partikkeldiameteren måtte være noe mindre for å opprettholde effektiviteten. 3 Gasskromatografi (GC) Baserer seg på å retarderer stoffer ut fra deres flyktighet. Mobilfasen er en gass, så når stoffene er i gassfase er de uretardert, men med en gang de kondenserer vil de være retardert. Det finnes to typer gasskromatografi, gass-væske (GLC) og gass-fast stoff (GSC). GLC er en fordelingskromatografi, mens GSC er adsorpsjonskromatografi. GLC er absolutt mest brukt. Det som påvirker separasjonen i gasskromatografi er hovedsaklig temperaturen, siden den bestemmer damptrykket til analytten. 16

17 Figur 3.1: Typisk gasskromatografiapparat med gassforsyning, injektor, kolonne, ovn, detektor. Til slutt får man laget et kromatogram. 3.1 GSC Vanlige adsorbenter i GSC er aluminiumoksid, organiske polymerer, aktivt kull og silikagel. Det virker sterke mellommolekylære krefter mellom analytten og stasjonærfasen, og man må ofte bruke svært høy temperatur for å få eluert stoffer. Derfor er GSC uegnet for prøver som er ustabile ved høye temperaturer, da det er fare for katalytisk aktivitet fra stasjonærfasen og permanent adsorpsjon (kjemisorpsjon). Derfor brukes GSC oftest til å analysere gassblandinger eller løsningsmidler som har lave kokepunkt. Siden det er så sterke interaksjoner mellom stasjonærfasen og prøvemolekylene, vil man forsøke å holde forholdet V MF /V SF høyt, og dette gjøres ofte med PLOT-kolonner (Porous Layer Open Tubular). 3.2 GLC I GLC er stasjonærfasen en væske, og mobilfasen er en gass. For at GLC skal fungerer på en prøve må den være relativt flyktig, relativt stabil ved temperaturer opp mot 300 C og ha en viss løselighet i stasjonærfasevæsken. For å holde stasjonærfasen på plass er det nødvendig med noe fast stoff inne i kolonnen, og siden 17

18 væsken adsorberer til dette stoffet vil det også være fare for at prøvene kan gjøre det også. Likevel så håper man at denne effekten er så liten som mulig, og oftest går det veldig bra! Bæregassen Bæregassen har ingen annen funksjon enn å drive prøven gjennom stasjonærfasen i kolonnen. Vanlige bæregasser er hydrogen, nitrogen, helium og av og til argon. Valg av bæregass burde ikke ha noe å si, men de har litt forskjellig effektivitet avhengig av gasshastigheten. Dette kan vises i van Deemter-kurven: Figur 3.2: Effektivitet vist i HETP mot gasshastighet for hydrogen, helium og nitrogen. Fra Figur 3.2 er det tydelig at nitrogen har lavest HETP ved en lavere gasshastighet enn både hydrogen og helium. Dersom man skulle ønske å bruke en høyere gasshastighet er det derfor gunstigst å benytte seg av hydrogen som bæregass da denne gir best effektivitet ved høye hastigheter. Hydrogen kan være eksplosjonsfarlig, og vil med riktige betingelser kunne hydrogenere dobbelt- og trippeltbindinger. Valg av bæregass er dermed et valg mellom effektivitet, hastighet og fare for eksplosjon/hydrogenering. Det er viktig at gassen som skal inn i kolonnen er: i) Fri for oksygen, da dette kan oksidere stasjonærfasen ved høye temperaturer. ii) Fri for vann, da dette kan hydrolysere stasjonærfasen. iii) Fri for olje, fett og andre forurensninger som skal 18

