Innføring i flowcytometri Metode, instrument, standardisering

Transkript

1 1 Innføring i flowcytometri Metode, instrument, standardisering Hilde Greva Sølberg Fagansvarlig bioingeniør Avd. for immunologi og transfusjonsmedisin. Dato: Metode Tidligere metoder lot oss differensiere mellom erytrocytter, og forskjellige kategorier av leucocytter men ikke undergrupper av lymfocytter 1

2 3 «Flowcytometri -er en hurtig, objektiv og kvantitativ metode til analyse og sortering av celler i en løsning. En multiparameter analyse» Fra Store medisinske leksikon 4 Analysemateriale -Perifert blod (EDTA og Heparin) -Benmarg (Heparin) -Bronkialskyllevæske -Cerebrospinalvæske (CSF)( Transfix/ EDTA) -Lymfeknuter (Transfix/ EDTA) -Plasma (EDTA ) og serum. -Andre kroppsvæsker som pleuravæske (EDTA), acites, etc. 2

3 Analyserepertoar 5 HLA-B27 typing Leukocyttkontroll av blodprodukter, Leucocount Immunsviktutredninger og kontroll av medikamentbehandling - B-celle subpopulasjoner /Plasmablaster - Absolutt tall lymfocytter -Burst-test - Leukocytt Adhesjonsmolekyler CD34 telling v HMAS Immunfenotypinger -Akutte leukemier -Lymfoproliferative sykdommer -MRD kontroller -PNH Trombocyttantistoff test EMA(Hereditær sfærocytose- test) Prosjekter, forskning CD markører: 6 Cluster of Differensiation/ Cluster of Designation. Introdusert i Paris i 1982 (1st International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA)). I dag har vi fått identifisert mer enn 370 unike CD- markører. Kilder:Flow Cytometry in Clinical Diagnosis, Carey,McCoy, Keren, Wikipedia 3

4 Antistoff En B-lymfocytt produserer mange identiske antistoff. Når én klon av B-lymfocytter produserer antistoff kaller vi dette et monoklonalt antistoff - Mab. 7 Polyklonale antistoff -Pab er mange kloner som kommer fra en utgangscelle. En heterogen blanding av antistoff som gjenkjenner multiple epitoper Fra MBL Life science Fra Store medisinske leksikon Kloner 8 Kvalitetssikring av flowcytometriske analyser 8 4

5 Fluorochrommer 9 Fluorochrommer 10 Laser Fluorochrome Kortnavn Emissjon nm Band /filter Styrke Fiolett Pacific Blue PacB /50 Dim 405 nm solid state Horizon Brilliant Violet 421 BV /50 Bright Horizon Brilliant Violet 510 BV /50 Moderat Horizon Violet 450 V /50 Dim Horizon Violet 500 V /50 Dim Blå propidium bromide PI nm solid state Fluorescein isothiocyanate FITC /30 Moderat R phycoerythrin PE /42 Bright Peridinin Chlorophyll protein PerCP LP PerCP Cyanine 5.5 PerCP Cy LP Moderat 7 aminoactinomycin D 7 AAD LP PE Cyanine 7 PE Cy 7 /PC /60 Bright Rød Allophycocyanin APC /20 Bright 633 nm HeNe APC Cyanin 7 APC Cy /60 Dim APC Hilite7 APC H /60 Dim 5

6 Valg av paneler 11 NOPHO - NFCG og Euroflow gir sine anbefalinger mht -CD markører -kloner og -fluorochrommer som er informative i samme rør Antigentetthet høy til lav CD 45 CD 3 CD 8 CD 16 CD 56 CD 57 CD 7 Fluorochrom styrke/klarhet lav til høy V500 V450 APC-H7 PerCP-Cy5.5 FITC PE-Cy7 APC PE 6

