Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria

Størrelse: px

Begynne med side:

Download "Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria"

Inga Rønning
8 år siden
Visninger:

1 Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria Bioingeniør Gunilla Løvgården Seksjon for utvikling, Ullevål Avdeling for mikrobiologi Oslo universitetssykehus Leishmaniasis forårsakes av parasitten Leishmania spredning via sandfluer særlig utbredt i Sør Amerika, India, Midtøsten, enkelte land i Afrika og rundt Middelhavet ulike Leishmania arter kan gi ulike former av sykdom behandling er kostbar og tilgjengelighet begrenset ingen vaccine insidens: tilfeller av visceral Leishmaniasis / år ,2 mill. tilfeller av kutan Leishmaniasis / år antall dødsfall: / år 1

2 Leishmaniasis 21 arter gir infeksjon hos mennesker: vanligste form sår i hud 1. slimhinner i nese, munn og svelg kan gi livstruende systemisk infeksjon benmarg, milt og lever

3 Dagens diagnostikk Dyrkning Mikroskopi kinetoplast kjerne CDC Centers for Disease Control and Prevention Leishmania real time PCR for mer sensitiv påvisning av Leishmaniasis for artsidentifikasjon Prøver Biopsi (10 20 mg) Benmargsaspirat (200 µl med EDTA) Fullblod (350 µl med EDTA) Analyse 1. Påvisning av Leishmania genus (påvist/ikke påvist) (real time PCR) 2. Artsidentifikasjon (real time PCR og sekvensering) EZ1 Biorobot (Qiagen) 3

4 Prøvebehandling Biopsi (10 20 mg): Prøven behandles med lysisbuffer tilsatt Proteinase K, 1 3 timer ved 56 C. DNA ekstraheres med Qiagen EZ1 DNA Tissue kit Benmargsaspirat (200 µl med EDTA): DNA ekstraheres direkte fra prøve med Qiagen EZ1 DNA Tissue kit Blod (350 µl med EDTA): DNA ekstraheres direkte fra prøve med Qiagen EZ1 DNA Blood kit 1. Påvisning av Leishmania genus real time PCR med 18S rdna som target gen kopier/genom Primere: Foulet et al JCM (45) p produkt: 149 bp probe: hydrolyse probe (TaqMan) med fluorochrome 4

5 positiv prøve positiv kontroll negativ prøve/negativ kontroll Tidsbruk: Biopsi: 3 timer + 15 min + 1 time 40 min = ca 5 timer Benmargsaspirat/blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer Deteksjonsgrense 10 fg DNA/PCR reaksjon (L.major DNA fra ATCC) < 1 parasitt/pcr reaksjon 3 10 parasitter i prøve Interferens Ingen kryssreaksjon med følgende agens: Streptococcus mitis Streptococcus pyogenes Mycobacterium intracellulare Mycobacterium avium complex Mycobacterium tuberculosis complex Staphylococcus aureus Plasmodium falciparum 5

6 2. Artsidentifikasjon real time PCR med Hsp70 genet som target sekvensering Primere: Van der Auwera et al Euro Surveill. 18 (30) Sekvensanalyse og typing 203 referansesekvenser ( Genbank (NCBI) 6

7 Positive kliniske prøver Prøve Smittested Materiale Ct 18S PCR Sekvensering Hsp70 1 Belize biopsi, hud 22,68 L.mexicana 2 Belize biopsi, hud 24,25 L.braziliensis 3 Belize biopsi, hud 26,4 L.naiffi (99%) 4 Belize biopsi, hud 25,81 L.mexicana 5 Israel biopsi, hud 30,5 L.major 6 Spania benmargsaspirat 33,5 L.infantum 7 Spania benmargsaspirat 35,18 L.infantum 8 Peru biopsi, hud 20,99 L.braziliensis 9 Sør-Amerika biopsi, gane 36,92 L.braziliensis 10 Afghanistan biopsi, hud 36,58 L. tropica/l.aethiopica 11 Syria biopsi, hud 29,93 L. tropica 12 usikkert benmargsaspirat 22,61 L.infantum Malaria Parasitten tilhører genus Plasmodium overføres fra hunnmygg av arten Anopheles til menneske >100 species av Plasmodium kun 5 species gir sykdom hos menneske Insidens: ca 200 mill. smittes årlig dødsfall: ca /år, 70% er barn < 5 år 7