19 skape spøkelsestopper eller endre egenskapene til kolonnen over tid. Løsningen er å kjøpe god gass, og rense den før den sendes inn i kolonnen Injektoren Injektoren er en viktig komponent i ethvert GC-apparat, og det finnes mange forskjellige versjoner av injektorer. Injektorens hovedoppgave er å få injisert en gitt mengde prøve raskt, slik at løsningsmiddelet damper av, og prøven injiseres i kolonnen hvor den separeres. For injeksjon av gasser er det ikke nødvendig med et fordampningskammer, og en loopinjektor er heller foretrukket. Figur 3.3: En splittinjektor til et gasskromatografiapparat. Sprøyten stikkes inn gjennom septumet øverst i figuren, og en gitt mengde injiseres Kolonnen Det finnes mange typer kolonner for GC. Pakkede kolonner for GLC er ofte tynne med en diameter på mm. For GSC er kolonnene ofte av glass pakket mes stasjonærfasen, og diameteren er mm. WCOT (Wall Coated Open Tubular) er kapillærrørkolonner med en indre diameter på mm og med en lengde på m. På innsiden av kolonneveggen 19

20 er det avsatt en tynn film med stasjonærfase. Disse kolonnene har svært høy effektivitet, men tåler ikke så høye prøvemengder. PLOT (Porous Layer Open Tubular) er kolonner som er belagt med et porøst materiale på innsiden av kolonneveggen. Disse kolonnene gir svært lave trykkfall og er derfor svært gunstige både for GLC og GSC. Kan ta større prøvemengder enn WCOT Stasjonærfaser i GLC Væsken må ha et lavt damptrykk, som betyr et høyt kokepunkt. Det betyr at det vil alltid være et tap av stasjonærfase i en GLC-kolonne. Stasjonærfasen bør være stabil i hele temperaturområdet hvor kolonnen skal brukes. Det er en MAOT (Maximum Allowable Operating Temperature) hvor tapet av stasjonærfase er uakseptabelt høyt, og en nedre grense hvor stasjonærfasen krystalliserer. Den viktigste stasjonærfasen i gasskromatografi er polysiloksaner, for eksempel PDMS (PolyDiMetylSilikon) som består av lange kjeder som -(Si(CH 3 ) 2 -O) n -. Det er gode muligheter for å endre strukturen av polysilioksaner, ved å bytte ut metylgruppene med andre funksjonelle grupper. Figur 3.4: Strukturen til polydimetylsiloksan. Andre stasjonærfaser omfatter polyetere (Carbowax), polyestere, cyanider/nitriler, polyaminer, dexsiler og flytende organiske salter. De vanligste sasjonærfasene er metylsilikon, fenyl-metylsilikon, trifluoropropylmetylsilikon, cyanopropyl-fenyl-metylsilikon, PEG/Carbowax og DEGS. 20

21 4 Analyser ved hjelp av kromatografi Analyser deles inn i kvalitative som bestemmer hva som finnes, og kvanititative som bestemmer hvor mye som finnes. 4.1 Kvalitative analyser For å kunne identifisere et molekyl må man må ha høy grad av reproduserbarhet (inter-lab-presisjon) og/eller repeterbarhet (intra-lab-presisjon). Det er også viktig at effektiviteten er høy for utstyret man benytter, slik at man får klare tynne topper som er enkle å skille fra hverandre. For å identifisere et stoff trenger man en autentisk standard av det aktuelle stoffet for å gjøre en ko-injisering. Dersom ko-injiseringen gir kun ett signal, kan man si at de to stoffene mest sannsynlig er samme stoff, fordi man kan aldri være 100 % sikre. 4.2 Kvantitative analyser For å bestemme mengden av en analytt trenger man en måte å sammenlikne signalet som analytten produserer, og menden analytt som var ansvarlig for det signalet. Vanlige mål for signal er enten topphøyde eller toppareal. Dersom man kun sammenlikner topparealene til signaler vil det oppstå et problem. Forskjellige stoffer kan ha forskjellig detektorrespons, og derfor trenger man en kalibrering. Dersom detektorresponsen er lineær, vil det si at f.eks. en økning i stoffmengden gir en proporsjonal økning i detektorresponsen. Når mengde stoff kommer over en viss grense vil detektorresponsen bevege seg inn i det dynamiske området. Dette er illustrert i Figur