7 13 LYMFOPROLIFERATIV Etikett: Dato: Materiale: Sign lege(r): Prøve mottatt: kl: Prøve analysert: kl: WBC: x10 9 /L WBC/analyserør: x10 6 /rør Kommentar: Filene exportert til X:\ B 1 CD23 2,5 CD10 2,5 CD79b 2,5 CD19 2,5 CD200 5 CD43 2,5 CD20 2,5 CD45 2,5 CLL vs andre B 2 CD103 5 CD11c 2,5 CD19 2,5 CD22 2,5 CD81 2,5 FMC7 5 CD45 2,5 klassifisering B 3 CD25 10 CD27 10 CD19 2,5 IgM 5 CD38 2,5 CD20 2,5 CD45 2,5 B kl switch/memory IgD 5 / IgG4 rel disease ( ) B 4 Kappa Lambda 2,5 CD5 15 CD19 2,5 CD10 2,5 CD38 2,5 CD20 2,5 CD45 2,5 Foll. Lymfom ( v/ MRD) B 5 Kappa Lambda 2,5 CD5 15 CD19 2,5 CD200 5 CD43 2,5 CD20 2,5 CD45 2,5 MCL ( v/ MRD) T 1 CD8 2,5 CD7 5 CD3 5 CD2 2,5 CD5 2,5 CD4 2,5 CD45 2,5 T c Panantigen T 2 5 CD30 5 CD3 5 CD56 2,5 CD326 1 CD20 2,5 CD45 2,5 Anaplasisk Sign bioing: Antistoffkombinasjon PerCP PB/HRZ Rutineanalyse: events Dato Rør FITC µl PE µl Cy5.5 µl PE Cy7 µl APC µl APC Cy7/H7 µl V450 µl HRZ V500 µl CD8 og 2,5 CD56 og 2,5 CD19 og LST Lambda 5 kappa 5 CD5 15 TCRgd 2,5 CD3 2,5 CD38 2,5 CD20 og CD4 2,5 CD45 2,5 LST screening ( v/ MRD) NK1 CD57 5 CD26 10 CD3 5 CD56 2,5 CD7 2,5 CD19 5 CD4 2,5 CD45 2,5 aberant NK/Sezary NK2 cy Perforin* 10 cy Granzyme* 15 CD3 5 CD56 2,5 CD94 5 CD19 5 HLADR 2,5 CD45 2,5 aberant NK/cytotox Antistoffkombinasjon P1 og P2 rør. Lyseres før merking. PerCP FITC PE CY5.5 PE Cy7 APC APC C750 BV421 BV510 CD117 CD81 P1 4,2 8,5 MRD myelomatose har eget panelark CD38 10 CD56 3,5 CD45 17 CD19 4,2 CD138 3,5 CD27 17 P2 cyigk* 4,2 cyigl* 4,2 Intracellulær Antistoffer i boks mrk MM Next Gen Granzyme Perforin * metode. og boks mrk div. mabs LST: Benytt 25 µl av cocktail, tilsett PerCp Cy5.5, PE Cy7 og APC Cy7/H7 i tillegg. B1 og B2 cocktail: Benytt 20 µl av mix, tilsett PE CY7 og APC Cy/H7 i tillegg. T1 cocktail: Benytt 15 µl av mix, tilsett PerCP Cy5,5 og PE Cy7 i tillegg. Tillaging av cocktailer: I:\STOLAV Laboratoriemedisin\AIT\S Imm Cyt\Cytometri\Kvalitet\Analytisk kvalitet Tilhører EQS prosedyre 8482 "Immunfenotyping ved flowcytometri" «Merking» av prøve 14 Antistoff mot CD3 konjugert med FITC Innsamling i Flowcytometer Pasientens celler Alle T-lymfocytter er merket med anti-cd3 7

8 Metode 15 Instrument Første generasjon flowcytometre på kliniske laboratorier rundt FACScan flowcytometer FACSCanto A FACSCanto II FACSLyric 8

9 Instrument 17 Florescence detection 6 to 8 photomultiplier tube detectors: Bølgelengder fra blå 488-nm laser: nm (PE-Cy7) nm (PerCP-Cy5,5) nm (PE) nm (FITC) Bølgelengder rød 633-nm laser: nm (APC-Cy7) nm (APC) Bølgelengder fiolett 405-nm laser: nm (Pacific Blue ) Forward scatter detection Side scatter detection Photodiode with 488/10 bandpass filter PMT with 488/10 bandpass filter 18 9

10 19 Instrument Setup: BD FACSCanto og FACSDiva clinical software 7 color Setup Beads fra BD Biosciences. Cytometer Setup & Tracking fra BD Biosciences. EuroFlow Standard Operating Protocol for instrument Setup and Compensation. Instrument Setup 7 color Setup Beads 20 Benytter i BD FACSCanto clinical software. Gir en automatisk kompensering og cytometer kvalitetskontroll. 4 μm beads Unlabeled PerCP Cy5.5 PE Cy7 APC Cy7 6 μm beads unlabeled FiTC PE PerCP APC From BD FACSCanto II Instructions for use Part No Rev A, 4/09 Kvalitetssikring av flowcytometriske analyser 10

11 Instrument Setup 21 7 color Setup Beads Cytometer setup blir utført på følgende to scatter and seven fluorescerende detektorer: forward scatter detector (FSC) side scatter detector (SSC) fluorescein (FITC) R phycoerythrin (PE) peridinin chlorophyll protein (PerCP) PerCP cyanine 5.5 tandem (PerCP Cy 5.5) PE cyanine 7 tandem (PE Cy7) allophycocyanin (APC) APC cyanine 7 tandem (APC Cy7) Når Setup er completed successfully, står det PASS på Overall Result. From BD FACSCanto II Instructions for use Part No Rev A, 4/09 Instrument Setup The Cytometer Setup and Tracking( CS&T) funksjon i BD FACSDiva software 22 Definerer baseline performance i cytometeret( blank grunnberegning). Overvåker ytelsen til cytometeret. Etablerer og oppdaterer automatisk programspesifikke innstillinger. The CS&T Beads varierer i relativ intensitet: dim(2µm), medium og bright( 3µm). BD Cytometer Set up and Tracking Application Guide Part No Rev.A June

12 Standardisering 23 From BD Cytometer Set up and Tracking Application Guide Part No Rev.A June EuroFlow SOP for instrument Setup and Compensation 12

13 Standardisering 25 På et 8-farge panel trenger vi å justere 56 verdier. Kalkulasjonene blir gjort ved å benytte Kompensasjon - funksjonen i BD FACSDiva software From BD FACSDiva software 6.0 Reference Manual Part.No Rev.A June 2007 Standardisering 26 FlowJo Media 13

14 27 Takk for oppmerksomheten 14