(12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 249721 B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. C07K 14/71 (2006.01) C12N /16 (2006.01) C12N 1/67 (2006.01) C12N 1/79 (2006.01) C12N 1/8 (2006.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert 2013.12.23 (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet 2013.09.18 (86) Europeisk søknadsnr 74073.0 (86) Europeisk innleveringsdag 20.07.20 (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato 2012.06.06 (30) Prioritet 2009.07.29, EP, 0916679 (84) Utpekte stater AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR Utpekte samarbeidende stater BA ME RS (73) Innehaver SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A., Viale Shakespeare 47, 00144 Roma, Italia (72) Oppfinner SASSANO, Marica, Via Bernardo Tanucci, 2, I-810 Caserta, Italia ESPOSITO, Adelaide, Via Volturno 4, I-80028 Grumo Nevano (NA), Italia RIVIECCIO, Vincenzo, Via degli Emigranti 7, I-8009 Torre del Greco (NA), Italia CASSANI, Giovanni, Corso Garibaldi 26, I-270 Pavia, Italia (74) Fullmektig Hjerrild & Levin A/S, Vedbæk Strandvej 341, DK-290 VEDBÆK, Danmark (4) Benevnelse Forbedret humant langt pentraxin ekspresjonssystem og anvendelser derav (6) Anførte publikasjoner EP-A- 1 832 29 BOTTAZZI B ET AL: "Multimer Formation and Ligand Recognition by the Long Pentraxin PTX3" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM, US, vol. 272, no. 2, 26 December 1997 (1997-12-26), pages 32817-32823, XP00219138 ISSN: 0021-928 DUROCHER Y PERRET S KAMEN A: "High level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 30, no. 2, 1 January 2002 (2002-01-01), pages E1-E9, XP00299160 ISSN: 030-48 RIVIECCIO ET AL: "High-level expression and efficient purification of recombinant human long pentraxin PTX3 in Chinese hamster ovary cells" PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA, vol. 1, no. 1, 30 November 2006 (2006-11-30), pages 49-8, XP00727964 ISSN: 46-928
1 Forbedret humant langt pentraxin ekspresjonssystem og anvendelser derav Beskrivelse Oppfinnelsens område [0001] Foreliggende oppfinnelse omhandler humant avledet cellulært system i stand til å uttrykke høye nivåer av det humane pentraxin 3 (hptx3) proteinet, fremgangsmåter og materiale anvendt. 1 20 BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN [0002] Humant langt pentraxin 3, PTX3 eller hptx3 (GeneBank aksesjonsnummer BD 131 701) er et multimerisk glykoprotein sammensatt av åtte underenheter forbundet med disulfidbroer. [0003] Forfatterne av foreliggende oppfinnelse har allerede designet et ekspresjonssystem for produksjonen av PTX3 i HEK293F human cellelinje. Dette systemet er basert på et plasmid som inneholder neomycin-resistens-genet, hvori PTX3 genet er under styringen av en human Ubikvitin C promotersekvens. Slikt system unngår den potensielle dannelsen av et kimært PTX3 avledet fra endogen produksjon av PTX3 ved en cellelinje av ikke-humant opphav. Den beste produsentisolerte klonen, kalt 2F12, ble valgt blant de oppnådde. En produksjon på omkring 20 mg/l av PTX3 ble oppnådd, som ikke var tilstrekkelig for kommersielle produksjonsbehov. 2 30 3 40 [0004] Med sikte på å øke PTX3 ekspresjonsnivåer, har forfatterne av den foreliggende oppfinnelsen konstruert et plasmid hvor PTX3 genet var under CMV promoterstyring. Plasmidet ble brukt for å re-transfektere den PTX3 uttrykkende klonen 2F12. Produktivitetsnivået detektert i de nye isolerte transfektomene var høyere enn forventet, rundt 80 mg/l. BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN [000] En klon av humant opphav som uttrykker høye nivåer av human PTX3 ble oppnådd ved anvendelse av en eksperimentell strategi, som inkluderer de følgende trinnene: a) konstruksjon av plasmidekspresjonskassetter som bærer det humane PTX3 under styringen av CMV promoter; b) insersjon av hygromycinresistenskassetten i nevnte plasmid, for å velge stabile transfektomer som stammer fra en re-transfeksjon av PTX3 uttrykkende klon G418 resistent; c) verifisering av identiteten og nivåene av uttrykte rekombinante proteiner; d) biokjemisk karakterisering av den rekombinante hptx3.
