Side 1 ARBEIDSBESKRIVELSE Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap, UMB

Transkript

1 1 EIDSBESKRIVELSE Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap, UMB Metodenavn: Tryp IHA-nr.: Innledning/hensikt Metoden bestemmer totalinnholdet (totalt og fritt) tryp i fôr og faeces, ved basisk hydrolyse separasjon på HPLC kolonne og fluorometrisk deteksjon. (Metoden skiller ikke D og L- tryp) 2. Reagenser 0,1 M NaOH: 4 gram NaOH løses i 1000 ml til totalt 1 liter. 10,5 M NaOH: 420 gram NaOH løses i 1000 ml til totalt 1 liter 1 M HCl: 83,16 ml HCl (37 %, fuming) i totalt 2 liter d-h2o 6 M HCl: 498,94 ml HCl (37 %, fuming) totalt 2 liter d-h2o 0,5 M Na2HPO4 (x 2H2O): 44,5 gram løses i 1 M HCl 500 ml Metanol m/ 1% (w/v) 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (TCMP): 10 gram TCMP løses i 1000 ml methanol. 0,5 M orto-fosforsyre (w=85%): 34 ml fortynn til 1 liter d-h2o. Mobilfase HPLC: 1 liter: 3 gram eddiksyre (100 %), 900 ml d-vann, 50 ml metanol med 1% TCMP, innstill ph til 5,00 med ethanolamin, fyll opp til 1000 ml filtrer med membranfilter (589 whatman black ribbon, retention µm) og avgass. 2,5 liter: 7,5 gram eddiksyre, 2250 ml d-vann, 125 ml metanol med 1% TCMP, innstill ph til 5,00 med ethanolamin, fyll opp til 2500 ml filtrer med membranfilter og avgass 2,50 mmol/l D,L-trypløsning (kan oppbevares i -18 C i 4 uker). 100 ml: 51,06 mg D,L.-tryp (på kjemikalierom) 70 ml 0,1 M NaOH 2 ml 0,5 M Na2HPO4-løsning 5,6 g NaCl 1-6

2 Innstill ph til 6,2 med HCl (1-6 M) 2 Fyll opp til 100 ml med dd-h2o Fryser ned i -80 C i aliquoter 2,50 mmol/l intern standardløsning (kan oppbevares i -18 C i 4 uker). 100 ml: 54,56 mg α-methyltryp (i kjøleskapdøra på aa rommet) 70 ml 0,1 M NaOH 2 ml 0,5 M Na2HPO4-løsning 5,6 g NaCl Innstill ph til 6,2 med HCl Fyll opp til 100 ml med dd-h2o Fryser ned i -80 C i aliquoter 0,050 mmol/l kalibreringsblanding (oppbevar i 5 C): Må fremstilles samme dag som hydrolysen starter. 25 nmol/ml 50 nmol/ml 100 nmol/ml 50 ml: 50 ml: 50 ml: 3,25 g NaCl 3,25 g NaCl 3,25 g NaCl 35 ml d-vann 35 ml d-vann 35 ml d-vann 2,5ml 0,5 M Na2HPO4-løsning 2,5 ml 2,5 ml 5 ml 2-propanol 5 ml 5 ml 0,5 ml 2,5 mmol/l D,L-trypløsning 1 ml 2 ml 0,5 ml 2,5 mmol/l intern standardløsning 1 ml 2 ml Innstill ph til 6,2 med NaOH Fyll opp til 50 ml med dd-h2o 3. Risikovurdering -Bruk lab frakk, vernebriller og syrehansker (nitrile) når saltsyre- og natriumhydroksid lages. Konsentrert saltsyre damper. Hvis du får konsentrert saltsyre eller natriumhydroksid på huden, skyll med store mengder vann. Vei inn barium hydroksid octahydrat i avtrekkskap. 4. Utstyr Ultimate 3000 HPLC med autoinjektor og Shimadzu fluorescens detektor 2-6