22 Figur 4.1: Til venstre er det lineære og dynamiske området avmerket, og til høyre er følsomheten til detektoren vist for tilsvarende regioner Normaliseringsmetoden Normaliseringsmetoden går ut på at man ser på hvor stort signal en analytt produserer relativt til alle andre signaler i kromatogrammet. Den forutsetter at detektoren gir et signal som er proporsjonalt til mengden analytt. Deretter kan man ut fra andre topper som man kjenner mengden av, forutsi mengden av analytten man er interessert i Ekstern standard (ESTD) Ekstern standard metoden baserer seg på å lage en kalibreringskurve ut fra kjente konsentrasjoner av analytt. Da vil topparealet bli plottet mot mengden analytt, og man har en kalibreringskurve. Deretter vil man kromatograferer et identisk volum med den ukjente prøven, og sammenlikne signalet man får med kalibreringskurven man allerede har. Ekstern standard kan også gjennomføres med en responsfaktor: (X)dx rf(x) = (4.1) m(x) Forutsatt at kalibreringskurven er lineær, vil man kunne finne den ukjente konsentrasjonen/mengden ved å dele signalet på responsfaktoren: 22

23 m(x) = (X)dx rf(x) (4.2) Ekstern standard fungerer greit, også for ikke-lineære detektorrespons, men krever svært nøyaktige analyser, særlig mhp. injisert volum Intern standard (ISTD) For intern standard må man først lage en kalibreringskurve, og da bruker man varierende konsentrasjon av analytten man skal undersøke, og en fast mengde intern standard (IS). Intern standard er et stoff som er realtivt likt det som analyseres, både kjemisk og i retensjonstid. Disse analyseres, og et plott lages av signalforholdet mellom analytten og den interne standarden mot konsentrasjonsforholdet mellom analytten og den interne standarden. Når man har kalibreringskurven kan man analysere prøven med en lik mengde intern standard. Signalforholdet man da får plottes rett inn i kalibreringskurven, og konsentrasjonsforholdet kan leses av. Den relative responsfaktoren til signalene fra analytten og den interne standarden er definert som: rrf = A x C is A is C x (4.3) 23

24 Figur 4.2: Illustrasjon som viser en kalibreringskurve av signalforhold plottet mot masseforhold. Deretter er det målte signalforholdet for den ukjente prøven plottet inn og masseforholdet avlest. Intern standard er en svært god metode for å bestemme konsentrasjoner, særlig hvis man må injisere manuelt. Den fjerner usikkerheten rundt injisert mengde, siden den hele tiden sammenlikner relative verdier for signaler konsentrasjoner. Den tar også hensyn til at detektoren ikke alltid gir likt signal for like mengder stoff fra dag til dag Standard-tilsats Gjennomføres ved å først analysere prøven uten tilsats. Deretter tilsetter man en kjent mengde ren standard til en del av prøveløsningen og analyserer den. Da har man signalene fra to prøvekonsentrasjoner X(0) og X(+), og kjenner mengden som ble tilsatt mellom de to, m X(+). Mengden av analytt i den opprinnelige prøven bestemmes deretter fra: m X(=) = m X(+) X(0) X(+) X(0) (4.4) 24

25 Standard-tilsats-metoden brukes når det ikke er mulighet for å bruke en intern standard, enten fordi det ikke er plass, eller at det ikke finnes noe stoff som kan brukes som IS Usikkerhet Presisjon og nøyaktighet er to forskjellige begrep som ofte blandes. Figur 4.3 viser forskjellen. Figur 4.3: Forskjell på presisjon (precision) og nøyaktighet (accuracy). Usikkerheten i forskjellige analysemålinger kan kategoriseres i systematiske feil og tilfeldige (stokastiske) feil. De stokastiske feilene kommer av feil i presisjonen, og beskrives best ved standardavviket. De systematiske feilene kommer fra feil i nøyaktigheten og er der man kan påvirke resultatet mest. Disse favner om personlige, instrumentelle og metodiske feil. For de systematiske feilene er det mange flere tiltak man kan sette i gang for å minske feilestimatene, som å jevnlig sjekke at standardene man bruker har riktig konsentrasjon. For sporanalyser vil det være en problemstilling om når et signal er detekterbart eller når det kun er bakgrunnsstøy. En generell regel sier at deteksjonsgrensen (LOD) er hvis signalet ligger over bakgrunnsstøyen s b pluss tre standardavvik σ b. Grensen for kvantifisering (LOQ) ligger på bakgrunnsstøy pluss ti standardavvik. LOD = s b + 3 σ b (4.5) LOQ = s b + 10 σ b (4.6) 25

