Organismer med strekkoder artsbestemming med DNA-sekvenser

Transkript

1 Torbjørn Ekrem og Bjarte H. Jordal Organismer med strekkoder artsbestemming med DNA-sekvenser Tenk deg at du er på tur i skogen, kanskje med en skoleklasse på slep, og finner en plante eller et dyr som du ikke har sett før. Du bryter av et fragment og putter dette i den medbrakte artsanalysatoren. I løpet av få minutter er arten bestemt og du har trådløs tilgang til et artsleksikon der arten er utførlig beskrevet med karakteristiske kjennetegn, utbredelse og biologi. Futuristisk drømmetekning? Ja, kanskje det, men denne fremtiden kan være nærmere enn vi er klar over. I denne artikkelen vil vi ta for oss hva DNAstrekkoding er, hvordan det kan brukes for å identifisere arter, og hvilke utfordringer denne metoden står overfor. Torbjørn Ekrem er Dr. Scient. fra Universitetet i Bergen, og er for tiden ansatt som postdoktorstipendiat ved Vitenskapsmuseet, NTNU i Trondheim. Ekrems vitenskaplige publikasjoner har i hovedsak fokus på taksonomi, fylogeni og zoogeografi til fjærmygg, men han har i den senere tid også arbeidet med molekylær evolusjon og bruk av molekylære metoder i biosystematikk. E-post: Torbjørn.Ekrem@vm.ntnu.no Bjarte H. Jordal er Dr. Scient. fra Universitetet i Bergen, og er ansatt som postdoktorstipendiat ved Vitenskapsmuseet, NTNU i Trondheim. Jordals vitenskaplige publikasjoner omhandler taksonomi, fylogeni og økologi hos barkbiller og andre snutebiller, samt utvikling av molekylære markører til bruk i molekylær systematikk. E-post: Bjarte.Jordal@vm.ntnu.no Hva er DNA-strekkoding? Kort sagt er DNA-strekkoding identifisering av arter ved hjelp av korte DNA-sekvenser. Prinsippet bak metoden er enkel: En database med DNA-sekvenser fra så mange identifiserte organismer som mulig blir konstruert og gjort tilgjengelig over internett. For å artsbestemme et individ man har funnet, kan man analysere DNA-molekylets sammensetning hos dette individet og deretter sende dets DNA-sekvens inn for sammenligning med andre sekvenser i databasen. Resultatet som man får i retur etter få sekunder, vil inneholde hvilken art i databasen som har størst likhet med den innsendte DNAsekvensen, og hvor stor denne likheten er. Hvis arten tidligere er registrert i databasen, kan man forvente å finne stor sekvenslikhet med den innsendte DNA-sekvensen, typisk mellom % (Figur 1). Identifisering av de fleste organismer har frem til i dag vært basert på en sammenligning av morfologiske eller økologiske karakterer som

2 Naturen nr Torbjørn Ekrem og Bjarte H. Jordal Figur 1. Resultat fra identifikasjon av gulfebermygg (Aedes aegypti) med COI i CBOL sin database. Et fylogram fra en «neighbour joining» analyse viser likhet mellom innsendt sekvens («Queried specimen») og sekvensene i databasen. Målestreken tilsvarer 2% ulikhet i treet. Utsnitt viser nærmeste slektskap. Foto av A. aegypti: US Department of Agriculture, public domain ( photos/aug00/k htm). varierer mellom arter, men ikke innen hver enkelt art. Slik er det også med DNA-strekkoding. Genet eller gensegmentet som skal brukes til artsidentifisering må vise variasjon mellom nært beslektede arter. Men også andre kriterier er viktige for at en relativt kort bit av DNA molekylet skal kunne brukes til artsbestemming: Det må lett la seg mangfoldiggjøre i så mange kopier at DNA sekvensen kan leses, det samme gensegmentet må kunne sekvenseres i så mange organismegrupper som mulig, og sekvensene bør være lette å sammenstille og analysere. Det finnes et par gener som i så måte viser seg å være gode kandidater for DNA-strekkoding: rbcl for planter og COI for dyr. Begge disse genene er universelle i henholdsvis grønne planter og dyr, og viser vanligvis tilstrekkelig variasjon mellom arter. Videre har primerne vist seg å være presise med hensyn til festepunkt på DNA molekylet, og de tilrettelegger dermed for direkte sekvensering av PCR-produktet. Både COI og rbcl er proteinkodende, og sekvenser fra fjernt beslektede arter er dermed enkle å sammenstille siden dette kan gjøres på grunnlag av sekvensenes aminosyrerekkefølge. For RNA kodene gener, som også ofte har tilstrekkelig interspesifikk variasjon, er vanligvis ikke dette mulig for hele gensekvensens lengde. Analysen av de sammenstilte sekvensene er basert på genetisk distanse, og presenteres grafisk ved hjelp av en såkalt «neighbour joining» analyse (Figur 1). Dette er en rask analysemetode som klarer å behandle mer enn hundre taksa i løpet av få sekunder. Metoden gir troverdige resultater

