«Buffy» innen forskning:

Transkript

1 «Buffy» innen forskning: Friske immunceller lærer oss forsvarsmekanismer mot sykdom Markus Haug, IKM/CEMIR, NTNU Nasjonal Blodbankkonferanse 4. Juni 2015

2 Oversikt Bruk av «buffy» til forskning ved IKM/CEMIR Isolering av PBMC fra «buffy» Forskningsprosjekt 1: Makrofager Effekt av KEAP1-knock-down på mykobakterie-infeksjoner i primære humane makrofager Forskningsprosjekt 2: CD4+ T celler Ekspansjon av mykobakterie-spesifikke CD4+ T celler fra friske donorer Autofagi i primære humane CD4+ T celler

3 Bruk av «buffy innen forskning» ved CEMIR/IKM: Opp til 6 ferske buffy per uke fra blodbanken ved St. Olavs Hospital, ca. kl. 13 I tillegg opp til 8 buffy som fra «gårsdagen» (har ligget over natt) Samarbeid ved CEMIR: Isolerte celler fra buffy coat deles opp til forskjellige prosjekter Felles til alle forskningsprosjekter: Isolering av perifere mononukleære celler (PBMCs) «density-gradient» sentrifugering («lymphoprep», «ficoll-paque») Kultivering av PBMC: Medium som inneholder 5-30 % serum (samme blodgruppe som buffy donor)

4 Hva forskes det på immunceller isolert fra buffy coat ved CEMIR/IKM? Forskningsfokus ved CEMIR på monocytter og makrofager: Inflammasjonsmekanismer av det medfødte immunforsvaret mot patogener (for eksempel mykobakterier, S. aureus) «steril» inflammasjon: endogene faresignaler som for eksempel kolesterolkristaller, (nano)partikler involvert i fremkalling av astma og allergier Forskning på pattern-recognition reseptorer (for eks. «Toll-like»- reseptorer), inflammasom-aktivering, intracellulære traffickeringsmekanismer, Forskning på CD4+ T celler: Mykobakerie-spesifikke T celleresponser Autofagi i T celler In-vitro infeksjon av T celler med HIV

5 PBMC-isolering («Density-gradient» sentrifugering) Fortynning med PBS «Layering» over lymphoprepløsning «Density-gradient» sentrifugering Høsting og vasking av PBMCs

6 PBMC-isolering («Density-gradient» sentrifugering) Fjernet: Trombocytter Granulocytter Erytrocytter PBMCs Viktigste celletyper: T celler B celler NK celler Monocytter Dendrittiske celler Isolering fra 1 buffy: ~ x 10 6 PBMCs

7 CD4 SSC CD14 Phenotypisering av PBMCs med flow-cytometry Monocytter PBMCs T celler FSC CD3 CD4+ T celler CD8+ T celler CD8

8 CD14 Makrofager: In vitro differensiering fra monocytter (MDMs, monocyte-derived makrophages) Monocytter CD3 Makrofager MDM-differensiering: Monocytter: adherer raskt til overflater PBMCs inkuberes 1h på cellekulturbrett Non-monocytter vaskes bort 5-10 dager cellekultur med M-CSF (50pg/ml): Monocytter differenserer til makrofager Makrofager brukes til forskjellige forsøk: Måling av inflammasjonsresponsen Infeksjonsforsøk (mykobakterier, S. aureus) Knock-down av proteiner med sirna Hovedmetoder: qpcr, Konfokalmikroskopi, Western Blot, ELISA, multiplex, nanostring,

9 Forskningsprosjekt 1: Makrofager «KEAP1-prosjekt» KEAP1: oxidative stress sensor protein Prosjektet beskriver en ny rolle for KEAP1 i regulering av inflammasjon i respons til infeksjoner med Mycobacterium avium I primære humane makrofager. Alle forsøk i prosjektet ble gjennomført med primære humane makrofager generert buffy coat isolerte monocytter (MDMs): Makrofager differenseres (7d) Knock-down av KEAP1 protein: 2 x sirna behandling av makrofagene (d7, d9) In vitro infeksjon av makrofagene med Mycobacterium avium (d10)

10 Keap1 regulates inflammatory signaling in M. avium infected human macrophages Jane Atesoh Awuh 1,2, Markus Haug 1,2, Jennifer Mildenberger, Anne Marstad 1,2, Claire Louet, Chau Phuc Ngoc Do 1,2, Jørgen Stenvik 1,2, Magnus Steigedal 1,2, Jan Kristian Damås 1,2,3, Øyvind Halaas 2, Trude Helen Flo 1,2* 1 Centre of Molecular Inflammation Research, and 2 Department of Cancer Research and Molecular Medicine, Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Norway 3 Department of Infectious Diseases, St. Olavs hospital, Trondheim, Norway PNAS, resubmission deadline

