(12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP 2310034 B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. A61K 38/08 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) A61P 27/16 (2006.01) C07K 16/18 (2006.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert 2014.07.07 (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet 2014.03.26 (86) Europeisk søknadsnr 09761153.7 (86) Europeisk innleveringsdag 2009.06.12 (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato 2011.04.20 (30) Prioritet 2008.06.12, AT, 9512008 (84) Utpekte stater Utpekte samarbeidende stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR AL BA RS (73) Innehaver Affiris AG, Karl-Farkas-Gasse 22, 1030 Wien, Østerrike (72) Oppfinner MANDLER, Markus, Dieselgasse 5/115, A-1100 Vienna, Østerrike GIEFFERS, Christian, Blütenweg 12, 69221 Dossenheim, Tyskland MATTNER, Frank, Sieveringerstrasse 190, A-1190 Vienna, Østerrike DOLISCHKA, Andrea, Richtergasse 8/9, A-1070 Vienna, Østerrike OTAVA, Oleksandr, Kleistgasse 3/8, A-1030 Vienna, Østerrike (74) Fullmektig Protector Intellectual Property Consultants AS, Oscarsgate 20, 0352 OSLO, Norge (54) Benevnelse PEPTIDER FOR BEHANDLING AV BETA-AMYLOIDOSER (56) Anførte publikasjoner WO-A2-00/72880, WO-A2-2004/062556, WO-A2-2006/005707, WO-A2-2006/045037 ROHER ALEX E ET AL: "Amyloid beta peptides in human plasma and tissues and their significance for Alzheimer's disease" ALZHEIMER'S & DEMENTIA : THE JOURNAL OF THE ALZHEIMER'S ASSOCIATION, vol. 5, no. 1, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 18-29, XP002572893 MANDLER M ET AL: "The MimoVax vaccine: A novel Alzheimer treatment strategy targeting truncated Asz40/42 by active immunization" ALZHEIMER'S & DEMENTIA: THE JOURNAL OF THE ALZHEIMER'SASSOCIATION, vol. 5, no. 4, 1 July 2009 (2009-07-01), page P114, XP026253365 ELSEVIER, NEW YORK, NY, US ISSN: 1552-5260 [retrieved on 2009-07-01] SCHNEEBERGER A ET AL: "Development of Alzheimer AFFITOPE vaccines - from concept to clinical testing" ALZHEIMER'S & DEMENTIA: THE JOURNAL OF THE ALZHEIMER'SASSOCIATION, vol. 5, no. 4, 1 July 2009 (2009-07-01), page P257, XP026220250 ELSEVIER, NEW YORK, NY, US ISSN: 1552-5260 [retrieved on 2009-06-23] J-M M: "Vaccin anti-alzheimer" REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES, vol. 2008, no. 400, 1 January 2008 (2008-01-01), page 14, XP022667610 ELSEVIER, AMSTERDAM, NL ISSN: 1773-035X [retrieved on 2008-01-01] AFFIRIS AG: "Alzheimer Impfung" INTERNET CITATION 9 March 2010 (2010-03-09), XP002572894 Retrieved from the Internet: URL:http://www.affiris.com/html/de/impfsto ffe/morbus_alzheimer_interessierte_impfung.html> [retrieved on 2010-03-12]
PEPTIDER FOR BEHANDLING AV BETA-AMYLOIDOSER Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av mimotoper for å forhindre, behandle eller diagnostisere lidelser forbundet med ß-amyloid dannelse og/eller aggregering (ß-amyloidoser). Forskjellige degenerative lidelser er kjennetegnet ved abnorm polymerisasjon og akkumulering av spesifikke proteiner. Disse såkalte proteopatier inkluderer nevrologiske lidelser så som Alzheimers lidelse, Parkinsons lidelse og Huntingtons lidelse, så vel som forskjellige systemiske lidelser inkludert amyloidoser. Foreliggende oppfinnelse vedrører å forhindre, behandle og diagnostisere proteopatier forbundet med ß-amyloid proteiner oppsummert under begrepet ß-amyloidoser. Den mest fremtredende formen for ß- amyloidoser er Alzheimers lidelse (AD). Andre eksempler inkluderer men er ikke begrenset til demens med Lewy legemer og demens i Downs syndrom. AD er kjennetegnet ved abnormal oppsamling av ekstracellulær amyloid forkalkning nært forbundet med ekstensiv astrocytose og mikrogliose såvel som dystrofiske nevroner og nevronaltap. Disse amyloid forkalkningene består i det vesentligste av amyloid-ß (Aß) peptider Aß40 og Aß42 avledet fra amyloid precursor protein (APP), som er uttrykt i forskjellige celletyper i nervesystemet. Aß peptider er ansett å være direkte involvert i patogenese og progresjon av AD. APP blir normalt prosessert i to spaltetrinn og danner de hittil kjente formene av abeta x-40/42/43. Den første spaltingen blir utført av de såkalte beta-sted APPspalte enzymer 1 og 2 (BACE1 og BACE2); det andre proteolytiske trinnet blir utført av gamma-sekretase komplekset (beskrevet i De Strooper et al. J Cell Sci 113 (2000): 1857 1870). BACE enzymer gjenkjenner to steder i N-terminal partiet til det presumptive Aß peptidet: den første interaksjonen til BACE med APP fører til et kutt ved sekvensen DAEFR (pos. 1 i Aß) og dannelse av Abeta 1-X- Alternativt kan
BACE også kutte ved fremtidig posisjon 11 i Aß og resulterer i fragmentet 11-X. BACE mediert APP prosessering danner derved en rekke forskjellige Aß forbindelser med full lengde Abeta 1-40/42 som hoved bidragsyter. Gammasekretase aktivitet fører til produksjon av 3 hovedfragmenter: Aß 1-40/42/43. Med en gang disse peptidene er dannet blir de prosessert videre av aminopeptidaser som resulterer i deres etterfølgende trinnvise nedbrytning. Disse ytterligere trinnene fører til dannelse av andre former som for eksempel henholdsvis Aß3-40/42. Hos mennesker er i gjennomsnitt 60-85 % av amyloid forkalkningsmaterialet dannet av Aß40/42 derivater som er N-terminalt avkuttede og ofte modifiserte. De relative mengdene av N-terminal avkuttede Aß forbindelsene er variable med hensyn til Aß nivåer, mutasjoner og BACE aktivitet. De mest tallrike avkuttede formene for Aß er: Aß3-40/42 og Aß11-40/42. Begge peptidene inneholder en N-terminal glutamat rest, som ofte er modifisert enzymatisk til