3 Torbjørn Ekrem og Bjarte H. Jordal Naturen nr mellom nært beslektede arter, men «neighbour joining» er mindre egnet for analysering av dypere slektskap. Det er derfor viktig å presisere at analysedelen i DNA-strekkoding ikke er en dyptgående slektskapsanalyse, men søker å påvise overenstemmelse med andre sekvenser i databasen (Figur 1). Derfor er man også avhengig av en god representasjon den organismegruppen man ønsker å identifisere i databasen. I eksemplet i Figur 1, har vi plukket ut en vilkårlig COI gensekvens av gulfebermygg (Aedes aegypti) fra NCBI GenBank, og sendt denne inn for sammenligning i CBOL sin database ( Etter et innledende BLAST-søk for utsortering av liknende sekvenser, blir en «neighbour joining» analyse med de 100 mest like sekvensene utført, og presentert i et fylogram. Boks 1: Ordforklaringer DNA-strekkode BLAST CBOL COI Interspesifikk variasjon Intraspesifikk variasjon PCR Primer rbcl (eng. DNA-barcode) Begrepet refererer til hvordan en enkel kode, i vårt tilfelle en DNA-sekvens, kan brukes til å identifisere en gjenstand, i vårt tilfelle en art. På samme måte som tradisjonelle strekkoder er unike for en vare i en butikk, vil DNA-sekvenser være karakteristiske for arter. (eng. Basic Local Aligment Search Tool) et søkeverktøy som sammenligner deler av en innsendt søkestreng (f. eks. en DNA-sekvens) med sammenlignbar informasjon i en database. (eng. Consortium for the Barcode of Life). Interesseorganisasjon for personer og institusjoner som engasjerer seg i DNA-barcoding ( (eng. cytochromoxidase subunit 1) en av tre gener i dyrs mitokondrielle genom som koder for aminosyrer til proteinet cytokromoksidase. Proteinet er en del av elektrontransportkjeden i cellenes mitokondrier. karaktervariasjon (morfologisk eller molekylær) mellom arter. karaktervariasjon innenfor en art. (eng. polymerase chain reaction) en metode for mangfoldiggjøring av små mengder DNA slik at DNA-molekylets baserekkefølge kan leses. et lite DNA segment som brukes som forankringspunkt og startsted for dannelse av nytt DNA. En viktig bestanddel i PCR-reaksjoner. (eng. ribulose-biphosphate-carboxylase large subunit) et gen i plantenes kloroplaster som koder for en del av aminosyrene til proteinet ribulosebifosfat-carboksylase. Proteinet deltar i fotosyntesen der det syntetiserer organisk karbon fra uorganisk karbon. Fordeler med DNA-strekkoding Det er en rekke argumenter for en storstilt satsing på identifisering ved hjelp av DNA-sekvenser: DNA-strekkoding kan identifisere arter på grunnlag av individfragmenter. Metoden vil raskt kunne påvise bruk av truede dyr eller