26 Som en tommelfingerregel brukes at topper som er 2 ganger høyere enn støybåndet er detekterbare mens de som er fem ganger høyere er kvantifiserbare. 5 Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) Er separasjon av analytter basert på deres molekylstørrelser alene. Det forutsettes at det ikke er noen andre former for retardasjon finner sted. Gelen som brukes i denne separasjonen er store partikler med små porer. Store prøvemolekyler vil ha problemer med å komme inn i disse store partiklene med små åpninger, og vil derfor være svært lite retardert. Små molekyler vil ha tilgang til alle de små porene og blir retardert på grunn av dette. Figur 5.1: Størrelseseksklusjonskromatografi gjennomført på an blanding av store og små proteiner. De største molekylene vil ikke ha tilgang til de minste porene og elueres ut først. 26

27 Forskjellige geler vil ha forskjellige kalibreringskurver. Disse er som regel et plott av fordelingskoeffisienten (K D ) mot logaritmen av molekylvekten (log M r ). Fordelingskoeffisienten beskriver retensjon i eksklusjonskromatografi: K D = V R V 0 V i (5.1) hvor V R er retensjonsvolumet av prøven, V 0 er dødvolumet/retensjonstiden til løsningsmiddelet, V i er V SF = V C C 0 V gel, V c er totalt kolonnepakningsvolum og V gel er volumet av gelmatrisen. Separasjonsevnen til en SEC-kolonne, som antall topper mulig å separere (z), vil kunne bestemmes fra platetallet N, fra formelen: z N (5.2) Dette betyr at dersom N er 100 kan 3 topper separeres og er N = kan 20 topper separeres. Fraksjoneringsområdet til en gel er definert som det området hvor verdiene for fordelingskoeffisienten til prøvemolekyler ligger mellom 0 og 1. Det er for molekyler med molekylvekter innenfor fraksjoneringsintervallet at kalibreringskurven gjelder, og som kan separeres med den kolonnen. Mange bløte geler for SEC er svært skjøre. Særlig dekstraner, agaroser, polyakrylamid og polystyrenderivater er spesielt myke, og kan ikke tåle trykket av løsningsmiddelet i en gravitasjonskolonne. Dette løses med et slags hevertsystem, som kobler kolonnen til et reservoat for løsemiddel som sitter under toppen på kolonnen. For HPLC med SEC-kolonner brukes noe sterke geler, men man må likevel være svært forsiktig med trykket man setter på kolonnen Anvendelser SEC er svært nyttig til fraksjonering, dvs. å fjerne molekyler av en viss størrelse som man vet man ikke er interessert i. Man kan gjøre en avsaltning av løsninger med makromolekyler, noe som er mye raskere enn en dialyse. Bestemmelse av molekylmasse er selvsagt også en anvendelse. 27