8 P.falciparum P.vivax P.ovale P.malariae P.knowlesi CDC Centers for Disease Control and Prevention Plasmodium falciparum finnes over hele verden, ca mennesker dør hvert år av P. falciparum (WHO 2015) forårsaker alvorlig anemia, kan tette små blodårer som i hjernen kan gi cerebral malaria Plasmodium vivax mest i Asia, Latin America, og deler av Afrika. har hvilende leverstadier ("hypnozoites") som kan aktiveres flere måneder eller år etter infeksjon Plasmodium ovale mest i Afrika (vest Afrika) og stillehavsøyene. svært lik P.vivax og har også hvilende leverstadier Plasmodium malariae finnes over hele verden kan gi langvarig, kronisk infeksjon og nyresvikt hvis ubehandlet Plasmodium knowlesi finnes i sørøst Asia, og infiserer aper og også mennesker, spesielt i Malaysia kan gi alvorlig infeksjon, dødelige tilfeller er rapportert CDC Centers for Disease Control and Prevention 8

9 Dagens diagnostikk Mikroskopi Hurtigtest Malaria real time PCR forbedre sensitivitet og spesifisitet av malariadiagnostikk verifisere mistenkte og påviste tilfeller av malaria usikker artsbestemmelse ved mikroskopi og hurtigtest klinisk mistanke tross negativ mikroskopi og hurtigtest Prøver Fullblod (350 µl) EZ1 Biorobot (Qiagen) PCR oppsett 1. for verifisering av påvist Malaria Mix 1: P.falciparum Mix 2: P.vivax + P.knowlesi Mix 3: P.ovale + P.malariae 2. for påvisning av mistenkt Malaria Mix 1 3 Mix 4: P.genus Mix 5: ACTB Stratagene Mx3005P 9

10 Deteksjonsgrense Mikroskopi: 100 parasitter/µl blod (5 50 parasitter/µl blod) CareStart Malaria HRP 2/pLDH (Pf/pan) Combo Test: Sensitivity: P.falciparum 88,8%, P.vivax 77,6%, P.ovale 18,4%, P.malariae 30,4% (Maltha et al Malaria J) Real time PCR: P.fal: 0,06 parasitter/µl blod (20 parasitter/350 µl blod) P.vivax: < 5 parasitter/µl blod Interferens: Ingen kryssreaksjon med Toxoplasmose gondii, E.coli, S.aureus, L.infantum, L.donovani Tidsbruk: Blod: 15 min + 1 time 40 min = ca 2 timer 10

11 Resultat validering 8 positive prøver fra Canada (PCR) 39 positive prøver fra infeksjonsmedisin Ullevål (mikroskopi+hurtigtest) P.fal P.vivax P.ovale P.malariae P.knowlesi benign Sum Mikroskopi vår PCR Resultat Resultat PCR (Ct) Resultat Prøve Mikroskopi P.fal P.viv P.ova P.mal P.kno sekvensering 1 P.malariae? No Ct No Ct 35 No Ct No Ct P.ovale 3 P.malariae? No Ct 25,08 No Ct No Ct No Ct P.vivax 6 benign 21,2 No Ct No Ct No Ct No Ct P.fal 9 P.malariae? No Ct 25,87 No Ct No Ct No Ct P.vivax 11 P.fal 18,46 No Ct 36,19 No Ct No Ct P.fal 25 P.vivax No Ct No Ct 26,93 No Ct No Ct P.ovale Sekvensering av 18 prøver viser samme resultat som PCR Positive kliniske prøver Prøve Ct Art Kommentar 1 20,51 P.falciparum 2 19,95 P.falciparum 3 39,88 P.vivax 4 25,62/40,07 P.fal / P.viv 5 31,45 P.vivax 6 22,93/28,33 P.fal / P.ovale Hurtigtest: +, <1% parasitemi 7 20,65 P.falciparum Hurtigtest: non P.fal. 8 27,73 P.vivax 11

12 Samarbeidspartnere Avdeling for mikrobiologi, Ullevål Dr.scient Cathrine Fladeby Spesialbioingeniør Hilde Kleven Overlege Lumnije Dedi Overlege Fredrik Müller Infeksjonsmedisinsk avdeling, Ullevål Fagbioingeniør Mette Sannes Overlege Frank Olav Pettersen Overlege Mogens Jensenius 12

Like dokumenter

Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria

Molekylær diagnostikk av Leishmaniasis og Malaria Dr scient. Cathrine Fladeby Seksjon for utvikling, Ullevål Avdeling for mikrobiologi Oslo universitetssykehus Leishmaniasis WHO, Control of the leishmaniases