2 [0006] Innholdet i PCT/EP2009/00937 er herved inkorporert ved referanse. 1 20 2 30 3 40 [0007] Det er et formål ved oppfinnelsen å anvende en eukaryotisk ekspresjonsvektor som omfatter en nukleotidsekvens som koder for det humane lange pentraxin PTX3 proteinet under kontroll av en effektiv promoter og en nukleotidsekvens som koder for en valgbar markør, som har hovedsakelig sekvensen ifølge SEKV ID 1 for å transformere en rekombinant human vertscelle som allerede er i stand til å uttrykke det humane lange pentraxin PTX3- proteinet, hvori den rekombinante humane vertscellen er den rekombinante 293F/PTX3/2F12 klonen deponert ved ECACC med nr. 080101. I et bestemt aspekt er vektoren linearisert. [0008] Det er et annet formål ved oppfinnelsen en transformert human rekombinant celle som er i stand til å uttrykke det humane lange pentraxin PTX3 proteinet som er den rekombinante 293F/PTX3/2F12 klonen deponert ved ECACC under nummer 080101 ytterligere transformert ved anvendelse av vektoren som beskrevet ovenfor. I en foretrukket utførelsesform, er den transformerte rekombinante humane cellen den rekombinante MS24PTX klonen deponert ved Health Protection Agency, Culture Collections Centre for Emergency Preparedness and Response Salisbury Storbritannia, med nr. 09072902. [0009] Det er et annet aspekt ved oppfinnelsen anvendelsen av den transformerte rekombinante humane cellen som beskrevet over for fremstillingen av humant langt pentraxin PTX3 protein. [00] Det er et annet formål ved oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstillingen av det rekombinante humane lange pentraxin PTX3 proteinet som omfatter å: a) transfektere en rekombinant human celle som allerede uttrykker rekombinant humant langt pentraxin PTX3 protein, med et valgbart plasmid hvori det humane lange pentraxin-genet er under styringen av CMV-promoteren; b) velge og dyrke transfektert rekombinant human celle; c) rense det humane lange pentraxin PTX3 proteinet fra kulturmediet av den transfekterte rekombinante humane cellen hvori den rekombinante humane cellen som allerede uttrykker rekombinant humant langt pentraxin PTX3 protein er den rekombinante 293F/PTX3/2F12 klonen deponert ved ECACC under nummer 080101. Fortrinnsvis er den transfekterte rekombinante humane cellen den rekombinante MS24PTX klonen deponert ved Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury Storbritannia, med nr. 09072902. [0011] I en foretrukket utførelsesform inkluderer rensetrinnet minst ett av de følgende trinn: anionbytte-kromatografi, hydroksyapatitt-kromatografi eller størrelsesutelukkelseskromatografi.
3 [0012] Oppfinnelsen vil nå bli illustrert ved hjelp av ikke begrensende eksempler, ved å referere særlig til de følgende figurene: Figur 1: psassi-hptx3 kart og hovedtrekk Figur 2: Vekst, levedyktighet og produktivitet i Spinnerkolbe av (A) MS24PTX klon og (B) 293F/PTX3/2F12 klon. Figur 3: karakterisering ved SDS-PAGE gradient 4-1 % (A) og Størrelsesutelukkelseskromatografi (B) av rekombinant humant PTX3 renset fra MS24PTX klon. Figur 4: FGF2 bindingsevne for hptx3 klon 293F/PTX3/2F12 og hptx3 klon MS24PTX. Figur : psc1-hptx3 kart og hovedtrekk. 1 20 EKSEMPLER Eksempel 1: klon 293F/PTX3/2F12 Konstruksjon av plasmidet psc1-ptx3 1. Konstruksjon av psg/ub 1.1 Fremstilling av den humane ubikvitin C promotersekvensen [0013] Den humane ubikvitin C promoteren er tatt fra pub/bsd plasmid (Invitrogen, kat. n. V12-20), ved amplifisering med PCR. Som en del av kloningsstrategien blir gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser innført ved begge ender. Et BsaAI sete blir bygget i oppstrøms amplifiseringsprimeren og et EcoRI sete i nedstrømsprimeren. Den amplifiserte regionen tilsvarer nukleotider 1941-3161 i sekvensen av pub/bsd. 2 [0014] Oligonukleotidene er designet som følger: 'p UbC: lengde: 26mer (SEKV ID 3) ATATCACGTG ATC TGG CCT CCG CGC C 3'p UbC: lengde: 23mer (SEKV ID 4) GGAATTC GGT CCG GTC TAA CAA A 30 [001] Protokollen for amplifisering er den følgende: 1 ng/ l av plasmid DNA, 2 mm MgCl2, 