Kromatografikurs NITO 23. og 24. mai 2018 En LCMSMS metode fra A til Å fra utvikling til implementering Trine Naalsund Andreassen, Kjemiker Karen Raaen Roland, Bioingeniør Avdeling for klinisk farmakologi Avdeling for klinisk farmakologi St. Olavs hospital Seksjon legemiddelanalyser (helsesekretærer, bioingeniører) Seksjon rusmiddelanalyser (helsesekretærer, bioingeniører) Seksjon analytisk FOU (kjemikere, bioingeniører) Seksjon medisin (leger) Seksjon medisinsk FOU (leger) Seksjon legemiddelsikkerhet (leger og farmasøyter) RELIS (farmasøyter) 1
En analysemetode fra A til Å Utvikling Evaluering Validering Rutinedrift Implementering 2
En analysemetode fra A til Å Utvikling Evaluering Validering Rutinedrift Implementering Oppstart Hvorfor ønsker man å lage en ny metode? Forenkle/ forbedre en gammel metode Nye analytter HMS Fjerne skadelige kjemikalier Hva vil en ny metode innebære av endringer risikovurdering Analytter/ metodikk (utfordrende analytter, måleområde, holdbarhet) Økonomi (nye instrument, nytt utstyr, kostbart forbruksmateriell, dyre renstoff) HMS (løsemidler, arbeidsprosesser) 3
Oppstarts møte Oppstarts møte Analytter og måleområde (kvantitative metode) Analytt Ønsket måleområde (nm) Flekainid 50-5000 Sertralin 5-1000 Fluoksetin 50-2500 Norfluoksetin 50-2500 Klorprotiksen 1-1000 Aripiprazol 25-2000 Dehydroaripiprazol 25-1000 Vortioksetin 5-250 4
Oppstarts møte Prøvematriks Oppstarts møte Presisjon og nøyaktighet (riktighet) 5
Oppstarts møte Analyseteknikk GC MS/FID, UPLC MSMS, UPLC QTOF, UPC2 MSMS Antall prøver Oppstarts møte 6
Oppstarts møte Renstoff Renstoff til standarder Leverandør 1 Renstoff til kvalitetskontroller Leverandør 2 Intern standard 2 H 13 C LC MSMS metodeutvikling 7
MS og MSMS Fosfatidyletanol Negativ 702,7 g/mol ionisering m/z 701,7 (moderion/percousor ion) Kollisjonsgass (Argon) m/z 255,2 + m/z 281,2 MSMS Overgang Analytt (m/z) Kvantifiserings Kvalifiseringsion -ion Flekainid 415,3 > 98,1 415,3 > 301,1 Sertralin 306,2 > 159,0 306,2 > 275,1 Fluoksetin 310,2 > 148,1 Norfluoksetin 296,2 > 134,1 Flekainid-d 3 418,3 > 98,1 Sertralin-d 3 309,1 > 159,0 Fluoksetin-d 5 315,2 > 153,1 Norfluoksetin-d 5 301,2 > 139,1 8
Kolonner brukes til en eller flere metoder? en eller flere analytter i metoden? sjekk litteratur ph? Snakk med leverandører! Mobilfaser unngå bruk av helsefarlige kjemikalier (MeOH før ACN, heksan og diklormetan) sammensatte mobilfaser = tar tid ph justering = tar tid sjekk litteratur 9
Kolonner og mobilfaser Kolonne phområde BEH C18 1 12 BEH Phenyl 2 11 HSST3 2 8 Mobilfaser MeOH ACN H 2 O + 0,1 % maursyre NH 4 format, ph 10,1 * Kolonnekromatografi utgangspunkt Mobilfase: isokratisk (50/50 organisk/vanndig) Mobilfasehastighet: 0,5 ml/min. Analysetid: 5 10 min. (kolonne 5 cm) * Sluttprodukt: Mobilfase: gradient Mobilfasehastighet: 0,5 0,8 ml/min. Analysetid: ca. 2 2,5 min. 10
0222B_TNA_HSST3_ACN_9 0.63 100 60 % 0,1 % FA i H2O 40 % ACN 1: MRM of 5 Channels ES+ 414 > 396 (Norbuprenorfin) 4.21e4 70 % 0,1 % FA i H2O 30 % ACN 0222B_TNA_HSST3_ACN_9_ACN1 0.81 100 1: MRM of 5 Channels ES+ 414 > 396 (Norbuprenorfin) 1.24e5 0.61 1.78 1.80 % 1.75 1.88 % 1.70 1.25 1.59 0.50 0.72 0.76 1.30 0.96 0 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 0222B_TNA_HSST3_ACN_9 2: MRM of 3 Channels ES+ 0.78 100 468 > 396 (Buprenorfin) 2.89e5 0 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 0222B_TNA_HSST3_ACN_9_ACN1 2: MRM of 3 Channels ES+ 0.97 100 468 > 396 (Buprenorfin) 4.70e5 % % 0 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 Time 0 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 Time * Eksempel Morfin 285 g/mol Morfin 3 glukuronid (M3G) Morfin 6 glukuronid (M6G) 461 g/mol 461 g/mol 11