28 6 Ionebytterkromatografi (IEC) En metode for å bytte ioner mellom en løsning og en ionebytter. En ionerbytterkolonne består av en matriks med mange faste ioner som er kovalent bundet til matriksen. Til de faste ionene er det ionisk bundet motioner. På grunn av kravet om elektronøytralitet kan man ikke fjerne motionene, men man kan bytte de ut med andre ioner, og det er den prosessen som benyttes i IEC. Det finnes svært mange forskjellige ionebyttere, men det er noen generelle trekk. Kationbyttere har anioner kovalent festet, og disse er som regel et sulfonar, karboksylat eller fosfonat. Anionbyttere har kationer kovalent bundet, og dette er stort sett alltid et amin. Tabell 6.1: Lite utvalg av ionebyttere Gruppe Fast ion Motion Type ph-område Kationbyttere Sulfonat R SO 3 H + Sterkt sur 2-12 Karboksylat R CO 2 H + Sterkt sur 4-6 (6-12) (Fosfonat) R PO 3 H 2 /R PO 3 H + Anionbyttere Ammonium ion R N + (CH 3 ) 3 X Sterkt basisk 2-12 Type1 Ammonium ion R N + (CH 3 ) 2 (CH 2 ) 2 OH X Sterkt basisk 2-12 Type2 Ammonium ion R CH 2 NH + (CH 3 ) 2 X Svakt basisk 2-6 Ammonium ion R (CH 2 ) n NH + 3 X Svakt basisk 2-6 bl.a. i HPLC For avsaltning kan man bruke geler med både anion- og kationbyttere. Disse vil da binde til seg alle ionene i blandingen og la de ikke-ioniske molekylene komme renset ut på andre siden. 28

29 6.0.7 Ionebytting Selve prosessen med ionebytting starter når gelen svelles. Da solvatiseres motionene, men de vil ikke forlate de kovalente bundede ionene så lenge de befinner seg i ionefrie væsker vil de ikke forlate gelen. Når gelen elueres med en ionisk løsning, vil det kunne skje ionebytting. Graden av utbytning avhenger av stabilitetskonstantene til komplekset fast ion - motion og de respektive konsentrasjonene av motioner og fremmedioner. Ionebytting skjer via likevekten: R A + X + B + + Y R A + Y + B + + X (6.1) Ionebytterkromatografi For å kunne separere stoffer med ionebytting må man ha minst to konkurrerende motioner, som tilsettes som f.eks. BY og BZ. Dersom BY og BZ elueres på en ionebytterkolonne med BX, vil det være ionene X, Y og Z som konkurrerer om de faste plassene på A. Forutsatt at selektivitetskoeffisienten for Y og Z er forskjellig vil de ha forskjellig grad av retensjon, og vil dermed kunne bli separert i forskjellige fraksjoner. 29

30 Figur 6.1: Ionebytterkromatografi med en blanding av ladede proteiner i en kationbytterkolonne fylt med negativt ladede grupper. Kationer vil retarderes i kolonnen, mens anioner fyker gjennom. Affiniteten for de faste bundede ionene varierer. For kationer er det de med størst ladning og størst størrelse som viser sterkest affinitet. For anioner er det de samme prinsippene som gjelder, men det er mye større forskjelle renn for kationene. I ionebytterkromatografi er det visse elueringsbetingelser man bør følge. Påsatt prøvemengde bør ikke overskride 1 % av teoretisk kapasitet dersom det er en analytisk separasjon som skal gjennomføres. Er separasjonen preparativ går det an å påsette prøver med 5-10 % av kapasiteten (opp til 25 %). Det er viktig at prøven ph er slik at de påsatte komponentene foreligger i ionisert form. Den mobile fasens ph må justeres slik at ionebytterens funksjonelle grupper ikke mister sin funksjon. Ionestyrken µ til mobilfasen er også en viktig variabel, og den kan bestemmes fra: µ = 1 c i zi 2 (6.2) 2 hvor c i er de enkelte ionenes konsentrasjon og z i er deres respektive ladninger. En større ionestyrke betyr en større elueringsstyrke. i 30