0,2 mm dntper, 400 nm av hver primer, 1X levert buffer og 0,04 u/ml Taq DNA polymerase (Sigma Genosys); temperaturprofil: 3 min 94 C, 30 ganger (30 sek. 94 C, 30 sek. 46 C, 2 min 72 C), min 72 C, avkjøling ved 4 C inntil videre bruk. 3 [0016] Amplifiseringsproduktet (1238 bp) blir renset ved silika membranspinnkolonne (NucleoSpin, Machery-Nagel GmbH & Co), ligert i pgem-t-easy vektor (Promega Kat. n. A1360) og transformert til E.coli vertsstamme HB211 (Pharmacia Biotech). Transformanter velges ved vekst på LB medium supplementert med 0 mg/l ampicillin [0017] Plasmider DNA, isolert fra ampicillinresistente kolonier, blir sjekket ved restriksjonsanalyse med Stul pluss SacI enzymer (forventet ~ 360 og 600 bp fragmenter) 40
4 [0018] Plasmider som viser det korrekte restriksjonsmønsteret blir videre sjekket ved sekvensanalyse av hele insersjonen og senere digerert med EcoRI (Sigma-Genosys) og BsaAI (New England Biolabs) restriksjonsenzymer. [0019] Human Ubikvitin C promoter blir renset via agarose-gelseparasjon og eluering på silika membranspinnkolonne. 1.2 Fremstilling av vektorfragmentet psg [0020] Plasmid psg (4076 bp, Stratagene) ble kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI (Sigma-Genosys) og BsaAI (New England Biolabs), de resulterende fragmentene er 1432 og 2644 bp lange. 2644 bp-fragmentet, som inneholder ryggraden av psg, ble fremstilt og renset via agarose-gelelektroforese pluss silika membranspinnkolonne. 1 1.3 Fremstilling av psg/ub [0021] DNA-fragmenter fremstilt i trinn 1.1 og 1.2 ble ligert ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Promega) og transformert i HB211 E. coli celler. Transformanter ble valgt ved vekst på LB medium supplementert med 0 mg/l ampicillin. 20 [0022] Plasmid DNA, isolert fra ampicillinresistente kolonier, ble sjekket ved restriksjonsanalyse med EcoRI pluss SacII enzymer (forventet: 2670 og 1192 bp fragmenter). Et plasmid DNA, med det forventede restriksjonsmønsteret, ble designet som psg/ub. 2 30 2. Konstruksjon av psc1 2.1 Fremstilling av neomycinresistenskassetten (NeoR) [0023] Neomycinresistenskassetten (NeoR) ble tatt fra pcdna3 plasmid (446 bp, Invitrogen), og amplifisere den ved PCR. Som del av kloningsstrategien, ble gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonuklease AflIII introdusert ved begge ender. Den amplifiserte regionen tilsvarer nukleotidene 1788 til 322 i sekvensen av pcdna3 og inkluderer SV40-promoteren og replikasjons-opphavet, neomycinresistens ORF-en og SV40 polia signalet. [0024] Oligonukleotidene er designet som følger: 'NeoR (SEKV ID ) ATATACATG TCC CCA GGC AGG CAG AA 3'NeoR (SEKV ID 6) ATATACAT GTAT ACA GAC ATG ATA AG 3 40 [002] Protokoll for amplifisering var den følgende: 1 ng/ l av plasmid DNA, 2 mm MgCl2, 0,2 mm dntper, 400 nm av hver primer, 1X levert buffer og 0,04 u/ l av Taq DNA polymerase (Sigma Genosys); temperaturprofil: 3 min 94 C, 30 ganger (30 sek. 94 C, 30 sek. 46 C, 2 min 72 C), min 72 C, avkjøling ved 4 C inntil videre bruk.
[0026] Amplifiseringsproduktet (1484 bp) ble renset ved silika membranspinnkolonne, ligert i pgem-t Easy-vektoren (Promega Kat. n. A1360) og transformert til E.coli vertsstammen HB211. Transformanter velges ved vekst på LB medium, supplementert med 0 mg/l ampicillin Plasmider DNA isolert fra ampicillinresistente kolonier, blir sjekket ved restriksjonsanalyse med SmaI pluss SacI enzymer (forventet ~ 1200 og 3300 bp fragmenter). [0027] Plasmider som viser det korrekte restriksjonsmønster ble videre sjekket ved sekvensanalyse av hele insersjonen og påfølgende digerert med AflIII (New England Biolabs) restriksjonsenzymer. NeoR kassett (1471 bp) ble renset via agarose-gelseparasjon og eluering på silika membranspinnkolonne. 1 20 2 30 3 40 2.2 Fremstilling av vektorfragmentet psg/ub [0028] Plasmid psg/ub, fremstilt i trinn 1.3, ble linearisert ved AflIII digerering og renset på silika membranspinnkolonne. 