4 Naturen nr Torbjørn Ekrem og Bjarte H. Jordal planter i ubehandlede matvarer eller andre kommersielle produkter. For eksempel finnes det en tilnærmet komplett DNA-sekvens database over hval og delfiner ( Hvilken art hvalkjøttet i frysedisken tilhører kan dermed lett identifiseres, og saken kan eventuelt forfølges om kjøttet skulle vise seg å være fra en fredet art. Identifisering ved hjelp av DNA-strekkoding fungerer på alle livsstadier. Mange arter er vanskelige, til og med umulige å identifisere som larve, egg eller frø fordi de har få diagnostiske karakterer i sitt utseende. Dette er ikke til hinder ved indentifisering med DNA-sekvenser. DNA-strekkoding kan skille mellom kryptiske arter, dvs. nærstående arter som er morfologisk like, men som ikke utveksler genetisk materiale. Evnen til å sikkert kunne skille mellom slike arter vil være spesielt viktig i tilfeller der den ene organismen er uheldig for menneskers virke, mens den andre er tilnærmet harmløs. Avdekking av kryptiske arter gir derfor også et mer nøyaktig bilde av det biologiske mangfoldet. Identifisering ved hjelp av gensekvenser reduserer usikkerheten i en artsbestemmelse ved at nukleinsyrens digitale mønster, i form av sin tilnærmet unike baserekkefølge, er mer objektiv enn en beskrivelse av form, størrelse og farge. Oppbygging av en database med DNAsekvenser for identifisering av arter vil inkludere prøver av de millioner av objekter og individer som finnes i naturhistoriske samlinger, zoologiske og botaniske hager. Den oppmerksomheten som slike prosjekter kan rette mot disse institusjonene vil tydeliggjøre deres betydning som forskningsinstitusjoner og synliggjøre deres pågående arbeid for kartlegging og bevaring av biologisk mangfold. Et DNA-strekkoding prosjekt gir tilgang til mer data som kan plassere arter i livets tre (Figur 2). Arbeidet med en database som knytter gensekvenser til spesifikke individer i naturhistoriske samlinger, vil øke publikums tilgang til informasjon om enkeltarter, og øke interessen for et internettbasert artsleksikon der hver art har sin side med informasjon om utseende, utbredelse og biologi (Figur 2). Et DNA-strekkoding prosjekt vil åpne veien for utvikling av en bærbar artsanalysator til identifisering av arter ved hjelp av DNAsekvenser. En slik analysator vil for eksempel være et unikt hjelpemiddel for en person som ønsker å lære mer om det biologiske mangfold rundt seg, eller for en toller som ønsker å hindre innførsel av truede dyre- og plantearter. Forløpige problemer og utfordringer med DNA-strekkoding Det finnes tilfeller der DNA-strekkoding ikke vil fungere, og områder der denne metoden er uegnet. Noen ganger lykkes man ikke i å amplifisere (ved PCR) og sekvensere det utvalgte gensegmentet fra enkelte organismer. Dette kan skyldes dårlig kvalitet på individers DNA eller mangelfull kjennskap til genomets sammensetning for de aktuelle organismegruppene. Enkelte primitive organismegrupper som for eksempel bakterier og noen protoctister mangler mitokondrier og kloroplaster, og deres COI er ikke nødvendigvis homologt med det vi finner i flercellede dyr. I slike grupper må andre gener tas i bruk i artsbestemming med DNA-sekvenser. Videre finnes det grupper der de foreslåtte genene (f. eks. COI) mangler variasjon mellom nært beslektede arter, eller der variasjonen mellom arter ikke er større enn variasjonen innenfor en art (Figur 3). Det kan altså i enkelte tilfeller være vanskelig å avgrense arter på grunnlag av en enkelt gensekvens. Arter som har oppstått i nyere tid, for eksempel siste år, har gjerne ikke akkumulert mutasjoner nok til å reflektere en rask økologisk artsdannelse. En annen årsak til uklare skillelinjer mellom nært-

5 Torbjørn Ekrem og Bjarte H. Jordal Naturen nr Figur 2. Identifisering med DNA-strekkoding kan lenkes direkte til informasjonssider i et artsleksikon på internett og til plassering i livets tre. stående arter kan være at hybridisering har funnet sted uten at de involverte arters ekstistens har opphørt. Et slikt scenario medfører ofte at noen individer er gentisk mer i slekt med individer fra en annen art enn sin egen. Gener fra organeller nedarves som regel kun gjennom mødre (f. eks COI og rbcl), og kan være spesielt misvisende i slektskapsanalyser ved at de gir et annet evolusjonært signal enn gener fra det nukleære genom (Figur 4). Derfor er identifisering med gensekvenser fra mitokondrier eller kloroplaster i varierende grad usikkert, og man må ta i bruk kjernegener for å avklare artstilhørigheten til organismen. Flere tilhengere av DNA-strekkoding har i den senere tid foreslått at man bør benytte minst et nukleært gen som tillegg til de foreslåtte organelle-genene. Generelt sett er det vanskelig å si hvor mye genetisk variasjon som er naturlig innenfor en art, siden dette varierer en god del mellom organismegrupper. Etter hvert som flere populasjoner av nærtstående arter blir sekvensert, vil antakeligvis grensene mellom disse artene bli mer utflytende, og problemer tilknyttet artsavgrensning og intrakontra interspesifikk variasjon vil bli tydeligere. Dette problemet eksisterer imidlertid allerede for morfologisk karakterisering av arter, og DNAsekvenser fra strekkoding-prosjekter vil i de fleste tilfeller være svært fordelaktige siden de supplerer diagnostiske karakterer basert på morfologi. For å redusere feilbestemmingfaren i grupper med stor intraspesifikk variasjon, er det anbefalt at man bruker minst tre individer fra hver populasjon i DNA-strekkoding. Kvalitetssikring av DNA sekvensenes taksonomiske tilhørighet er umåtelig viktig for at strekkode-databaser skal gi en høyest mulig presisjon. Det er i mange tilfeller vanskelig eller lite ønskelig å bruke deler av en holotype til DNA sekvensering, og identifisering av det sekvenserte individet som representerer arten vil derfor være helt avhengig av taksonomisk ekspertise for mange organismegrupper. Taksonomi og systematikk er dynamiske vitenskaper der man kan forvente endringer i art- og slektskapshypoteser, og det vil derfor være nødvendig at sekvensene i en strek-