MSMS Analytt Kvantifiserings-ion Overgang (m/z) Kvalifiserings-ion Morfin 286 > 201 286 > 165 M3G 462 > 286 462 > 201 M6G 462 > 286 462 > 201 * UPLC MSMS M3G/M6G 0125DM1_2_08 Std4 100 M3G* F38:MRM of 2 channels,es+ 462.1 > 286 2.829e+007 M3G og M6G % M3G M6G 0 0125DM1_2_08 Std4 100 M3G* 0.89 min F38:MRM of 2 channels,es+ 462.1 > 201 2.297e+007 M3G og M6G % M3G M6G 0 0.650 0.700 0.750 0.800 0.850 0.900 0.950 0.89 min 12
Prøveopparbeidelse * Prøvevolum Begrenset/ubegrenset prøvevolum? Høy/lav kons. av analytt? Antall analytter Selektiv (SPE, væske væske) Generell prøveopparbeidelse (proteinfelling, fortynning) Tid Opparbeidelse vs. vedlikehold? Kostnader Opparbeidelse vs. vedlikehold? 13
* Enkel proteinfelling Fosfatidyletanol (PEth; alkoholmarkør) 450 µl isopropanol with internal standard (PEth-d 5 ) 150 µl blood Mix (2100 rpm x 1 min.) Spin (4600 rpm x 5 min.) Standardkurver (Std) og interne kontroller (QC) 3.00 Response 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 Ziprasidon ID Std. Conc nm % avvik Standard 1 10 10 0,1 Standard 2 50 50 0,3 Standard 3 250 249 0,3 Standard 4 500 501 0,2 Standard 5 1000 1000 0,0 QC 1 15 15 1,8 QC 2 150 152 1,0 QC 3 800 818 2,3-0.00 nm -0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 14
Standardkurver (Std) og interne kontroller (QC) Response 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 QC2 QC1 QC3 Ziprasidon ID Std. Conc nm % avvik Standard 1 10 10 3,9 Standard 2 50 49 2,8 Standard 3 250 239 4,3 Standard 4 500 522 4,3 Standard 5 1000 989 1,1 QC 1 15 15,7 4,9 QC 2 150 165 10 QC 3 800 1016 27-0.0 nm -0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 FASE 1: FASE 2: Hendelse (Hva kan gå galt, problem, utfordringer?) Hovedgruppe 1 Analytter, metodikk Undergrupper Nye og/eller utfordrende analytter, inkl. kirale, isomerer Risikovurdering Konsekvens K (1 5) Sannsynlighet S (1 5) Risiko K x S FASE 3: Kommentarer 1 1 1 Analyttene finnes i eksisterende rutinemetode Stort antall analytter 1 1 1 Kun to analytter Store forskjeller i måleområde 1 1 1 Ganske likt for analyttene 2 Renstoff Vanskelig tilgjengelighet (kun en leverandør, produseres på bestilling) 4 Forbruksmat eriale 1 1 1 Renstoff lett tilgjengelig. Flere produsenter som kan levere disse analyttene. Lang leveringstid 1 1 1 Dårlig holdbarhet, hygroskopisk 1 1 1 Analyttene er kjente, og det har ikke vært problemer med holdbarhet. Se batchlogg. Ekstraksjonsplater 1 1 1 Standard opparbeidelse med Ostroplater Oppsamlingsplater 1 1 1 2 ml Waters plater Spesielle reagenser 1 1 1 Nei FASE 4: Risikoreduserende tiltak 6 Analyseinstrument Kapasitet/tilgjengelighet 1 4 4 Har back up instrument (LC MSMS G) Tidsbruk 1 1 1 Analysen har kort run tid Nye mobilfaser 1 1 1 Samme mobilfase som EveroTakro Nye kolonner 1 1 1 BEH phenyl, samme som EveroTakro 7 HMS Kjemikalier, sikkerhet 1 2 2 Eksponering av MeOH i tillaging av mobilfase, ACN ved bruk av PPP på benk Bruk vernebriller ved skifte og tillaging av mobilfase Biologiskmateriale, smitte 2 3 6 Pasientprøver kan forårsake smitte Bruk av hansker ved håndtering av prøver 8 Robusthet, kritiske trinn Holdbarhet, dårlig forsegling med alu folie 2 1 2 Dårlig forsegling med alu folie kan medføre fordamping av prøve. Forsegling skal sjekkes. Dårlig forsegling kan medføre at prøve fordamper. 15