2.3 Fremstilling av psc1 [0029] DNA-fragmenter fremstilt som i trinnene 2.1 og 2.2 ble ligert ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Promega) og transformert i JM9 E. coli-stamme (New England Biolabs). Transformanter ble valgt ved vekst på LB medium, supplementert med 0 mg/l ampicillin. [0030] Antibiotikaresistente kolonier ble innledende analysert ved PCR amplifisering med 'NeoR og 3'NeoR oligonukleotider, som tidligere beskrevet, og deretter ble rensede plasmider sjekket ved restriksjonsanalyse. For dette formålet ble SmaI (posisjon 602, innen NeoR sekvens) og SacII (posisjon 4142, innen UbC sekvens) enzymer anvendt. Et plasmid DNA, med det forventede restriksjonsmønsteret (340 og 1793 bp fragmenter), ble designet som psc1. 3. Konstruksjon av psc1-ptx3 3.1 Fremstilling av den hptx3 kodende sekvensen [0031] hptx3 (GeneBank aksesjonsnummer BD 131701) sekvensen ble tatt fra psg-ptx3 (WO 99/3216 "Pharmaceutical compositions containing the long pentraxin PTX3) ved BamHI (Roche Applied Science) digerering. Humant PTX3 fragment (1463 bp) ble renset ved agarose-gelelektroforese og silika membranspinnkolonne. 3.2 Fremstilling av vektorfragmentet psc1 [0032] psc1 vektoren ble linearisert ved BamHI digerering og renset på silika membranspinnkolonne. 3.3 Konstruksjon og verifisering på psc1-ptx3 [0033] DNA-fragmenter fremstilt i trinn 3.2 og 3.3 ble ligert ved anvendelse av T4 DNA ligase (Roche Applied Science) og transformert i JM9 E. coli stamme. Transformanter ble utvalgt
6 ved vekst på LB medium supplementert med 0 mg/l ampicillin og innledende screenet ved PCR med to oligonukleotider komplementære til PTX3 sekvens. [0034] Oligonukleotidsekvensene er: 'PTX (SEKV ID 7) GTGAGAACTCGGATGATTATGAT 3'PTX (SEKV ID 8) TGAAACATACTGAGCTCCTCCAT 1 20 2 [003] I et sluttvolum på l, var reagenser for amplifisering: 1 ml kokt koloni (1 koloni i 0 ml vann), 2 mm MgCl2, 0,2 mm dntper, 320 nm av hver primer, 0,06 % formamid, 1X levert buffer og 0,08 u/ l Taq DNA polymerase (Sigma Genosys); temperaturprofil: 3 min 96 C, 30 ganger (30 sek. 94 C, 30 sek. 8 C, 2 min 72 C), min 72 C, avkjøling ved 4 C inntil videre bruk. [0036] Plasmid renset fra kolonier positive til PCR-screening, ble digerert med Sall restriksjonsenzym (Roche Applied Science) for å sjekke orienteringen av hptx3 insersjon. Et plasmid med det forventede restriksjonsmønsteret (6619 og 177 bp) ble sekvensert i regionene som koder for UbC promoter, NeoR kassett og hptx3 og identifisert som psc1- PTX3. [0037] Det nye plasmidet (psc1-ptx3) ble deretter konstruert med PTX3 cdna-sekvensen plassert under ubikvitin promoterkontroll og neomycinresistens-genet under SV40 promoterkontroll, alle andre trekk og plasmidkart er representert i figur 1. [0038] Den fullstendige sekvensen av psc1-ptx3 er som følger (SEKV ID 2). psc1 hptx3- sekvensen er representert ved å starte fra det første EcoRI-setet (figur ). Sekvensen som avledes fra psg inneholdende PTX3 cdna er understreket. Det startende kodon (ATG) og termineringskodonet er med fet skrift. psc1-ptx3 (SEKV ID 2)
7 NO/EP249721
8 [0039] En human cellelinje (HEK293F) har blitt valgt for sin evne til å vokse i suspensjon, og i et serum- og proteinfritt medium (Florian M Wurm "Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells" Nature Biotechnology 22 (11): 1393-1398, 2004, Yan SC et al. "Characterization and novel purification of recombinant human protein C from three mammalian cell lines" Biotechnology (NY) 1990 Jul 8 (7): 6-61. "Use of cell lines for the production of influenza virus vaccines: an appraisal of technical, manufacturing, and regulatory considerations" Initiativ for vaksineforskning, Verdens helseorganisasjon, Genève, Sveits ( april 2007). For å transfektere HEK293F, ble psc1-ptx3 plasmid anvendt enten i en lineær (PvuI digerert) eller i en sirkulær form. Det beste transfeksjonsutbyttet ble oppnådd med linearisert plasmid; klonutvelgelse ble gjort på en produktivitetsbasis og vekstevne. Etter flere runder med subkloning ble 2F12 klonen valgt. 