6 Naturen nr Torbjørn Ekrem og Bjarte H. Jordal Figur 3. Diagrammet viser en hypotetisk fordeling av prosentvise forskjeller mellom par av sekvenser innen art A, mellom art A og art B, og mellom art A og art C. Konfliktsonen henviser til et område med sammenfallende sekvensdivergens mellom de to artene A og B. I konfliktsonen kan ikke prosentvis forskjell benyttes til å diagnostisere arter slik man kan med henblikk på artene A og C. kode-database følges av detaljert informasjon om Figur 4. Slektskapet mellom fire individer fra artene A og B. Et stamtre rekonstruert med DNA-sekvenser fra et gen (et gentre) kan avvike fra et annet gentre på grunn av tilfeldig sortering av ulike genvarianter hos stamfaren til de to artene. Det striplete gentreet samsvarer her med artstreet, mens det prikkede gentreet viser at individ B-1 grupperer sammen med art A. Slike avvik mellom gentrær, og mellom gentrær og artstrær opptrer oftest når artene er meget nærstående.

7 Torbjørn Ekrem og Bjarte H. Jordal Naturen nr det individet som DNA-prøven er tatt fra, inkludert lokalisering av referansemateriale og opplysninger om hvordan individet ble identifisert. Et argument mot DNA-strekkoding har vært at DNA-sekvensering er kostnadskrevende, og dermed en metode som er vanskelig tilgjengelig for mange taksonomer. Dette argumentet er i minkende grad relevant, siden de fleste universiteter og naturhistoriske museer i dag har tilgang til molekylærsystematiske laboratorier, og prisen på denne type analyser har sunket drastisk de senere årene. Sekvensering av et gen for et individ vil eksempelvis neppe koste mer enn rundt 200 kroner (eksklusive arbeidstid). Har man ikke tilgang til et eget laboratorium, finnes det i dag ulike firma som tar på seg denne typen sekvenseringsoppdrag for godt under tusenlappen per art. Fremtidsutsikter Til tross for at DNA-strekkoding står overfor enkelte betydelige utfordringer, samt at disse metodene vil være uegnet for noen typer organismer, så viser flere større empiriske undersøkelser (blant annet på Nord Amerikanske sommerfugler, Hebert et al. 2003, og verdens hvaler, Ross et al. 2003) at identifisering ved hjelp av DNA-sekvenser gir sikre bestemmelser. Vi mener at DNA-strekkoding vil bli et meget verdifullt verktøy for taksonomer i fremtiden, og at et fokus på artsspesifikke DNA-sekvenser vil være en praktisk innfallsvinkel for interessante studier av artsdannelse, fylogeni og zoogeografi. Vår oppfatning er at et fokus på DNA-strekkoding ikke vil være på bekostning av tradisjonell taksonomi og artskunnskap, men at metoden blir et hendig supplement til mer tradisjonelle studier. Identifisering av arter med DNA-sekvenser vil også være en naturlig lenke til et nettbasert artsleksikon der informasjon om arter kan samles (Figur 2). I så måte vil DNA-strekkoding kunne bidra til økt artskunnskap hos forskere og i befolkningen forøvrig, og gjøre aktuell informasjon om alle organismer lettere tilgjengelig. Videre lesning: Blaxter M.L The promise of a DNA taxonomy. Philosophical Transactions: Biological Sciences 359: Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L. og dewaard J.R Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings: Biological Sciences 270: Ross H.A., Lento G.M., Dalebout M.L., Goode M., Ewing G., McLaren P., Rodrigo A.G., Lavery S. og Baker C.S DNA Surveillance: Web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. Journal of Heredity 94: