Diagnostisk panel og eksomsekvensering tre års erfaring Helle Høyer Overingeniør, PhD Seksjon for medisinsk genetikk Sykehuset Telemark HF DISPOSJON Hvordan brukes dypsekvensering på Sykehuset Telemark Erfaringer og resultater fra av panel og eksomsekvensering Case fra klinikken
~3 milliarder basepar (bokstaver) ~24000 gen som koder for proteiner % av genomet Sangersekvensering Gen TAGGATGTGAAGG Gen 2 Dypsekvensering TAGGATGTGAAGG Undersøke flere gener samtidig 2
Dypsekvensering (NGS) Genom Whole genome sequencing (WGS) Eksom Alle kodende genområder (WES) Filtrert eksom Utvalgte genområder velges ut i databehandlingen Panel Utvalgte gener/ genområder Brukes ikke ved Sykehuset Telemark per i dag Syndrom, ukjent genetisk årsak -2% av genomet Kjent sykdom, ukjent genetisk årsak Kan åpnes senere for å undersøke hele genomet Kjent sykdom, ukjent genetisk årsak heterogene sykdommer 0.0-0.% av genomet Dypsekvensering cbot HiScanSQ Biomek fxp NextSeq 500 Nextera Rapid Capture (Illumina) 37 Mb Exome Coding exons (and exon intron junctions) Custom design påpanel 3
Bioinformatikk og tolkning Ny teknologi = Nye utfordringer Sortere ut de patogene variantene fra normalvariasjon. Undersøkelse Antall varianter Eksom 20 000-50 000 Genpanel 50-300 00 gener Enkeltgener 0- Bioinformatikk og tolkning Alignment og variantdeteksjon Annotering og filtrering Tolkning Analysesvar Basecalling CASAVA Demultipleksing CASAVA Alignment BWA, GATK SNP/indel deteksjon GATK (UG/HC) Annotering: HGMD, ExAC, in-house databaser Kvalitetskontroll -Eksom 80 % >20x -Panel 98 % >20x Filtering i FiltUs Manual evaluering AlaMut, HGMD Sanger verifisering Nytt DNA ekstrakt NGS team møte 4
Filtrering i filtus Alle 20000 Eksom sekvensering Type mutasjon Endrer proteinsekvens Private 200 5000 Databaser med mutasjoner fra friske personer Silent-mutasjoner og UTR Sykdomsårsak 0 5000 0000 5000 20000 25000 Antall mutasjoner Ø. Holla, 202 Bioinformatikk og tolkning Alignment og variantdeteksjon Annotering og filtrering Tolkning Analysesvar Manual evaluering AlaMut, HGMD Sanger verifisering Nytt DNA ekstrakt NGS team møte IGV artifakter 5
Resultater Undersøkte personer Diagnostiske panel og eksomsekvenseringer fra Medisinsk genetikk, Sykehuset Telemark 202 205 Dypsekvensering analyse Eksom Filtrert eksom Panel - Arvelige perifere nevropatier Panel Ataksi Panel - Hereditære spastisk paraparese Panel Muskeldystrofi Panel Nevrofibromatose Panel - Amyotrofisk lateral sklerose Panel - Cystisk fibrose Panel - Ehlers-Danlos Panel - Hemiplegisk migrene Panel Marfan Panel Noonan Panel Tynnfibernevropati Undersøkte personer eksom sekvensering Årsak? Diagnose? Prognose? Vil det skje igjen?? Type slekt Probander Personer Mono 6 6 Duo 8 6 Trio 45 35 Quatro 5 20 SUM 64 77 Hvorav 46 probander / 25 personer fra Tidsskr Nor Laegeforen. 205;35:833 6
Undersøkte personer eksom sekvensering Andel av probandene (n=64) 40% 30% 20% 0% 0% 30% 23% 9% 9% 9% 8% 8% 2% 0-5 5-0 0-5 5-20 20-25 25-30 35-40 40+ Alder [år] De fleste probandene er barn Ø. Holla, NSHG 205 Veiledning og samtykke Genetisk veiledning før og etter ved eksom sekvensering Tre alternativer:. Resultater kun for problemstillingen 2. Utilsiktede funn hvis det finnes behandling 3. Alle utilsiktede funn som kan være av helsemessig betydning 6 www.undiagnosed.org.uk 40 66 Ø. Holla, NSHG 205 7
Funn eksomsekvensering Patogene (Kl. 4 og 5) 30; 47 % 2; 33 % VUS/GUS (Kl. 3) 3; 20 % Benigne (Kl. og 2) Kl. 3 er ikke Sangersekvensert og står ikke i analysesvaret Ø. Holla, NSHG 205 Funn eksomsekvensering Kategori Gen Zygositet Nyoppstått Genetisk diagnose ACTG2 202 Het Nei Visceral myopati DARS2 Comp het Nei Leukoencefalopati RYR Het Nei Myopati/"central core disease", malign hypertermifølsomhet SBF 202 HOM Nei Charcot Marie Tooths sykdom TTPA HOM Nei Ataksi med vitamin E mangel Nevrologisk sykdom ACTB 202 Het De novo Baraitser Winterssyndrom ADNP 204 Het De novo Helsmoortel van der Aa syndrom (ASF/PU/Dysmorf) ANKRD Het De novo KBG syndrom ARIDB 202 Het De novo Coffin-Siris syndrom ARIDB 202 Het De novo Coffin Siris syndrom C5ORF42202 HOM Nei Jouberts syndrom EPG5 202Comp het Nei Vicis syndrom GABRA Het De novo Epileptisk encephalopati GRIN2A Het De novo Epileptisk encefalopati MED3L 203 Het De novo Utviklingshemming NSD Het De novo Sotos syndrom NSD Het De novo Sotos syndrom PTEN Het De novo Cowdens syndrom / PTEN hamartoma tumor syndrom RECQL4 Comp het Nei Rothmund Thomsonssyndrom SPG +MECP2* Comp het Het Nei De novo Spastisk paraparese, kompleks type Retts syndrom ZMYND204 Het De novo Utviklingshemming Ø. Holla, NSHG 205 Syndromutredning 8