1 [0040] Den humane klonen 2F12, som uttrykker hptx3, har blitt deponert ved ECACC (European Collection of Cell Cultures, Health Protection Agency, Porton Down, Wiltshire SP4 0JG, Storbritannia). januar 2008, med hjemmel i Budapest-avtale betingelse under deponeringsnummer 080101. De eksperimentelle detaljene er beskrevet under. 20 2 3.4 Rekombinante 293F-celler generert fra psc1-ptx3 Transfeksjon og subkloning [0041] 6 celler/ml 293F (Invitrogen kat n R790-07) ble sådd i en 12 ml spinnerkolbe i et endelig Freestyle medium volum på 28 ml på dagen for transfeksjon. psc1/ptx3 plasmidet ble så tillatt å adsorbere til 293fectin reagensen (GIBCO/Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. 30 [0042] I korte trekk, i to separate rør ble 30 g psc1-ptx3 sirkulær eller PvuI linearisert fortynnet i 1 ml Optimem (GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og 40 l 293fectin (Invitrogen) fortynnet til 1 ml med Optimem. Begge løsninger ble inkubert i minutter ved romtemperatur så blandet (sluttvolum 2 ml) og inkubert i 30 minutter i de samme
9 betingelsene. DNA/lipid-cocktail ble tilsatt til cellene og inkubert ved 37 C, % CO2 med omrøring (120 rpm). Etter dyrking i 36 timer ble mediet skiftet til seleksjonsmedium (200 ml Freestyle medium + 00 g/ml G418) og de transfekterte cellene ble plettert ut i ti 96 brønnplater, 200 μl/brønn. Etter 1 dager ble høyeste produsenter celle-samlinger bestemt ved ELISA og amplifisert i 24 brønner, 6 brønner og T2 kolbe. [0043] Oppnådde rekombinante celle-samlinger ble subklonet med 1 celle per brønn i 96 brønn plater, i 0 % friskt medium og 0 % kondisjonert medium. 1 20 2 30 3 Eksempel 2: klon MS24PTX Konstruksjon av plasmidet psassi-hptx3 1. Konstruksjon av pceplettδ [0044] pcep4 plasmid (Invitrogen kat. n. V044-0), som det tidligere var klonet en antistoff lett kjede i, som taper en del av det multiple kloningssetet og BamHI restriksjonssetet, ble kuttet med restriksjonsenzymene EcoRV og Clal (Roche Applied Science); digereringen tillot å oppnå et plasmid uten Epstein-Barr-virus replikasjonsopphavet (orip) og det nukleære antigenet (kodet for ved EBNA-1-genet) som tillater ekstrakromosomal replikering. De resulterende fragmentene var 69 og 4281 bp lange. 69 bp-fragmentet, som inneholder ryggraden i pcep, ble renset via agarose-gelelektroforese pluss silika membranspinnkolonne. Siden Clal genererer klebrig ende, ble fragmentet fylt inn, ved anvendelse av T4 DNApolymerase (Roche Applied Science) med den følgende protokollen: ng ClaI/EcoRV- renset fragment (38 l), l x T4 DNA-polymerase-buffer, 4 ml dntp miks 2, mm, 3 l T4 DNA-polymerase (1U/μl). Etter 1 minutter ved 37 C ble reaksjonen stanset ved 70 C i minutter og deretter på is. Fragmentet ble renset på en silika membranspinnkolonne og ligert på seg selv over natten ved romtemperatur, ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Promega). TOP kompetente celler (Invitrogen) ble transformert med ligeringsblandingen og transformanter valgt ved vekst på LB plater supplementert med 0 mg/l ampicillin. [004] Plasmid DNA, isolert fra ampicillinresistente kolonier, ble designet som pceplettδ. 2. Fremstilling av vektorfragment som inneholder Hygromycinresistens og CMV promoter. [0046] Hygromycinresistenskassetten sammen med cytomegalovirus (CMV) umiddelbar tidlig enhancer/promoter ble tatt fra pceplettδ og amplifisere den ved PCR. Som en del av kloningsstrategien, ble gjenkjennelsessekvens for restriksjonsendonuklease BamHI introdusert i oligonukleotidet ved hybridisering til 3'-enden av CMV-promoteren. [0047] Den amplifiserte regionen omkring 00 bp, inkluderte CMV promoter, Hygromycingen under styringen av TK promoteren sammen med TK polya signal. 40 [0048] Oligonukleotidet er designet som følger: oligo CMV (SEKV ID 9) 'GAGAACTGTAACGTTGGATCCAGCTGG 3 '