Finjustering av UPLC MSMS metoden Injeksjonsvolum Detektorspenning Mobilfasegradient Ione overganger LC MSMS MS/MSMS LC Prøveopparbeidelse LC MSMS metoden LC MSMS metode? 16
LC MSMS metoden Validering Validering er en prosess hvor man undersøker metodens muligheter og begrensninger under gitte betingelser. 17
Validering Valideringsplanen Hva? Hvordan? Krav (kriterier for godkjennelse)? Validering * Valideringsplan hva LOD/LOQ Standarkurvens tilpasning og måleområde Presisjon Nøyaktighet Selektivitet Spesifisitet Matrikseffekter Ekstraksjonsutbytte Overdrag (LC systemet) Stabilitet av retensjonstid Stabilitet av ioner Robusthet Variasjon i intern standard areal Holdbarhet Metodesammenligning Samkjøring Estimering av bidrag til måleusikkerhet 18
Validering Holdbarhet Pasientprøver 30 C 3 og 7 dager Gelrør 30 C 1 og 3 dager Pasientprøver 4 8 C 1,2 og 4 uker Holdbarhet Std/QC 4 8 C 1 uke Holdbarhet Std/QC 20 C 1, 3, 6, 9 12 mnd. Frys/tin (blod metoder) Ekstraherte prøver (autosampler) Validering Valideringsplan hvordan Hvordan forsøket skal gjøres Hvilke prøver inkluderes Kriterier for godkjenning av resultat Holdbarhet av Std/QC-løsninger ved -20 C Rutinemessig lagres Std- og QC-rekker i matriksrør ved -20 C. Utførelse: Det benyttes tre paralleller av QC1 og QC3 som lagres ved -20 C og analyseres igjen en måned, tre og seks måneder. Det benyttes en ny-laget standardrekke i alle oppsett. Avviket for hvert QC-nivå rapporteres som prosentvis avvik fra Dag0 eller teoretisk verdi. Forsøket kan utføres med Std-rekken som er lagret ved -20 C der det lages nye QC-løsninger ved hvert tidspunkt. Anbefalte akseptkriterier: - Relativt avvik 15 % - CV 15 %. 19
Validering Valideringsrapport resultater med konkrete tall på hvor god metoden er metodens svakheter og begrensninger * Konklusjon: Godkjent / ikke godkjent for sitt planlagte bruksområde Implementering Risikovurdering Hva kan gå galt? Hvilke problemer kan vi støte på? Hvilke utfordringer kan dukke opp? FASE 1: FASE 2: FASE 3: Hendelse Risiko Konse Sann Resultat Risikoreduserende tiltak (Hvor, når, relatert til (Hva kan gå galt, kvens synlighet vekting av (Forebyggende og/ eller hvilken arbeidsoppg.?) problemet?) risiko skadebøtende) 20
Implementering Risikodiagram S A N N S Y N L I G H E T Svært sannsynlig 5* 10* 25 Sannsynlig 4 8* 12* 16 20* Mindre sannsynlig Lite sannsynlig 3 6 9 12* 16* 2 4 6 8* 10* Usannsynlig 1 2 3 4 5* Ubetydelig Mindre alvorlig Betydelig Alvorlig Svært alvorlig KONSEKVENS *Der verdier er sammenfallende har konsekvens større vekt enn sannsynlighet. Implementering Holdbarhetsforsøk Samkjøre flere instrumenter Prosesseringsmetode Kontrollregler Metodebeskrivelse Flytskjema Endringsmelding 21
Rutinedrift og evaluering Test dag Opplæring Oppfølging av eksterne og interne kvalitetskontroller Avviksbehandling Evaluering etter 3 mnd Periodisk gjennomgang av interne kvalitetskontroller Revisjoner En analysemetode fra A til Å Utvikling Evaluering Validering Rutinedrift Implementering 22
, validering og implementering av nye metoder Takk for oppmerksomheten Lykke til med utvikling, validering og implementering av kromatografiske metoder! 23