31 7 Elektroforese (EF) Elektroforese er flytting av ladede partikler på grunn av et elektrisk felt. EF brukes oftest på ioner i elektrisk ledende væsker. Det er to komponenter som bygger opp et elektroforesesystem: væskefasen, og et bæremateriale. Væskefasen er ofte en buffer, og i denne står elektrodene som lager det elektriske feltet. Bærematerialet kan være en kolonne, plate eller en gel. 7.1 Teori Når det settes spenning over de to elektrodene, vil det også skje to halv-reaksjoner, en på anoden (7.1) og en på katoden (7.2). Disse har ikke så mye å si for separasjonen, men de vil etter hvert endre sammensetningen til bufferen. 6H 2 O O 2 + 4H 3 O + + 4e (7.1) 4H 2 O + 4e 2H 2 + 4OH (7.2) I elektriske felt vil ladede partikler trekkes mot den motsatt ladede pol. Kraften som virker på de ladede partiklene F e er avhengig av ladningen av partikkelen q og stryken til det elektriske feltet E. F e = q E = q V L (7.3) Ionet vil bremses av den fysiske motstanden F f det møter i bufferen, og dette kan beskrives ved F f = 6πηru (7.4) hvor η er viskositeten til bufferen, r er ioneradius og u er vandringshastighet. Ved å balansere de to kreftene mot hverandre, vil man kunne finne et uttrykk for vandringshastigheten ved likevekt. u = qe 6πηr (7.5) For reelle ioner vil det også være vekselsvirkninger med de motsatt ladede ioner 31

32 som skal motsatt veg. Dette løses ved at i Ligning (7.5) byttes r ut med (1 κr), hvor κ er en konstant som er avhengig av temperatur, bufferens ionestyrke og dielektrisitetskonstanten. Elektroforetisk mobilitet µ ef feltstyrke: er i elektroforese et mål på vandringshastighet per µ ef = u ef E = q 6πηr (7.6) 7.2 Varmeutvikling Siden det settes et svært høyt elektrisk potensial over bufferen i elektroforese vil det utvikles varme. Denne varmen kalles Joule heating W, og kan kvantifiseres fra W = R i 2 t = V i A L = E i A (7.7) hvor A er tverrsnittsareal for bufferløsningen og t er tid. Denne varmeutviklingen er det viktig å kunne kontrollere, og derfor er det nødvendig med aktiv kjøling når man gjør elektroforese. Dersom det skjer endringer i temperaturen til bufferen vil denne endre viskositet som igjen påvirker mobiliteten til ionene. Fordamping fra åpne systemer og dannelse av gassbobler i lukkede systemer vil også være problemer som oppstår ved å ikke kontrollere temperaturen. 7.3 Elektroosmose Massetransport i et elektroforetisk system kan også skje på grunn av elektroosmose. Dette skjer dersom overlfaten av bærematerialet er ikkeledende, men ladet. Det vil da bygges opp et lag av motioner på bærematerialet som imobiliseres der. Dette vil gjøre at bufferen nå har en skjev ladningsfordeling i de frie ionene, og som helhet vil bufferløsninegn bevege seg i den reteningen som ionene i overskudd vil. Er det negative ladninger på bærematerialet vil positive ioner imobiliseres. Dette fører til at det er overskudd av negative ioner i løsningen og den vil i hovedsak bevege seg mot den positive elektroden. Strømningsprofilen for elektroosmotisk strømning er ikke parabolsk, men har en plan fordeling siden det ikke er noen bremsende interaksjoner mot veggene. Dette fører til at sonespredning fra massetransfertermen 32

33 i van Deemter-ligningen faller nesten helt bort. Elektrokromatografi benytter seg kun av elektroosmose som drivkraft for mobilfasen, og kan oppnå trykk og væskestrømmer på linje med HPLC. Størrelsen på den elektroosmotiske stømmen kan beskrived ved hjelp av dens mobilitet µ EOF, som vist i Ligning (7.8) eller som hastighet som vist i Ligning (7.9). µ EOF = ε ζ η (7.8) u EOF = µ EOF E = µ EOF V L (7.9) hvor ζ er zetapotensialet som beskriver hvordan ladningene ved veddflaten er fordelt og avhenger stort sett av ladningen som er fast på veggen og ε er dielektrisitetskonstanten. Dersom µ EOF større om motsatt rettet fra µ ef, vil det føre til at separasjonen går i motsatt retning. Da vil positive ioner går mot den positive elektroden... snodig! For elektroforese er den hastigheten man observerer for væskestrømmen den elektroosmotiske hastigheten addert med den elektroforetiske. u obs = u ef + u EOF (7.10) Man kan bruke et uladet molekyl for å bestemme u EOF. Dette vil ikke ha noen tiltrekning til hverken av elektrodenene, og vil derfor følge med dit den elektroosmotiske strømmen drar det. Ved å vite hastigheten til det molekylet har man dermed også u EOF. Da er det lett å ordne på Ligning (7.10), slik at man får et uttrykk for u ef. 7.4 Effektivitet og oppløsning Platetall for elektroforese kan regens ut fra elektroferogrammet helt analogt til andre kromatogram med formelen N = 16(t m /w b ) 2. Man kan også beregne et 33