oligo H (SEKV ID ) 'GTGTACAAAGGATCCAGACATGATAAG 3 ' 1 20 2 30 [0049] Protokoll for amplifisering var den følgende: 2 ng pceplettδ, 200 nm av hver primer, 0,2 mm dntper, 1X levert buffer, 1, l DMSO, 0, l Taq DNA polymerase (Phusion), sluttvolum 0 l, temperaturprofil: 1 min 98 C, 3 ganger ( sek. 98 C, 30 sek. C, 3 min. 72 C), min. 72 C, avkjøling ved 4 C inntil videre bruk. [000] Amplifiseringsproduktet (~ 00 bp) ble renset via agarose-gelelektroforese pluss silika membranspinnkolonne. Renset fragment ble ligert til seg selv og anvendt for å transformere TOP kompetente celler (Invitrogen). Plasmid DNA isolert fra ampicillinresistente kolonier ble sjekket ved restriksjonsanalyse og sekvensanalyse, og ble designet som pcepδbam. 3. Fremstilling av hptx3 genet [001] hptx3 (GeneBank aksesjonsnummer BD 131701) sekvensen ble tatt fra psc1-ptx3 som indikert ovenfor ved BamHI (Roche Applied Science) digerering. Humant PTX3 fragment (1463 bp) ble renset ved agarose-gelelektroforese og silika membranspinnkolonne. 4. Fremstilling av pcepδbam-hptx3 [002] pcepδbam vektoren ble linearisert ved BamHI digerering og renset på silika membranspinnkolonne. pcepδbam linearisert og DNA-fragment tilsvarende hptx3 genet fremstilt i trinn 3, ble ligert ved anvendelse av T4 DNA-ligase (Roche Applied Science) og anvendt for å transformere TOP E. coli-stamme. Transformanter ble valgt ved vekst på LB medium, supplementert med 0 mg/l ampicillin og innledende screenet restriksjonsanalyse for å evaluere PTX3 fragmentorientering.. Fremstilling av SV40 polyadenyleringssignal [003] SV40 polya signalet ble tatt fra pcepδlett plasmid og amplifisere det ved PCR. Som del av kloningsstrategien, ble gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonukleaser Hindlll og XhoI introdusert ved respektive fragmentender. 3 40 [004] Oligonukleotidene ble designet som følger: PCEPSVH (SEKV ID 11) 'AAGCTTAGACATGATAAGATACATTG 3 ' PCEPSVX (SEKV ID 12) 'CTCGAGAGTCGACCGGTCATGGCTGC 3 ' [00] Protokoll for amplifisering var den følgende: 1 ng pceplettδ, 200 nm av hver primer, 0,2 mm dntper, 1X levert buffer, 2 l MgCl2 0 mm, 0, l Taq DNA polymerase (Invitrogen), sluttvolum 0 l, temperaturprofil: 1 min 94 C, 30 ganger (30 sek. 94 C, 1 min. C, 1 min. 72 C), 1 min. 72 C, avkjøling ved 4 C inntil videre bruk.
11 [006] Amplifiseringsproduktet (~ 420 bp) ble renset via agarose-gelelektroforese pluss silika membranspinnkolonne. 6. Fremstilling av psassi-hptx3 [007] Renset fragment tilsvarende SV40 polya signal og pcepabam-hptx3 ble digerert med HindIII/XhoI restriksjonsenzymer og ligert ved anvendelse av T4 DNA ligase (Promega). Ligeringsblanding ble anvendt for å transformere TOP kompetente celler (Invitrogen) og transformanter ble valgt ved vekst på LB-plater som inneholder 0 mg/l ampicillin. [008] Plasmid DNA isolert fra ampicillinresistente kolonier ble sjekket ved restriksjons- og sekvensanalyse og plasmidet ble betegnet psassi-hptx3. 1 [009] Den komplette sekvensen av psassi-hptx3 er som følger (SEKV ID 1). psassi hptx3- sekvensen er representert ved å starte fra BamHI-setet (figur 1). Sekvensen av hptx3 er med små bokstaver. Det startende kodon (atg) og termineringskodonet (taa) er med fet skrift. psassi-hptx3 (SEKV ID 1)
12 NO/EP249721
13 NO/EP249721
14 Eksempel 3 Rekombinant MS24PTX klon generert ved psassi-hptx3 transfeksjon 1. Transfeksjon og subkloning [0060] 6 celler/ml 293F/PTX3/2F12 ble sådd i en 12 ml spinnerkolbe i et endelig Freestyle medium volum på 28 ml på dagen for transfeksjon. psassi-hptx3 plasmidet ble så tillatt å adsorbere til 293fectin reagensen (GIBCO/Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. 1 [0061] I korte trekk, ble 30 g psassi-hptx3 NruI linearisert fortynnet i 1 ml Optimem (GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og 40 l 293fectin (Invitrogen) fortynnet til 1 ml med Optimem. Begge løsninger ble inkubert i minutter ved romtemperatur så blandet (sluttvolum 2 ml) og inkubert i 30 minutter i de samme betingelsene. DNA/lipid-cocktail ble tilsatt til celler og inkubert ved 37 C, % CO 2 med omrøring (120 rpm). Etter dyrking i 36 timer ble mediet skiftet til seleksjonsmedium (200 ml Freestyle medium + 200 g/ml Hygromycin) og de transfekterte cellene ble plettert i ti 96 brønn plater, 200 μl/brønn. Etter 1 dager ble høyeste produsenter celle-samlinger bestemt ved ELISA og amplifisert i 24 brønner, 6 brønner og T2 kolbe.
1 [0062] Oppnådde rekombinante celle-samlinger ble subklonet med 1 celle per brønn i 96 brønn plater, i 0 % friskt medium og 0 % kondisjonert medium. 1 20 2 30 3 40 2. ELISA deteksjon av rekombinant hptx3 [0063] Renset PTX3 eller PTX3 utskilt i kultursupernatanten ble titrert ved anvendelse av en sandwich ELISA. For å detektere PTX3, ble 96-brønners Nunc Maxisorb mikrotiterplater (Nunc, Roskilde, Danmark) belagt over natten ved 4 C, med 700 ng/ml av det rotte monoklonale antistoffet MNB4 anti-humant PTX3 (Alexis Biochemicals, Lausen, Sveits ) i 1 mm natriumkarbonat, ph 9,6. Brønner ble vasket med PBS pluss 0,0 % Tween-20 (PBS-Tw, vaskeløsning) og blokkert med 300 l PBS-Tw som inneholder % tørrmelk, i 2 timer ved romtemperatur. [0064] Celle-supernatanter eller renset rekombinant human PTX3 ble tilsatt til brønnene, fortynnet i vaskeløsning pluss 1 % BSA. En standard kurve, dannet med renset rekombinant human PTX3 fra CHO-celler, som spenner fra 0 til 0 ng/ml, ble utført for kvantifisering. Etter 1 times inkubering ved 37 C, ble bundet PTX3 detektert ved anvendelse av biotinkonjugert polyklonalt kanin-anti-ptx3 antistoff, fulgt av inkubering med streptavidin konjugert til pepperrotperoksidase (Sigma-Aldrich, USA). Til slutt blir 2,2'-azino-bis-3- etylbenztiazolin-6-sulfonsyre (Sigma Chemical Co USA) tilsatt for fargeutvikling, og optisk tetthet ved 40 nm ble fastslått ved anvendelse av en mikroplateleser modell 30 EIA (Bio- Rad, Hercules, CA, USA). Eksempel 4 Sammenligning av vekst, levedyktighet og produktivitet av kloner 293F/PTX3/2F12 og MS24PTX [006] Celler som stammer fra de to klonene ble sådd ved en tetthet på 1.000.000 celler/ml (levedyktighet 90 %) i 00 ml FreeStyle 293 medium i 1 liters spinnerkolber. Veksten, levedyktigheten og produktiviteten ble overvåket i omkring 1 uke før cellene begynner å dø. [0066] Fig. 2 viser veksten, levedyktigheten og produktiviteten til MS24PTX (panel A) og 293F/PTX3/2F12 (panel B) klonene i samme såings- og vekstforhold. Som vist i figuren, med re-transfeksjonen av den PTX3 uttrykkende klonen 293F/PTX3/2F12 med et nytt plasmid hvor PTX3 er under kontroll av CMV-promoteren (MS24PTX klon) var vi i stand til å oppnå omkring 4 ganger økning i PTX3 produktivitet. Eksempel Rensing av rekombinant human PTX3 fra MS24PTX klon [0067] Kultur supernatant fra MS24PTX klon, dyrket i spinnerkolbe, ble fylt på en Q- SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare, UK) pakket kolonne. Tilbakeholdt materiale ble eluert ved anvendelse av en ikke-lineær gradient. Den PTX3-holdige fraksjonen ble påført direkte til en keramisk hydroksyapatitt (BioRad, Hercules, CA, USA) pakket kolonne. Det
16 tilbakeholdte materialet ble eluert ved å øke fosfatkonsentrasjon på en ikke-lineær måte. Den PTX3-holdige fraksjonen ble konsentrert og buffer skiftet på en ultrafiltreringsmembran (Pellicon-Biomax 0, Millipore) så karakterisert ved størrelsesutelukkelseskromatografi på BioSep SEC S4000 (Phenomenex) og SDS-PAGE (figur 3). 1 20 Eksempel 6 Binding av h-ptx3 til FGF2 [0068] Bindingen av renset rekombinant hptx3 til FGF2 ble fastslått i et ELISA-system. En 96- brønn plate (Falcon 3912) ble belagt med 2 g/ml FGF2 (Calbiochem) i PBS og inkubert over natten ved 4 C. Brønner ble vasket med PBS pluss 0,1 % Triton X-0 (PBS-Tr, vaskeløsning) og blokkert med 200 l PBS-Tr som inneholder 3 % BSA (PBS-B-blokkerings- og fortynningsmiddelløsning) i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking ble binding utført ved tilsetning av 0 l prøver, fortynnet i PBS-B ved PTX3 konsentrasjoner som spenner fra 0 til 120 ng/ml, og inkubering av platen ved 37 C i 1 time. Etter vask ble plater inkubert med 0 l/brønn av 0 ng/ml kanin-anti-ptx3 polyklonalt antistoff (1 hr ved 37 C), vasket igjen og inkubert med 0 l av pepperrotperoksidase-merket geite anti-kanin IgG (1 : 00 i PBS-B, 1 hr ved 37 C). Etter vasking ble 0 l kromogent substrat 3,3',,'-tetrametylbenzidin (TMB) (Sigma-Aldrich) tilsatt, og etter -1 min ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 0 l HCl 1 M, og absorbansen bestemt ved anvendelse av en mikroplateleser modell 30 EIA (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). (Figur 4). 2 30 3 SEKVENSLISTER [0069] <1> TECNOGEN SpA SASSANO, Marica ESPOSITO, Adelaide RIVIECCIO, Vincenzo CASSANI, Giovanni <120> FORBEDRET HUMANT LANGT PENTRAXIN 3 EKSPRESJONSSYSTEM- OG ANVENDELSE DERAV <130> PCT 9660 <> EP09 166 79.2 <11> 2009-07-29 <160> 12 <170> PatentIn versjon 3. <2> 1 <211> 7469 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220> <223> rekombinant plasmid psassi-hptx3 <400> 1