3 3 ph-meter Varmeskap (110 C) Autotitrator, 751 GPD Titrino med 685 Dosimat fra Metrohm Whirlmixer Bordsentrifuge Polypropylene (PP) flaske, 125 ml, bred hals og skrulokk. Sintilasjonsglass 150 ml begerglass 100 ml målekolbe Trakt 2 ml GC-vials 300 μl GC-vials 0,45 μm membranfilter 2 ml engangssprøyte 5. Prøvemateriale Mengde prøvemateriale beregnes ut ifra nitrogenmengden i prøvene. Dette bestemmes først med Kjeldahlmetoden. 10 mg mengde nitrogen (g kg) 1000 (g kg) = prøve som skal veies ut (mg) Prøvemengde: mg homogen prøve (prøvene må inneholde ca. 10 mg nitrogen). Malingsgrad: 0,5 mm. Faeces: 1 parallell Fôr: 3 paralleller 6. Arbeidsbeskrivelse 1. Vei ut prøve (prøvene må inneholde ca. 10 mg nitrogen) (ca gram) i en PPhydrolyseflaske. 2. Tilsett 8,4 g barium hydroksid octa-hydrat. 3. Tilsett 8 ml dd-vann (degasset). 4. Mix på en vortex eller magnetrører. Behold en teflon belagt magnet i løsningen. 5. Tilsett 2,00 ml konsentrert (2,5 mmol/l) internstandard (α-methyl-tryp). 6. Vask ned eventuell prøve fra veggene i flasken med 4 ml vann. 7. Sett lokket løst på og sett flasken i et forvarmet varmeskap, inkuber først 1 time ved 110 (± 2) C, skru igjen lokket godt og hydrolyser videre i 19 timer. 8. Skru av varmeskapet og kjøl ned til under 100 C 9. For å unngå krystallisering av Ba(OH)2 8H2O, tilsett 30 ml dd-vann rett etter prøvene er tatt ut. 10. Rist eller rør lett. 11. Avkjøl flaskene på vann/isbad i 15 min. 12. Tilsett 5 ml orto-fosforsyre (0,5 M). 13. Overfør hydrolysatet til et begerglass for autotitrering-hold begerglasset på is. 14. Skyld flasken med ca 20 ml dd-vann. 15. Tilsett 20 ml metanol. 3-6

4 4 16. Overfør til en målekolbe og fortynn til 100,0 ml. 17. Behold en liten del (10 ml) av prøven i kjøleskap til analyse (max 3 dager). 18. Filtrere hydrolysatet (0,45 µm membranfilter) før injeksjon på HPLC. Beskytt standardløsning og hydrolysater mot direkte sollys. Prøver med høyt fettinnhold (mer enn 40 %) bør ekstraheres med light petroleum, kokepunkt før kverning og analyse. ph justering (ph 6,2) ved bruk av autotitrator 1. Kontroller at det er nok løsninger i flaskene og spyl ut det som sitter i slangene Bruk 751GPD Titrino Keyboard: - Trykk Prep (tast 4) en gang for å velge internal D0 (6 M HCl) som står til høyre - Trykk START. - Trykk Prep (tast 4) to ganger for å velge external D1 (1 M HCl) som står til venstre. - Trykk START. Pass på at det ikke er noen luftbobler i slangene. Utspyling av slangene kan måtte gjentas i mange runder. 2. Kalibrering av ph-meter med bufferne 4,01/7,00/10,01 Bruk 751GPD Titrino Keyboard: - Trykk User Meth (tast 3). - Velg recall method med Enter. - Bruk piltastene, eller, til å finne programmet CAL-TRP. - Trykk Enter. - Trykk START. - Trykk Enter for å akseptere temperaturen (25 C). - Sett elektroden i buffer 1. Aksepter at første buffer er ph=4,01 ved å trykke Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann. - Sett elektroden i buffer 2. Aksepter at andre buffer er ph=7,00 ved å trykke på Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann. - Sett elektroden i buffer 3. Aksepter at tredje buffer er ph=10,01 ved å trykke på Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann. - Kalibreringsresultatene blir automatisk skrevet ut av skriveren. 3. Innstilling av ph til 6,20 i tryp: Bruk 751GPD Titrino Keyboard: - Trykk User Meth (tast 3). - Velg recall method med Enter. - Bruk piltastene, eller, til å finne programmet TRYPTO. - Trykk Enter. Analyse ved bruk av HPLC Kolonne: Supelcosil LC-18 (4.6 mm, 15 cm, 5 µm) Kolonne temperatur: romtemperatur Mobilfase: Se under reagenser Instrument: Dionex Summit HPLC system + Shimadzu RF-535 fluorescence detector. 4-6

5 5 Flow rate: 1 ml/min Total analysetid: ca 25 min Bølgelengder: excitation: 280 nm, emission: 356 nm Injeksjonsvolum 30 µl Sett på UV lampe og fluorecence detector ca 30 min før analyse. Sett opp sekvens i Chromeleon: 1. Åpne Chromelon. 2. Åpne Browseren og gå inn på Sequenses 3. Åpne riktig årstallmappe under Sequenses og lag en ny sekvens (kopier en gammel). 4. Ved kopiering av en eldre sekvens. 5. Gi sekvensen nytt navn, MMDD_ÅÅÅÅ. 6. Marker sekvensen og høyreklikk. 7. Velg Properties og skriv inn oppdragsgiver der hvor det står Title. 8. Lag sekvensen (tilpass til antall prøver): 9. Marker alle prøvene i sekvensen (alt skal bli svart). 10. Trykk Ctrl+c og Ctrl+v fjerner de gamle kromatogrammene. 11. Lagre sekvensen. 12. Trykk OK Start. 13. Chromelon er nå klar til analyse 5-6

6 6 6-6