pyroglutamat, hvilket resulterer i dannelse av henholdsvis Aß3 (pe)-40/42 og Aß11 (pe) 40/42. Siden aminioenden av Abeta 3 (pe) og 11(pE) peptider er blokkert av internt laktam, er den beskyttet mot proteolytisk aksjon fra aminopeptidaser andre enn de som er pyroglutamat-spesifikke og kan derved forbli stabile i vevet. Den mest fremtredende forman av N-terminalt avkuttet modifisert amyloid er dannet av peptidet 3(pE)-40/42, som er antatt å utgjøre opp mot 50% av alle avkuttede former. Dette betyr at disse isoformene utgjør 25 40 % av alle amyloid peptider i AD hjerner. En annen fremtredende form for avkuttede Aß peptider er Aß11-40/42: Naslund et al. og Huse et al. kunne demonstrere at det er et betydelig nivå av disse avkuttede forbindelsene som er detekterbare i menneskelige hjerner til AD pasienter så vel som i infra-kliniske pasienter for AD. Videre gjennomgår disse peptidene intramolekylær dehydrering og danner stabile (pe) former med tilsvarende konsekvenser som beskrevet for 3 (pe)- 40/42. Det har tidligere blitt vist at avkuttede og modifiserte peptider er mer stabile i nevralt vev enn Aß med full lengde. I tillegg er N-terminalt avkuttede former av
Aß mer amyloidogene enn umodifiserte Aß peptider, og øker derved hastigheten for dannelse av forkalkning, og oppviser også nevrotoksisk aktivitet når de påføres på nevroner i kultur så vel som i in vivo forsøk. Avkuttede former av Aß kan allerede detekteres i diffuse aggregeringer av Aß i tidlige faser av AD og kan være involvert i tidlig dannelse av forkalkning, og virke som individuelle kim in vivo. Det er uomtvistelig bevist at opptredenen av N-terminalt avkuttede Aß forbindelser er korrelert med økende grad av alvorlighet og tidlig start av nevrodegenerering hos pasienter med sporadisk og familiær Alzheimers lidelse så vel som ved Downs syndrom. De aggregatoriske effektene i forbindelse med den økte stabiliteten til disse peptidene gjør dem til en potensielt farlig medspiller i AD utvikling. Analyser hos infrakliniske pasienter som lider av familiær AD eller Downs syndrom har enstemmig vist at Aß 3 (pe) 42 kan detekteres under de tidligste trinnene hos lidelsen, også kalt «så»-trinnet. På dette tidspunkt kan ingen eller kun mindre nevrologiske symptomer detekteres, selv om det begynner å akkumuleres forkalkning som inneholder Aß 3 (pe) 42 peptid forbindelser. Data fra slike pasienter antyder derved en forbindelse mellom tidlig dannelse av avkuttede Aß forbindelser og starten på lidelsen så velt som progresjonen. I lys av disse funnene synes det å være viktig å redusere mengden av disse peptidforbindelsene hos AD pasienter for å modifisere lidelsens progresjon og for å redusere toksisitet og medfølgende kognitivt forfall. En optimal AD-vaksine burde derfor fremkalle en immunrespons som er i stand til å målrette de mest fremtredende formene for Aß peptider som er tilstede i hjernen til AD pasienter. Immunoterapeutisk behandling ved bruk av aktive og passive immuniseringsstrategier for å målrette Aß med full lengde, fører riktignok til reduksjon av Aß forkalkninger og hadde fordelaktig innvirkning på progresjonen til lidelsen hos dyremodeller med AD. Forsøk med passiv vaksinering i musemodeller med Ad viste klart at antistoffer spesifikt rettet mot N- og C-ender av Aß 40/42 er i stand til å redusere belastningen av forkalkning i hjernen og
også forbedre kognitiv funksjon hos behandlede dyr vurdert utfra analyser av oppførsel. Tilsvarende observasjoner har blitt gjort i forsøk med aktiv vaksinering ved bruk av ulike tilnærmelsesmåter fro å indusere immunresponser rettet mot Aß 40/42 hos mus. Alle disse tilnærmelsesmåtene brukte Aß 40/42 med full lengde eller fragmenter inneholdende den naturlige sekvensen av Aß og mest reduserte amyloid belastningen hos transgene musemodeller. Det er viktig å legge merke til at disse dyrene også oppviste forbedrede kognitive funksjoner. Det er slående at Lemere et al. (Am J Pathol 165 (2004) : 283-297) kunne reprodusere disse resultatene hos ikke-humane primater som oppviste en klar reduksjon av avsetting av forkalkninger og tilhørende patologi i respons til aktiv vaksinering med full lengde Aß. Den første fasen IIa klinisk vaksineringsforsøk av AD pasienter ved bruk av full lengde Aß 42 som antigen måtte avbrytes på grunn av alvorlige nevroinflammatoriske bivirkninger innbefattende hjerneinfiltrering med autoreaktive T-celler. Uansett har studier som undersøker de kliniske effektene hos pasienter med AN-1792 avslørt at pasienter som utviklet en antistoff respons mot Aß 42 med som ikke led av meningoencefalitt gjorde det bedre i kognitive tester enn ikkeresponderende pasienter, hvilket indikerer at immunoterapi kan være en meget anvendelig behandlingstilnærmelse ved AD. Enda viktigere er det at nylige resultater erholdt fra autopsitilfeller med analyse av pasienter som gjennomgikk AN1792 vaksinering oppviste en reduksjon av full lengde Aß forbindelser fra hjernen men vedvarende N-terminalt avkuttede former av Aß. Dette understreker nødvendigheten av å finne opp nye vaksiner som er målrettet mot full lengde Aß så vel som N-terminalt avkuttede og modifiserte former av dette molekylet. Indusering av immun respons mot Aß40/42 peptider hos mennesker kan påvirke den kognitive nedbrytningen hos AD pasienter, men en sikker Alzheimer vaksine må kunne unngå dannelsen av autoreaktive T-celler. Vaksinering ved bruk av naturlig Aß40/42 peptider eller fragmenter derav lider av den iboende risikoen for å indusere autoimmun lidelse hos pasienter, siden immunresponsen ikke utelukkende kan være målrettet mot Aß.