17 NO/EP249721
18 NO/EP249721
19 NO/EP249721
20 NO/EP249721
21 <2> 2 <211> 6796 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220> <223> rekombinant plasmid psc1-ptx3 <400> 2
22 NO/EP249721
23 NO/EP249721
24 1 20 <2> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Kunstig sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 3 atatcacgtg atctggcctc cgcgcc 26 <2> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Kunstig sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 4 ggaattcggt ccggtctaac aaa 23 <2> <211> 26 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220>
2 1 20 2 30 3 40 <223> syntetisk primer <400> atatacatgt ccccaggcag gcagaa 26 <2> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 6 atatacatgt atacagacat gataag 26 <2> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 7 gtgagaactc ggatgattat gat 23 <2> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 8 tgaaacatac tgagctcctc cat 23 <2> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 9 gagaactgta acgttggatc cagctgg 27 <2> <211> 27 <212> DNA <213> Kunstig sekvens <220> <223> syntetisk primer
26 1 <400> gtgtacaaag gatccagaca tgataag 27 <2> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Kunstig Sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 11 aagcttagac atgataagat acattg 26 <2> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Kunstig sekvens <220> <223> syntetisk primer <400> 12 ctcgagagtc gaccggtcat ggctgc 26 20
27 P a t e n t k r a v 1. Anvendelse av en eukaryotisk ekspresjonsvektor som omfatter en nukleotidsekvens som koder for det humane lange pentraxin PTX3 proteinet under styringen av en effektiv promoter og en nukleotidsekvens som koder for en valgbar markør, som har grunnleggende sekvensen ifølge SEKV ID 1 for å transformere en rekombinant human vertscelle som allerede er i stand til å uttrykke det humane lange pentraxin PTX3 proteinet, hvori nevnte rekombinante humane vertscelle er den rekombinante 293F/PTX3/2F12 klonen deponert ved ECACC med nr. 080101. 2. Anvendelse av vektoren ifølge krav 1, hvori vektoren er linearisert. 1 3. Transformert rekombinant human celle i stand til å uttrykke det humane lange pentraxin PTX3 proteinet som er den rekombinante 293F/PTX3/2F12 klonen deponert ved ECACC med nr. 080101 ytterligere transformert ved anvendelse av vektoren ifølge krav 1. 4. Transformert rekombinant human celle ifølge krav 3, som er den rekombinante MS24PTX klonen deponert ved Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury Storbritannia, med nr. 09072902. 20. Anvendelse av den transformerte rekombinante humane cellen ifølge krav 3 eller 4 for fremstillingen av humant langt pentraxin PTX3 protein. 2 30 3 6. Fremgangsmåte for fremstillingen av det humane lange pentraxin PTX3 proteinet som omfatter å: a) transfektere en rekombinant human celle som allerede uttrykker rekombinant humant langt pentraxin PTX3 protein, med et plasmid hvor det humane lange pentraxin-genet er under styringen av CMV-promoteren; b) velge og dyrke den transfekterte rekombinante humane cellen; c) rense det humane lange pentraxin PTX3 proteinet fra kulturmediet av den transfekterte rekombinante humane cellen hvori den rekombinante humane cellen som allerede uttrykker rekombinant humant langt pentraxin PTX3 protein er den rekombinante 293F/PTX3/2F12 klonen deponert på ECACC med nr. 080101. 7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, hvor den transfekterte rekombinante humane cellen er MS24PTX klonen deponert ved Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury Storbritannia, med nr. 09072902.
28 8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, hvori rensetrinnet omfatter minst ett av følgende trinn: anionbytte-kromatografi, hydroksyapatitt-kromatografi eller størrelsesutelukkelses-kromatografi.
29 Tegning
30 NO/EP249721
31 NO/EP249721
32 NO/EP249721
33 Trekk Nukleotidposisjon hptx3 ORF 0-124 Bgl II 147 SV40 polya signal 1489-1622 SV40 promoter og replikasjonsopphav 176-2090 Neo ORF 2126-2907 SV40 polya signal 309-322 puc replikasjonsopphav 3233-3899 Ampicillinresistens (bla) ORF 401-4908 Human ubikvitin C (UbC) promoter 78-6787