11 Foreslått mekanisme: Keap1 nedregulerer inflammatorisk signalering og cytokin-produksjon (hindrer IKKβ nedbryting) M. avium Økt vekst av mykobakterier i makrofager Keap1 PRRs Keap1 PRRs Keap1 Cytoplasm Keap1 TBK1 IKK NF-кB IRFs inflammatory cytokines/ifns Nucleus Normal processes Inhibits M. avium survival Promotes M. avium survival Awuh et al., PNAS, in revision Keap1-regulated processes live M. avium dead M. avium

12 CD4 Forskningsprosjekt 2: Mykobakerie-spesifikke CD4+ T celler Ekspansjon av antigen-spesifikke CD4+ T celler fra friske donorer Måling av cytokin-produksjon og autofagi CD4+ T celler CD8 Antigen-spesifikke T celler produserer effektorcytokiner etter kontakt med antigen Cytokiner kan analyseres med flow-cytometri

13 Mycobakterie-spesifikke T celler i friske donorer Målbar i PBMCs fra friske donorer (buffy), men veldig lav frekvens Sannsynpligvis pga BCG vaksinering og atypiske mykobakterier i omgivelser Hovedmål: Etablere protokoller til å ekspandere mykobakterie-spesifikke CD4+ T celler i et humant, autolog system fra friske donorer Bruke de ekspanderte antigen-spesifikke CD4+ T celler analyse av autofagi i T celler, effektor-cytokin-produksjon, T celledrap av infiserte makrofager, Proskjekt i oppstartsfasen

14 Analyse av of mykobakterie-spesifikke CD4+ T celler fra buffy-isolerte humane PBMCs Friske donorer: Veldig få mykobakteriespesifikke T celler Healthy donor; freshly isolated PBMCs Stimulation: 16 h with MTb PPD 10 µg/ml IFN-γ IL TNF-α Triple producers Double producers Single producers Master project: Habtamu Adnew Chonchoro

15 TNF TNF In vitro expansion av mykobakterie-spesifikke CD4+ T celler T cells Day 0 Day antigen Read-outs T cell functions (autophagy, activation, cytokines) Mycobacterial killing PBMCs from buffy Monocytes Macrophages Infection Macrophage-effects M. avium unstimulated M. avium IFN-g IFN-g

16 In vitro expansion av mykobakterie-spesifikke CD4+ T celler T cells Day 0 Day antigen Read-outs T cell functions (autophagy, activation, cytokines) Mycobacterial killing PBMCs Monocytes Macrophages Infection Macrophage-effects Knock-down av stress-sensor KEAP1 i makrofager før mykobakterieinfeksjon effekt på T celleaktivering?

17 RLU TNF In vitro expansion av mykobakterie-spesifikke CD4+ T celler T cells Day 0 Day antigen Read-outs T cell functions (autophagy, activation, cytokines) Mycobacterial killing PBMCs Monocytes Macrophages Infection Macrophage-effects Hemming av mykobakteriell indusert av antigen-spesifikke T celler IFN-g 24 hr vs 72 hr Ø IFN-g/T-cells IFN-g (1000U/mL) T- cells (T-cells:MØ 5:1) 0 24 hr 72 hr

18 Måling av autofagi i aktiverte CD4+ T celler Autofagi: Mekanisme som induseres i mange celletyper under stress Induseres i CD4+ T celler etter aktivering Lite undersøkt i antigen-spesifikke CD4+ T celler eller i virus-infiserte T celler Konfokal-mikroskopi Flow-cytometri unstimulated activated autofagi Master project Hany Ibrahim

19 Autofagi er økt i aktiverte CD4+ T celler som produserer effektor-cytokin IFN-γ Master project Kingsley G. Kumashie

20 Noen fordeler og ulemper ved bruk av immunceller fra buffy coat til forskning Fordeler: Forskning på primære humane celler er det nærmeste man kommer in vivo situasjonen Ingen gode cellelinje-systemer for forskning på makrofager og T celler Inflammasjonsrespons i cellelinjer forskjellig fra primærceller Ulemper: Store donor-til-donor variasjoner ofte mange forsøk nødvendig for å være sikker på et funn Primærceller vanskelig å manipulere (knock-down, overekspressjon) Isolasjon av nye celler til hvert forsøk Forskning avhengig av jevn tilgang til blod-donasjoner

21 Acknowledgements Trude H. Flo Jane A. Awuh Anne Marstad Jørgen Stenvik Claire Louet Jennifer Mildenberger Jan Kristian Damås Magnus Steigedal Øyvind Halaas Hany Ibrahim Kingsley G. Kumashie Habtamu Chonchoro Blodbank ved St. Olavs Hopital + alle blodgivere