En hensikt med foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe forbindelser og medikamenter som kan brukes for å behandle og/eller forhindre ß- amyloidoser inkludert Alzheimers lidelse. Disse forbindelsene bør oppvise ingen eller en signifikant redusert fare for å indusere autoimmune lidelser når de administreres til et individ. I henhold til en annen hensikt med foreliggende oppfinnelse kan denne forbindelsen være i stand til å indusere in vivo dannelsen av antistoffer hos et individ som er rettet mot avkuttede og/eller stabiliserte former av Aß, som vanligvis er hovedkomponentene til amyloidavsetninger. Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor bruk av minst en forbindelse innbefattende aminosyresekvensen X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)o FORMEL (1) hvor X1 er isoleucin (I) eller valin (V), X2 er tryptofan (W) eller tyrosin (Y), X3 er treonin (T), valin (V), alanin (A), metionin (M), glutamin (Q) eller glysin (G), X4 er prolin (P), alanin (A), tyrosin (Y), serin (S), cystein (C) eller glycin (G), X5 er prolin (P), leucin (L), glycin (G) eller cystein (C), X6 er cystein (C), n, m og o er uavhengig 1 eller 1, hvilken forbindelse har en bindingskapasitet til et antistoff som er spesifikt for en epitope til amyloid-bet-peptid (Aß) innbefattende aminosyresekvensen EFRHDSGY og/eller pefrhdsgy, for fremstilling av et medikament for å forhindre og/eller behandle ß- amyloidoser. Det har overraskende vist seg at en forbindelse innbefattende en aminosyresekvens med formel I er i stand til å indusere in vivo dannelse av
antistoffer som er retter mot de avkuttede Aß formene AßE3-40/42 og Aß3-40/42. Antistoffene som dannes er i stand til å binde seg til nevnte Aß fragmenter og resultere i en oppløsning av Aß forkalkninger. Formel I og II og alle andre peptidiske molekyler beskrevet her etterligner de naturlig forekommende Aß peptidene og varianter Aß1-40/42, AßpE3-40/42, Aß3-40/42 og Aß11-40/42, slik at forbindelsene innbefattende aminosyresekvensene beskrevet er i stand til å indusere dannelse av respektive antistoffer. Oppfinnelsen presentert her refererer til antigener som ikke inneholder sekvenser av det naturlige Aß peptidet og etterligner strukturen til neo-epitoper som ikke er detekterbare for mimotoper så som beskrevet i WO2004/062556. En slik mimotope-basert AD vaksine vill derfor indusere antistoff responser som kun reagerer med de patologiske Aß molekylene beskrevet er men ikke med parentale strukturer som APP. Videre inneholder ikke mimotoper potensielle T- celle selv-epitoper og unngår induksjon av ødeleggende autoreaktive T-celler. «ß-Amyloidoser», som brukt her, referer til forskjellige degenerative lidelser som er kjennetegnet ved den abnorme polymeriseringen og akkumuleringen av spesifikke proteiner, såkalte proteopatier. Foreliggende oppfinnelsen vedrører forhindrelse, behandling og diagnostisering av proteopatier forbundet med ß- amyloid proteiner oppsummert under begrepet ß-amyloidoser. Den mest fremtredende formen av ß-amyloidoser er Alzheimers lidelse (AD). Andre eksempler inkluderer men er ikke begrenset til demens med Lewy-legemer og demens med Down syndrom. Ytterligere eksempler er Lewy legeme demens, myositt, sporadisk inklusjonslegeme myositt, arvelig cerebral blødning med amyloidose (nederlandsk type), cerebral amyloid angiopati, Aß relatert angiitis. I henhold til en spesielt foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er «ß-amyloidoser» Alzheimers lidelse. I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse innbefatter forbindelsen et peptid med en aminosyresekvens valgt fra gruppen
bestående av IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C), IRYDMAG (C), IRWDTSL (C), IRWDQP (C), IRWDG (C), og IRWDGG (C). Spesielt foretrukne forbindelse i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter eller består av de ovenfor angitte aminosyresekvensene, hvorved C-enden av peptiden kan innbefatte en cysteinrest eller ikke (antydet ved bruk av parenteser) slik at den erholdte forbindelsen kan kobles f.eks. til et bærermolekyl. Det er imidlertid selvfølgelig mulig å binde N-enden av peptidet til en cysteinrest. I henhold til en spesielt foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er aminosyresekvensen IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C) eller IRYDMAG (C). I et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører den anvendelse av minst en forbindelse innbefattende aminosyresekvensen EX1WHX2X3(X4)n(X5)m (FORMEL II) hvor X1 er valin (V), arginin (R) eller leucin (L), X2 er arginin (R) eller glutaminsyre (E), X3 er alanin (A), histidin (H), lysin (K), leucin (L), tyrosin (Y) eller glysin (G), X4 er prolin (P), histidin (H), fenylalanin (F), glutamin (Q) eller cystein (C), X5 er cystein (C), n og m er uavhengig 0 eller 1, hvilken forbindelse har en bindingskapasitet til et antistoff som er spesifikt for an epitope av amyloid-beta-peptid (Aß) innbefattende aminosyresekvensen EVHHQKL, for fremstilling av et medikament for å forhindre og/eller behandle ß-amyloidose.
Administreringen av en forbindelse med en aminosyresekvens med formel II provoserer en immunrespons mot den avkuttede Aß form Aß11-40/42. I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse innbefatter forbindelsen et peptid med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av EVWHRHQ (C), ERWHEKH (C), EVWHELQ (C), ELWHRYP (C) og ELWHRAF (C). Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av minst en forbindelse innbefattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av QDFRHY (C), SEFKHG (C), (C) SEFKH, SEFKH (C), (C) HEFRH og HEFRH (C) for fremstilling av et medikament for å forhindre og/eller behandle ß-amyloidose. Hver av disse forbindelsene er i stand til å indusere in vivo dannelsen av antostoffer rettet mot Aß1-40/42, AßpE3-40/42 og Aß3-40/42. Disse forbindelsene er derfor godt egnet for å behandle elelr forhindre ß-amyloidoser, så som AD, siden administreringen av en forbindelse resulterer i dannelse av antistoffer som er i stand til å gjenkjenne de tre hoved Aß formene Aß1-40/42, AßpE3-40/42 og Aß3-40/42.
I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse innbefatter eller består forbindelsen av et peptid med en aminosyresekvens valgt fra guppen bestående av QDFRHY (C), Aminosyresekvensene beskrevet her er ansett å være mimotoper av epitopene til Aß innbefattende aminosyresekvensen EFRHDGSY, pefrhdsgy eller EVHHQKL. I henhold til foreliggende oppfinnelse refererer begrepet «mimotoper» til et molekyl som har en konformasjon som har en topologiekvivalent til epitopen som den etterligner. Mimotopen binder seg til det samme antigen-bindende området av et antistoff som binder immunospesifikt til et ønsket antigen. Mimotopen vil fremkalle en immunologisk respons i en vert som er reaktiv til antigenet til hvilken den er en etterligner. Mimotopen kan også virke som en konkurrent for epitopen til hvilken den er en etterligner i en in vitro inhiberingsassay. (f.eks. ELISA inhiberingsassay) som involverer epitopen og et antistoff som binder seg til epitopen. En mimotope i henhold til foreliggende oppfinnelse må imidlertid ikke nødvendigvis forhindre eller konkurrere med bindingen til epitopen til hvilken den er en etterligner i en in vitro inhiberingsassay selv om den er i stand til indusere en spesifikk immunrespons når den administreres til et pattedyr. Som brukt her refererer begrepet «epitope» til et immunogent område av et antigen som blir gjenkjent av et spesielt antistoff molekyl. Generelt vil et antigen inneha en eller flere epitoper som hver er i stand til å binde et antistoff som gjenkjenner den spesielle epitopen. Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være fremstilt syntetisk ved kjemiske syntetiseringsmetoder som er vel kjent innen området, enten som et isolert peptid eller som en del av et annet peptid eller polypeptid. Alternativt
kan peptid mimotopen være fremstilt i en mikroorganisme4 som produserer peptid mimotopen, som deretter isoleres og om ønskelig renses ytterligere. Peptid mimotopen kan være fremstilt i mikroorganismer så som bakterier, gjær eller sopp, i eukaryote celler så som en pattedyr eller insekt celle, eller i en rekombinant virus vektor så som adenovirus, poxvirus, herpesvirus, Simliki forest virus, baculovirus, bakteriofager, sindbis virus eller sendai virus. Egnede bakterier for produksjon av peptid mimotoper inkluderer E. coli, B. subtilis eller enhver annen bakterie som er i stand til å uttrykke peptider så som peptid mimotopen. Egnede gjærtyper for uttrykkelse av peptidmimotopen inkluderer Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris eller enhver annen gjær som er i stand til å uttrykket peptider. Korresponderende metoder er vel kjent innen området. Også metoder for å isolere og rense rekombinant produserte peptider er vel kjent innen området og inkluderer f.eks. gelfiltrering, affinitetskromatografi, ionebytter kromatografi etc. For å forenkle isoleringen av peptid mimotopen, kan det fremstilles et fusjonspolypeptid hvor peptid mimotopen blir translasjonelt sammensmeltet (kovalent bundet) til et heterologt polypeptid som muliggjør isolering ved affinitetskromatografi. Typiske heterologe polypeptider er His-Tag (f.eks. His6; 6 histidin rester), GST-Tag (glutation-s-transferase) etc. Fusjonspolypeptidet forenkler ikke bare rensingen av mimotopene men kan også forhindre av mimotope polypeptidet fra å bli nedbrutt under rensingen. Dersom det er ønskelig å fjerne det heterologe polypeptidet etter rensing kan fusjonspolypeptidet innbefatte et spaltested ved forbindelsen mellom peptid mimotopen og det heterologe polypeptidet. Spaltningsstedet består av en aminosyresekvens som blir spaltet med et enzym som er spesifikt for aminosyersekvensen ved stedet (f.eks. proteaser). Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også være modifisert ved eller nær deres N- og/eller C-ender slik at ved nevnte posisjoner blir en cysteinrest bundet til dette. I en foretrukket utførelsesform blir terminalt posisjonerte (lokalisert ved N- og C-endene til peptidet) cysteinrester brukt til å
syklisere peptidene via en disulfid binding. Cysteinresten kan også virke til å binde til nevnte peptid/forbindelse et ytterligere molekyl (f.eks. en bærer). Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også brukes i forskjellige assayer og sett, spesielt i immunologiske assayer og sett. Det er derfor spesielt foretrukket at mimotopen kan være en del av et annet peptid eller polypeptid, spesielt et enzym som brukes som en rapportør i immunologiske assayer. Slike rapportørenzymer innbefatter f.eks. alkalisk fosfatase eller pepperrot peroksidase. Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis antigene polypeptider som i sin aminosyresekvens varierer fra aminosyresekvensen til Aß eller fragmenter av Aß. I denne forbindelse kan mimotopene i henhold til oppfinnelsen ikke bare innbefatte aminosyresubstitusjoner med en eller flere naturlige forekommende aminosyrerester men også av en eller flere ikkenaturlige aminosyrer (det vil si fra de 20 «klassiske» aminosyrene) eller de kan være fullstendig sammensatt av slike ikke-naturligs aminosyrer. Videre kan antigenene i henhold til oppfinnelsen som induserer antistoffer rettet og bundet til Aß1-40/42, AßpE3-40/42, Aß3-40/42 og Aß11-40/42 være sammensatt av D- eller L-aminosyrer eller av kombinasjoner av DL-aminosyrer og det kan eventuelt ha blitt endret ved ytterligere modifikasjoner, ringlukninger eller derivatiseringer. Egnede antistoff-induserende antigener kan være tilveiebragt fra kommersielt tilgjengelige peptidbiblioteker. Fortrinnsvis er disse peptidene minst 7 aminosyrer, og fortrukne lengder kan være opp til 16, fortrinnsvis opp til 14 eller 20 aminosyrer (f.eks. 5 til 16 aminosyrer rester). I henhold til oppfinnelsen kan det også godt brukes lenda lengre peptider som antistoffinduserende antigener. Vider kan mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse også være en del av et polypeptid og derved innbefatte ved deres N- og/eller C-ender minst en ytterligere aminosyrerest. For fremstilling av mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse (det vil si de antistoff-induserende antigenene beskrevet her, er det selvfølgelig egnet med fagbiblioteker, peptidbiblioteker, f.eks. fremstilt ved bruk av kombinatorisk
kjemi eller erholdt ved hjelp av screeningteknikker med høyt gjennomløp for de mest varierende strukturene (Display: A Laboratory Manual av Carlos F. Barbas (red.), et al.: Willats WG Phage display: practicalities and prospects, Plant. Mol. Biol. 2002 Dec.; 50 (6) : 837 54). Videre i henhold til oppfinnelsen kan det anvendes anti-aß1-40/42-, -AßpE3-40/42, -Aß3-40/42- og Aß11-40/42-antistoff-induserende antigener basert på nukleinsyrer («aptamerer») og disse kan også finnes med de mest varierende (oligonukleotid) bibliotekene (f.eks. med 2-180 nukleinsyre rester) (f.eks. Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690 700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591 599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961 4965, etc.). I antistoff-induserende antigener basert på nukleinsyrer, kan ryggraden til nukleinsyren f.eks. være tilveiebragt av naturlige fosfor-diester forbindelser, eller også ved fosfortioater eller kombinasjoner eller kjemiske variasjoner (f.eks. som PNA), hvor det som baser det primært kan brukes i henhold til oppfinnelsen U, T, A, C, G, H og mc. 2 -restene til nukleotidene som kan brukes i henhold til oppfinnelsen er fortrinnsvis H, OH, F, Cl, NH2, O-metyl, O-etyl, O-propyl eller O-butyl, hvor nukleinsyren også kan være modifisert annerledes, det vil si f.eks. med beskyttende grupper, siden de vanligvis blir anvendt i oligonukleotid syntese. Aptamer-baserte antistoffinduserende antigener er også foretrukne antistoff-induserende antigener innen omfanget til foreliggende oppfinnelse. I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er forbindelsen koblet til en farmasøytisk akseptabel bærer, fortrinnsvis KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), tetanus toksoid, albumin-bindende protein, bovin serum albumin, en dendrimer (MAP: Biol. Che. 358: 581), peptidbindere (eller flankeområder) så vel som de adjuvanssubstansene som er beskrevet i Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (spesielt de i tabell 1 i nevnte dokument), og O Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (spesielt de endogene immuno-potensierende forbindelsene og tilførselssystemene beskrevet der) eller blandinger derav. Konjugasjonskjemien (f.eks. via hetero-bifunksjonelle forbindelser så som GMBS og selvfølgelige også andre som er beskrevet i «Bioconjugate Techniques», Greg T.
Hermanson) kan i denne kontekst være valgt fra reaksjoner som er kjent for en fagmann innen området. Videre kan det formuleres vaksineblandinger med en adjuvans, fortrinnsvis en lavt løselig aluminiumblanding, spesielt aluminium hydroksid. Selvfølgelig kan også adjuvanser som MF59 aluminium fosfat, kalsium fosfat, cytokiner (f.eks. IL-2, IL-12, GM-CSF), saponiner (f.eks. QS21), MDP derivater, CpG oligoer, LPS, MPL, polyfosfasener, emulsjoner (f.eks. Dreund s SAF), liposomer, virosomer, iscomer, kokleater, PLG mikropartikler, poloksamer partikler, virus-lignende partikler, varmelabile enterotoksiner (LT), kolera toksin (CT), mutaqnt toksiner (f.eks. LTK63 og LTR72), mikropartikler og/eller polymeriserte liposomer brukes. Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis bundet til bæreren eller adjuvansen via en linker, som er valgt fra gruppen bestående av NHS-poly (etylen oksid) (PEO) (f.eks. NHS-PEO4-maleimid). En vaksine som innbefatter foreliggende forbindelse (mimotope) og den farmasøytisk akseptable bæreren kan administreres ved enhver passende applikasjonsmåte f.eks. i.d., i.v., i.p., i.m,. intranasalt, oralt, subkutant, etc. og i enhver passende tilførselsanordning (O Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis formulert for intravenøs, subkutant, intradermal eller intramuskulær administrering (se f.eks. «Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations», Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004). Medikamentet (vaksine) i henhold til foreliggende oppfinnelse inneholder forbindelsen i henhold til oppfinnelsen i en mengde på fra 0,1 ng til 10 mg, fortrinnsvis 10 ng til 1 mg, spesielt 100 ng til 100 µg, alternativt, f.eks. 100 fmol til 10 µmol, fortrinnsvis 10 pmol til 1 µmol, spesielt 100 pmol til 100 nmol. Typisk kan vaksinen også inneholde ytterligere substanser, f.eks. buffere, stabilisatorer etc. Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en forbindelse som definert over for behandling og/eller forbedring av symptomer på synukleopati.
Det har overraskende vist seg at forbindelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse også kan brukes for å behandle og forbedre symptomer forbundet med synukleopatier. Amyloidoser og synukleopatier er forbundet med den cerebrale akkumuleringen patologiske trekk av begge lidelsene, og øker muligheten for overlappende patogene veier. Disse pasientene er også klassifisert til å lide av et nylig oppdaget syndrom beskrevet som demens med Lewy-legemer eller Parkinsons lidelse med demens (DLB/PDD). I en nyere transgen dyremodell for DLB/PDD har det blitt vist at overekspresjon av begge, synuklein og amyloid prekursor protein (happ) hos mus, fører til utvikling av kognitive og motoriske endringer medfulgt av tap av kolinergiske nevroner og reduksjon av synaptiske vesikler, dannelse av ekstensiv amyloid forkalkning og hasyn-immunoreaktive intranevronale fibrillare inklusjoner. Alle disse trekkene er også funnet i DLB/PDD syndromet. Det har nylig blitt beskrevet at begge molekylene er potensielt i stand til å interagere og danne hydbride oligomerer in vitro. Det har også blitt vist at overekspresjon av APP kan forverre noen av de patologiske forbedre sekresjon og toksisitet til amyloid beta peptider og kunne derfor også øke effektene av ß-amyloid og understøtte forestillingen av overlappende patogene baner i nevrodegenerative prosesser. I begge proteopatier har det blitt identifisert progressiv akkumulering av peptid oligomerer som en av de sentrale toksiske hendelser som fører til de forskjellige endringene som er typisk for enten synukleopatier eller amyloidoser. På tross og Aß har distinkte så vel som konvergente patogene effekter på integriteten og funksjonen til hjernen. Synukleiner er antatt å påvirke den motoriske funksjonen mer alvorlig enn kognitiv funksjon, mens amyloid ß peptider er beskrevet å ha motsatt effekt. Årsaken til denne uoverensstemmelsen er hittil ukjent med det utelukker en klar beskrivelse av avhengigheter og effekter til begge molekylene.
Behandlingstilnærmelsen presentert i foreliggende oppfinnelse beskriver en immunoterapi som målretter Aß og som vil føre til fjerning av hovedsakelig ekstracellulært amyloid. Det er derved antatt å frigjøre amyloid forbundede endringer i området fra forkalkningsavsetninger til nevronal død så vel som minneproblemer og kognitiv tilbakegang. Den subcellulære lokaliseringen av synukleiner indikerer imidlertid at disse intracellulære proteinene i hovedsak er aktive ved synapsen, spesielt begrenset til synaptiske vesikler. Det er interessant at også synuklein akkumuleringer, som er det samlende patologiske tegnet på synukleopatier, i hovedsak er detekterbare intracellulært. I tillegg er den patogene mekanismen som ligger under synukleopatier antatt å kunne tilskrives intranevronale endringer i området fra mitokondrisk dysfunksjon, akkumulering av anormalt foldede, allestedsnærværende eller fosforylerte proteiner, så vels om akkumulering av alfa synuklein. Disse endringene vil derved resultere i endringer av synaptiske funksjoner, synaptiske feil, og tap av dopaminergiske nevroner og klassiske kliniske tegn på synukleopatier. I kontrast er Aß hovedsakelig detekterbart ekstranevronalt og amyloid forkalkninger så vel som fibriller, protofibriller og oligomerer av beta amyloid kan oppvise nevrotoksiske funksjoner ved applisering ekstracellulært eller intracerebralt. Det er derved et overraskende funn for eksperten at en tilnærmelse som i hovedsak er målrettet mot ekstracellulært amyloid ville redusere symptomene på synukleopatier som PD, som i hovedsak påvirker intracellulære prosesser som fører til de typiske symptomene beskrevet under. Det er enda mer overraskende at det nå er antatt at de overlappende effektene av begge molekylene er forårsaket av direkte interaksjoner av de to proteinene som i hovedsak opptrer intracellulært. I henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer begrepet «synukleinopati» alle nevreodegenerative lidelser som er kjennetegnet av patologiske synuklein aggregeringer. Flere nevrodegenerative lidelser inkludert Parkinsons lidelse (PD), Lewy-legeme lidelse (LBD), diffus Lewy-legeme lidelse (DLBD), demens med Lewy-legemer (DLB), parkinsonisme med demens (PDD), multippel system atrofi (MSA) og nevrodegenerering med hjerne jernakkumulering type I (NBIA Type I) er kollektivt gruppert som synukleinopatier.
«Symptomer på synukleopati» som er brukt her, referer til de symptomene på synukleopatier, spesielt Parkinsons lidelse, som påvirker den motoriske og ikkemotoriske oppførselen til en pasient som lider av nevnte lidelse. «Motoriske symptomer» inkluderer hvilende skjelving, Bradykinese, stivhet, postural instabilitet, lutende holdning, dystoni, utmattelse, påvirket finmotorisk fingerferdighet, og motorisk koordinasjon, påvirket total motorisk koordinasjon, bevegelseshemninger (redusert armsving), akatisi, taleproblemer, så som svak stemme eller utydelig tale forårsaket av manglende muskelkontroll, tap av ansiktsuttrykk, eller «maskering», mikrografi, vanskelig svelging, seksuell dysfunksjon, sikling etc. «Ikke-motoriske» symptomer innbefatter smerte, demens eller forvirring, søvnforstyrrelser, forstoppelse, hudproblemer, depresjon, frykt eller angst, minnevanskeligheter og langsommere tenking, urinveisproblemer, utmattelse og verking, tap av energi, tvangshandlinger, kramper etc.. I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er synukleopatien valgt fra gruppen av Parkinsons lidelse, demens med Lewylegemer, multippel system atrofi og nevrodegenerering med hjerne jernakkumulering. Spesielt foretrukket er Parkinsons lidelse. Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et peptid med eller innbefattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C),
(C) SEFKH, SEFKH (C), (C) HEFRH og HEFRH (C). Som antydet ved bruk av parenteser, kan peptidene i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatte cysteinresten ved C- eller N-enden eller ikke. Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor også de følgende aminosyresekvensene: IRWDTP, VRWDVYP, IRYDAPL, I henhold til en foretrukket utførelsesform er peptidet koblet til en farmasøytisk akseptabel bærer, fortriinnsvis KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin). I nok et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk formulering, fortrinnsvis en vaksine, innbefattende minst et peptid i henhold til foreliggende
oppfinnelse. Den farmasøytiske formuleringen kan anvendes for å behanlde idivider som lider av ß-amyloidoser inkludert Alzheimers lidelse eller forhindre dannelsen av Aß-forkalkninger i et individ for å hindre eller forsinke dannelsen av ß-amyloidoser inkludert Alzheimers lidelse. Foreliggende oppfinnelse blir videre illustrert med de følgende figurer og eksempler, imidlertid uten å være begrenset til disse. Fig. 1 viser binding av et monoklonalt antistoff MV-001 til spesifikke peptider og rekombinante proteiner; Fig. 2 viser binding av monoklonalt antistoff MV-003 til spesifikke peptider og rekombinante proteiner, Fig. 3 viser binding av monoklonalt antistoff MV-004 til spesifikke peptider og rekombinante proteiner, Fig. 4 viser typiske bindingsassayer med mimotoper for ß-amyloid og N- terminalt avkuttede og/eller posttranslasjonelt modifiserte ß-amyloid fragmenter; Fig. 5 viser typiske inhiberingsassayer med mimotoper for ß-amyloid og N- terminalt avkuttede og/eller posttranslasjonelt modifiserte ß-amyloid fragmenter; Fig. 6 viser eksempler på in vivo karakterisering av immunresponsen fremkalt av mimotope vaksinering (injisert peptid/irrelevant peptid); Fig. 7 viser eksempler på in vivo karakterisering av immunresponsen fremkalt av mimotope vaksinering mot amyloid beta fragmenter; Fig. 8 viser eksempler på in vivo karakterisering av immunresponsen fremkalt av mimotope vaksinering mot full lengde Aß40/42; Fig. 9 viser områder okkupert av amyloid forkalkning. Tg2576 ble injisert 6 ganger med mimotope vaksiner tilsatt aluminium hydroksid (ALUM) ved s.c. inokulering ved mpnedlige intervaller. Kontrollmus fikk kun PBS-ALUM. ;
Området okkupert av amyloid forkalkning er vist i prosent av kontrollgruppen. Grl kontrollgruppe; Gr2---mottatt p4381; Gr3..mottatt p4390; Gr4..mottatt p4715. Fig. 10 viser områder okkupert av amyloid forkalkninger. Tg2576 ble injisert 6 ganger med AFFITOPE vaksine tilsatt aluminium hydroksid (ALUM) ved s.c. inokkulering ved månedlige intervaller. Kontrollmus mottok kun PBS-ALUM. Områder okkupert av amyloid forkalkninger er vist som prosent av kontrollgruppen. Gr1..kontrollgruppe; Gr2.. mottatt p4395. EKSEMPLER Metoder Antistoffene som ble brukt for mimotope identifikasjon i henhold til foreliggende oppfinnelse detekterte aminosyresekvenser avledet fra humant Aß men binder ikke til full lengde humant APP. Sekvensene detektert inkluderer EFRHDS (= opprinnelig epitope aa3-8 til Aß), p FRHDS (= opprinnelig epitope av modifisert aa3-8 til Aß), EVHHQK (= opprinnelig epitope aa11-16 til Aß). Antistoffet kan være en monoklonalt eller polyklonatlt antistoff preparat eller envhert antistoffdel eller derivat derav, den eneste forutsetningene er at antistoff molekylet spesifikt gjenkjenner minst en av epitopene nevnt over (avledet fra humant Aß), men binder seg ikke til full lengde humant APP. Mimotopene blir identifisert og ytterliegre karakterisert med slike monoklonale antistoffer og peptidbiblioteker. Eksempel 1: Fremstilling av monoklonale antistoffer fro spesifikt å detektere ß-amyloid og N-terminalt avkuttede og/eller posttranslasjonelt modifiserte ß-amyloid fragmenter Eksempel 1a: fremstilling av monoklonalt antistoff MV-001 Det ble fremstil et monoklonalt antistoff avledet fra fusjonen av forsøk Alz-5: I forsøk Alz-5 ble C57/B16 mus immunisert gjentatte ganger med opprinnelig Aß
epitope DAEFRHDSGYC koblet til KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) og Alum (aluminium hydroksid) som adjuvans. p4731 peptid-spesifikk, antistoffproduserende hybridomas ble deteketert med ELISA (p1253- og p4371-peptidbelagte ELISA plater). Humant Aß40/42 (rekombinant protein) ble brukt som positivt kontrollpeptid: hybridomas gjenkjenner det rekombinante proteinet immobilisert på ELISA plater ble inkludert siden de binder både peptid og full lengde Aß spesifikt. P1454 (humant Aß 33-40) ble brukt som negativt kontrollpeptid. Videre ble mer hybridomas testet mot p4373. Kun hybridomas uten eller med begnreset p4373 binding ble brukt for ytterligere utvikling av antistoff. Hybridoma clonen (MV-001 (internt navn 824; IgG1) ble renset og analysert for spesifikk deteksjon av henholdsvis p1253, p4371, p4373, p1454 og Aß. MV- 001 gjenkjente den injiserte epitopen (p1253) såvel som den spesifikke epitopen (p4371) og full lengde Aß protein (rekombinat protein; erholdt fra Bachem AG, Bubendorff, Sveits) i ELISA. Det ble imidlertid ikke detektert p1454 med ELISA. I det vesentligste feilet MV-001 antistoffenen i å detektere peptidet p4373 som koder pyroglutamat versjonen av Aß3-10 (30 ganger lavere titer enn de opprinnelige epitopene). Eksempel 1b: fremstilling av monoklonalt antistoff MV-003. Et monoklonalt antistoff avledet fra fusjonen av forsøk Al<-16 ble fremstilt: I forsøk Alz-16 ble BalbC mus immunisert gjentatte ganger med epitope p/e( FRHDSC (p4373= koblet til KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) og Alum (aluminium hydroksid) som adjuvans. p4373-peptid-spesifikk antistoffproduserende hybridomas ble detektert ved ELISA (p7373-peptid-belagte ELIS plater). P4253, p1454 og Aß10/42 ble brukt som negative kontrollpeptider. Videre ble hybridomas testet mot p4371. Kun hybridomas med ingen eller begrenset p4371 binding ble brukt for ytterligere antistoffutvikling for å garantere for pyroglutanat-spesifitet. Hybridomas klonen (MV-003 (internt navn D129; IgG1) ble renset og analysert for spesifikk deteksjon av henholdsvis p1253, p4371, p4373, p1454 og Aß. MV- 003 gjenkjente den injiserte epitopen (p4373) men mislyktes i å detektere
p1454, p1253 eller full lengde Aß protein (rekombinant protein erholdt fra Bachem AG, Bubendorf, Sveits) i ELISA. Videre mislyktes MV-003 antistoffene i å detektere peptidet P4,71 som koder for den normale versjonen av Aß-10 (15 ganger lavere titer enn opprinnelig epitope). Eksempel 1c: Fremstilling av monoklonalt antistoff MV-004 Detv ble fremstilt et monoklonalt antistoff avledet fra fusjonen i forsøk ALz-15: I forsøk Al-15 ble BalbC mus immunisert gjentatte ganger med epitopen EVHHQKS (p4372) koblet til KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) og Alum (alumninium hydroksi) som adjuvans. p4372-peptid-spesifikke, antistoffproduserende hybridomas ble detektert med ELISA (p4372-peptid-beøagte ELISA plater). P4376, p4,78, p1454 og Aß40/42 ble brukt som negative kontrollpeptider. Kun hybridomas med ingen eller begrenset p4376 og p4378 binding ble brukt for ytterligere utvikling av antistoff for å sikre spesifitet motden frie N-terminus ved posisjon aa11. Hybridomas klnen (MV-004 (internt navn B204; IgG1) ble renset og analysert for spesifikk deteksjon av henholdsvis p4372, p4376, p4378, p1454 og Aß. MV- 004 gjenkjente den injiserte epitopen (p4372) men mislyktes med å detektere p1454, p4376 og p4378 så velsom full lengde Aß protein (rekombinant protein; erholdt fra Bachem AG, Bubendorf, Sveits) i ELISA. Manglende deteksjon av p4376, p4378 demonstrere spesifiteten for den frie N-terminus ved posisjon aa11 i avkuttet Aß. Eksempel 2: Fagdisplay, in vitro binding og inhibering ELISA Fagdisplaybiblioteker som ble brukt i dette eksempelet var: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (linjært 7mer bibliotek). Fagdisply ble utført i henhold til produsentens protokoll (www.neb.com) Etter 2 eller 3 etterfølgende runder med oppberedingm ble det plukket ut enkeltfag kloner og fagsupernaantene ble utsatt for ELISA på plater belagt med antistoffet som ble brukt for denne oppberedingsprosedyren. Fagkloner som var posistive i denne ELISA en (sterkt signal formålet, men intet signal for uspesifikk kontroll) ble sekvensert. Dra DNA sekvenser, ble det dedusdert
peptidsekvenser. Disse peptidene ble syntetisert og karaiterisert i bindings- og inhiberings-elisa. I tillegg ble noen nye mimotoper identifsert under screeningen ved å kombinere sekvensinformasjon fra mimotoper identifsert i screeningen for å understøtte identifikakasjonen av en konsensus-sekvens for en mimotope vaksinasjon. 1. In vitro bindingsassay (ELISA) Peptider avledet fra fagdisplay så vel som varianter derav ble koblet til BSA og bundet til ELISA plater (1 µm; som angitt i de respektive figurene) og deretter inkubert med det monoklonale antistoffet som ble brukt i screeningsprosedyren for å analysere bindingskapasiteten til identifiserte peptider. 2. In vitro assay (ELISA) Forskjellige mengder (konsentrasjoner in området fra 10 µg til 0,08 µg; serielle fortynninger), avledet fra fagdisplay, ble inkubert med de monoklonale antistoffet som ble brukt i screeningprosedyren. Peptider med sviktenede påfølgende binding av antistoffet til den opprinnelige epitopen belagt på ELISA plater ble ansett som inhiberende i denne assayen. Eksempel 3: in vivo testing av mimotoper: analyse av immunogeisitet og kryssreaktivitet 1. In vivo testeing av mimotoper Inhiberende så vel som ikke-inhiberende peptider ble koblet til KLH og injisert i mus (vill type C57/B16 mus; subkutan injeksjon i flanken) sammen med en pasende adjuvans (aluminium hydroksid). Dyeene ble vaksinert 3-6 ganger i toukers intervaller og sera ble også tatt hver annen uke. Ved hvert serum ble det bestemt titre for injiserte peptider så vel som et irrelevant peptid. Videre ble det besmet titre mot henholdsvis det rekombinante humane Aß proteinet og mot de opprinnelige peptidene. Generelt ble sera analysert ved reaksjon mot peptider koblet til bovin serum albumin (BSA) og rekombinant full lengde proteiner ble immobolisert på ELISA plater. Titre ble bestemt ved å bruke anti mus IgG spesifikke antistoffer. For detaljerte resultater se henholdsvis fig. 6, 7 og 8.
2. Resultater 2.1. Identifikasjon av spesifikke monoklonale antistoffer (mab) rettet mot n-terminalt avkuttede og modifiserte former av Aß: Figur 1 viser karakteriseringen av det monokoklonale antistoffet MV-001 (internt navn 824; IgG1) avledet fra forsøk Alz-5 og demonstrere spefitet for full lengde Aß og Aß avkuttet ved posisjon E3 Figur 2 viser karakteriseringen av det monoklonale antistoffet MV-003 (internt navn D129; IgG1) avledet fra forsøk Alz-16 og demonstrere spesifitet for Aß avkuttet og posttranslasjonelt modifisert ved posisjon p(e)3. Figur 3 viser karakteriseringen av det monoklonale antistoffet MV-004 (internt navn B204; IgG1) avledet fra forsøk Alz-15 og demonstrere spesifitet for Aß avkuttet ved posisjon E11. 2.2. Screening med spesifikke mab er rettet mot n-terminalt avkuttede og modifiserte former av Aß: 2.2.1. Fagdisplaybibliotek Ph. D. / 2.2.1.1. Screening med monoklonalt antistoff rettet mot p4373. 8 sekvenser ble identifsert ved screening PhD 7 fag display bibliotek i denne screeningen: Tabell 1A oppsummerer de identifiserte peptideneog deres bindingskapasitet sammenlignet med den opprinnelige epitopen. 2.2.1.2. Screening med monoklonalt antistoff rettet mot p4372. 9 sekvenser ble identifisert ved screening PhD 7 fag display bibliotek i denne screeningen: Tabell 1B oppsummerer de identifserte peptidene og deres bindingskapasitet sammenlignet med den opprinnelige epitopen.
2.2.1.3. Screening med monoklonalt antistoff rettet not p4371 71 sekvenser ble identifisert ved screening PhD 7 og PhD12 fag display biblioteker i denne screeningen: Tabell 1C oppsummerer de identifiserte peptidene og deres bindingskapasitet sammenlignet med den opprinnelige epitopen. Tabell 1A: Mimotopbinding til det parentale antostoffet MV-003 Internt SEQ ID Nr. Sekvens Bindingskapasitet peptidnummer p4395 1 IRWDTPC 2 p4396 2 VRWDVYPC 1 p4397 3 IRYDAPLC 1 p4399 4 IRYDMAGC 1 p4728 5 IRWDTSLC 3 p4756 6 IRWDQPC 3 p4792 7 IRWDGC 1 p4793 8 IRWDGGC 2 Forklaring til tabell 1A: bindingskapasiteten er kodet med følgende bindingskode: 1:X beskriver fortynningsfaktoren til det parentale AB. Bindingskode OD halvmaks 1:X 0 Ingen binding :0 1 Svak binding :<16000 2 Midlere binding :16 60000 3 Sterk binding :>60000 Tabell 1B: Mimotopbinding til parentalt antistoff MV-004 Internt peptidnummer SEQ ID Nr. Sekvens Bindingskapasitet
p4417 9 EVWHRHQC 2 p4418 10 ERWHEKHC 3 p4419 11 EVWHRLQC 3 p4420 12 ELWHRYPC 2 p4665 13 ELWHRAFC 2 p4786 14 ELWHRAC 2 p4788 15 EVWHRGC 1 p4789 16 EVWHEHC 1 p4790 17 ERWEKC 1 Forklaring til tabell 1B: bindingskapasiteten er kodet med følgende bindingskode: 1:X beskriver fortynningsfaktoren til parentalt AB. Bindingskode OD halvmaks 1:X 0 Ingen binding :0 1 Svak binding :<24000 2 Midlere binding :24 96000 3 Sterk binding :>96000 Tabell 1C: Mimotopebinding til prentalt antistoff MV-001 Internt peptidnummer SEQ ID Nr. Sekvens Bindingskapasitet
Forklaring til tabell 1C: bindingskapasiteten er kodet med følgende bindingskode: 1:X beskriver fortynningsfaktoren til parentalt AB. Bindingskode OD halvmaks 1:X 0 Ingen binding :0 1 Svak binding :<4000 2 Midlere binding :4000 20000 3 Sterk binding :>20000 2.3. In vitro karakterisering av mimotoper identifiser i screening fag display biblioteker med monoklonale antistoffer rettet mot n-terminalt avkuttede og modifiserte former av AB: Figurene 4 og 5 viser representative eksempler på binding og inhiberingsassayer brukt for å karakterisere mimotoper in vitro. Erholdte data er oppsummert i henholdsvis tabellene 1 og 2. MV-003 mimotoper: fra 8 sekvenser presentert inhiberte 6 sekvenser binding av p(e) 3-7Aß spesifikt monoklonalt antistoff i in vitro konkurranseforsøk: ytterligere 2 sekvenser ble identifiser som ikke inhiberte binding av monoklonalt antistoff i in vitro konkurranseforsøk men som fremdeles bibeholder bindingskapasitet til parentalt antistoff (Tabell 2A).
MV-004 mimotoper: Alle de 9 presenterte sekvensene inhiberer binding av det monoklonale antistoffet spesifikk binding av fri N-terminus til Aß avkuttet ved posisjon E11 i in vitro konkurranseforsøk: (Tabell 2B). MV-001 mimotoper: Av 71 presenterte sekvenser inhiberte 27 sekvenser binding av de monoklonale antistoffet spesifikt rettet mot Aß avkuttet ved posisjon E3 i in vitro konkurranseforsøk: det ble identifisert ytterligere 44 sekvenser som ikke inhiberer binding av monoklonalt antistoff i in vitro konkurranseforsøk men som fremdeles bibeholdt bindingskapasitet til det parentale antistoffet (Tabell 2C). Tabell 2: Mimotoper identifisert i foreliggende oppfinnelse som gir positive resultater i inhiberingsassayer. Tabell 2A: MV-003 Mimotoper Internt peptidnummer SEQ ID Nr. Sekvens Inhiberingskapasitet Forklaring til tabell 2A: inhiberingskapasiteten er kodet med følgende kode: svak inhibering betyr at mer peptid er nødvendig for å senke AB binding enn med den opprinnelige epitopen; sterk inhibering betyr at tilsvarende peptidmengder er nødvendig for mimotopen og opprinnelig epitope for senking av AB bindinger. Mimotoper blir sammenlignet med det opprinnelige peptidet som standard. CD ved 10 µg peptid brukt i assayen er brukt til å beregne konkurransekapasiteen til det opprinnelige peptidet. Konkurransekode 0 Ingen inhibering (OD til 10 µg peptid over 12 ganger opprinnelig peptid)
1 Svakere enn opprinnelig epitope (OD til 10 µg peptid under 12 ganger opprinnelig peptid) 2 Sterk inhibering (som opprinnelig epitope; OD til 10 µg peptid under 5 ganger opprinnelig peptid) Tabell 2B: MV-004 mimotoper Internt peptidnummer SEQ ID Nr. Sekvens Inhiberingskapasitet Forklaring til tabell 2B: inhiberingskapasiteten er kodet på følgende måte: svak inhibering betyr at mer peptid er nødvendig for å redusere AB binding enn med den opprinnelige epitopen; sterk inhibering betyr at tilsvarende peptidmengder er nødvendig for mimotope og opprinnelige epitope for reduksjon av AB binding. Mimotoper er sammenlignet med det opprinnelige peptidet som standard. OD ved 10 µg peptid brukt i assayen er brukt for å beregne konkurransekapasiteten sammenlignet med opprinnelig peptid. Konkurransekode 0 Ingen inhibering (OD til 10 µg peptid over 5 ganger opprinnelig peptid) 1 Svakere enn opprinnelig epitope (OD til 10 µg peptid under 5 ganger opprinnelig peptid) 2 Sterk inhibering (som opprinnelig epitope; OD til 10 µg peptid under 2 ganger opprinnelig peptid) Tabell 2C: MV-001 Mimotoper