34 teoretisk maksimalt platetall for elektroforese fra formelen: N = (u ef + u EOF ) L E 2D = V (µ ef + µ EOF ) 2D (7.11) hvor D er diffusjonskonstanten av analyttionet i elektrolytten. Oppløsningen mellom to topper i et elektroferogram kan beregnes ved: R S = N 1/2 u 4 (u ef + u EOF ) [ ] 1/2 V = u (7.12) (u ef + u EOF ) D m hvor u er forskjellene i migrasjonshastighet mellom de to toppene man ser på. 7.5 Viktige elektroforesemetoder Sone-elektroforese er en samlebetegnelse på teknikker hvor analyttene separeres i soner eller bånd, stabilisert i et solid porøst materiale. Dette kan være for eksempel filterpapir, agarose-gel, polyakrylamid. SDS-PAGE er et mye brukt eksempel, som står for Sodium Dodecyl Suphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis. Moving Boundary elektroforese er en gammel metode som separerer ioner i en stillstående væskefase ved å påføre et elektrisk felt gjennom en saltbro fylt med elektrolytt. Endringer i refraksjonsindeksene detekterer på hver side av broen. Isotachoforese gjennomføres ved at en ufortynnet prøveløsning appliseres mellom en buffer med høyere elektroforetisk mobilitet enn prøvekomponentene, og en med lavere. Metoden separerer etter forskjellige elektroforetiske mobiliteter i soner som følger hverandre som perler på en snor. Isoelektrisk fokusering er en metode som er mye brukt sammen med PAGE. En gel med en phgradient benyttes, og molekylene elueres til de kommer til den ph hvor de har sitt pi (isoelektriske punkt). Der stopper de, og blandingen er separert mhp. pi. Denne gelen kan deretter legges inntil en annen gel og man kan separere molekyler med lik pi etter f.eks. molekylstørrelse. 34

35 Immunoelektroforese er en kombinasjon av elektroforese og antigen-antistoff-reaksjoner. Deteksjon av gelelektroforese kan gjøres med radioaktiv merking, overføring av analyttene til en egen membran også kalt blotting eller så kan man farge/derivatisere de forskjellige analyttene som sitter i gelen. 8 Superkritisk fluid kromatografi (SFC) Et fluid er superkritisk når dets trykk og temperatur er over det kritiske punktet hhv. p c og T c. Da vil fluidet være i en mellomtilstand mellom gass og væske. Et fasediagram for CO 2 er vist i Figur 8.1. Dersom et superkritisk fluid brukes som mobilfase vil det være relativt høy grad av diffusjon, men tilsvarende liten sonespredning som følge av massetransfer mot kolonneveggene. SFC gir derfor omtrent lik effektivitet som HPLC, men ved høyere strømningshastigheter. Det er gunstig siden man kan gjøre separasjonene raskere. Figur 8.1: Fasediagram for karbondioksid. Den superkritiske regionen er merket av i diagrammet. 35

36 På grunn av at fluidet må være superkritisk under hele separasjonen er det et krav om at ved utgangen må trykket være over p c. Dette er som regel ganske høyt, og det totale relative trykktapet i kolonnen er derfor lavt. Dette gjør det enkelt å sette mange kolonner i serie, og vil også bidra til kortere analysetider. Superkritiske fluider kan også brukes til ekstraksjon, superkritisk fluid ekstraksjon, fordi de har høy grad av diffusjon, lav tetthet og høy grad av solvatisering. Dette gjøres blant annet for å ekstrahere koffein fra kaffe for å produsere koffeinfri kaffe. Et SFC-apparat likner endel på oppsettet for HPLC. Mobilfasen kommer på en trykktank med trykk langt over p c. Denne varmes deretter opp til over T c før den sendes inn i kolonnen, fortsatt med høyt trykk. Kolonnene som benyttes må tåle det høye trykket, men eller er de svært like de som benyttes i HPLC og GC. For deteksjon så kan man bruke UV dersom væsken er under trykk og i væskefase, eventuelt en GC-detektor om den er i gassfase. Da kan FID være et godt valg. De mest brukte mobilfasene er CO 2, N 2 O og xenon. I utgangspunktet er de fleste mobilfasene som benyttes i SFC ganske upolare. For å kunne analysere polare molekyler kan man tilsette modifikatorer i små mengder. Disse er organiske polare molekyler, som vil hjelpe med løsligheten av polare stoffer, justering av elueringsstyrken til mobilfasen og kan redusere tailing. Metanol er den mest brukte modifikatoren i SFC. Temperaturen, mengde modifikator og trykket/tettheten kan alle justeres i et gradientprogram for å kunne optimalisere separasjonen av komponentene i SFC. I det siste er SFC mye brukt inne legemiddelanalyser, særlig med kirale kolonner. Det er også mulighet for mikropreparative analyser med SFC. 9 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC er en videreutvikling av den klassiske væskekromatografien, og gir svært raske analyser, høy oppløsning, god kvantifisering og et bredt spekter av stoffer kan analyseres. Noen ulemper har metoder, blant annet at det er en dyr metode og har ingen enkel, universell og følsom detektor. Man bruker svært små partikler 36

37 i kolonnene, og derfor må man bruke høyt trykk for å overkomme trykkfallet gjennom kolonnene. Vanlig diameter for de porøse partiklene i en HPLC-kolonne er 3-10 µm. 9.1 Elueringsmiddelet For normalfase-hplc er vanlige løsningsmidler heksan, diklormetan, metyl-tertbutyleter, THF. For reversfase-hplc er metanol, acetonitril, vann og THF mye brukt. For HPLC er det vanlig å blande to løsningsmidler for å få optimal separasjon. Man må passe på at man ikke får for høy viskositet, da det er viktig for å minske trykkfallet. Det er viktig at løsningsmidlene er avgasset, da man ikke ønsker bobler i systemet. Selv om et løsningsmiddel er mettet med luft, kan det bli overmettet ved blanding med et annet løsningsmiddel, og bobler dannes. Bobler i systemet vil påvirke både pumpen, kolonnen/separasjonen og detektoren. Elueringen kan foregå isokratisk, som vil si at ingen parametre endre i løpet av elueringen. Gradientmetoder er også populære, enten ved gradvis endring av MF-sammensetning eller satsvis. Dette vil kunne få ut sent eluerte stoffer tidligere samtidig som man får god separasjon for de tidligere eluerte stoffene. Temperaturen kan også varieres, men det er ikke så vanlig. Optimering av løsningsmiddelet må gjøres på bakgrunn av hvilke stoffer som skal separeres, og det er to egenskaper man generelt ønsker å variere: polariteten og selektiviteten. Som et mål på polariteten kan elueringsstyrken til løsningsmiddelet brukes, men Snyders løsningsmiddelstyrke S T er også vanlig å bruke. For normalfase kan man bruke en alternativ polaritetsskala, P. Det gjør det enkelt å finne polariteten til blandinger, fordi for en blanding med 3 løsningsmidler (a, b og c) med hhv. volumfraksjoner x i, vil blandingen ha polariteten P (a, b, c): P (a, b, c) = x a P (a) + x b P (b) + x c P (c) (9.1) Selektivitetsoptimering av en blanding av løsningsmidler baserer seg på tre egenskaper: protonakseptor-evne (x e ), protondonor-evne (x d ) og sterk dipol stabilisering (x n ). e, d og n står for hhv. etanol, dioksan og nitrometan. Trekantmetoden går ut på å teste tre løsningsmidler, i forskjellige konsentrasjoner tynnet ut med et 37