Lang utredningstid Utredningstid proband [år] 25 20 5 0 5-46 ACTG2 DARS2 SBF ARIDB GABRA MED3L TTPA PTEN GRIN2A SPG/MECP2 ACTB ZMYND ADNP ARIDB NSD RECQL4 C5ORF42 RYR EPG5 NSD ANKRD Halvparten av pasientene med funn utredet i >5 år Ø. Holla, NSHG 205 Gutt 3 år Case Eksom Synkede hodeomkrets, uten språk men god språkforståelse, normal hørsel, litt sen motorisk utvikling Genetiske analyser array CGH og eksom sekvensering Eksom - Mutasjon i Actin beta (ACTB), nyoppstått (de novo) Mutasjonen er ikke rapportert tidligere Gen forbundet med Baraitser-Winter syndrom Alvorlig <-> mild fenotype 50 rapporterte tilfeller Pasienten oppfyller ikke alle kliniske kriterier 9
Case 2 Eksom Proband: Kronisk tarmsykdom Magesmerter Forstoppelse Diare I II III 35 y 42 y 2 4 y 2 84 y IV 2 49 y 3 58 y 4 V 2 3 4 5 Ct abdomen Dillated small intestine Collaps ed colon Normal control Proband Pseudo-obstruction 0
Histology Ganglion cells Ganglion cells Nerves Foreslått diagnose: H&E stain, 00x Normal control Proband H&E stain, 00x Autosomal dominant visceral nevropati? Associated phenotypes in HGMD
ACTG2 Actin gamma 2, smooth muscle, enteric Tynntarms vegg R05S-ACTG2 α-smooth Muscle Actin, 40x Normal control α-smooth Muscle Actin, 40x Proband Autosomal dominant visceral myopati Sekvensering av genpanel Undersøkelse av sykdommer som kan forårsakes av mutasjoner i mange ulike gener. Alle genene for en gitt sykdom kan undersøkes samtidig Bruker lite maskin og lagring kapasitet God teknisk kvalitet (gjelder ikke filtrert eksom) Relativt få varianter å tolke. Gode kliniske data er viktig! Det må være enkelt å oppdatere genpanelene 2
Genpanel for arvelige perifere nevropatier dhmn CMT Andre PN HSAN HSN Genpanel 92 gener Resultat Tidligere teststrategi med Sangersekvensering var å var å undersøke 6 gener: GJB, PMP22, MPZ, EGR2, LITAF og MFN2 Dypsekvensering økte funnprosenten av patogene punktmutasjoner fra 2 % til 27,0 % i dette materialet. Gener antatt sjeldne er mer vanelig i den norske befolkningen 00 % 90 % 80 % 70 % 65% 60 % 8% 50 % 40 % 30 % 20 % 27% 2% 0 % 7% 7% 0 % Sangersekvensering Dypsekvensering 03 pasienter 03 pasienter Duplikasjoner/delesjoner Punktmutasjoner Ingen Funn GJB 7% SH3TC2 5% SOD 3% HSPB 2% MFN2 2% MPZ 2% AARS/ATL % BSCL2 % DNM2 % FGD4 % IGHMBP2 % NEFL % Hoyer H, Tidsskr Nor Legeforen 205; 35 Nr. 20 03. nov. 205 3
Mutasjoner i andre gener enn antatt utifra klinikk Jente med symptomdebut ved 2 års alder CMT, (NCV 36m/s) Sterke kliniske symptomer Friske foreldre, tremenninger Resultat: de novo MFN2 hz c.30c>t (p.arg04trp) Resultat panelsekvensering Dypsekvensering analyse Antall prøver Funn % Andel funn Ataksi 4 3 7 % Hereditære spastisk paraparese 4 8 20 % Muskeldystrofi 20 6 30 % Nevrofibromatose 76 5 20 % Hos ca 7 % av pasientene har det blitt funnet varianter av ukjent betydning. For ytterligere forbedret diagnostikk må disse utredes videre. 4
KONKLUSJON Eksomsekvensering ga en årsaksdiagnose til 33% av de undersøkte slektene Panelsekvensering for arvelige perifere nevropatier mer enn doblet funnprosenten Selektert og heterogent materiale Ingen utilsiktede funn Men flere funn av usikker betydning Dypsekvensering er et diagnostisk verktøy som hjelper genetisk utredning av pasienter. TAKK TIL Øystein Holla Øyvind Busk Kristian Tveten Hilde T. Hilmarsen Linda Strand Anette Bakken Michael B. Russell Camilla F. Skjelbred Geir J. Braathen Nr. 20 03. nov. 205 Tidsskr Nor Legeforen 205; 35 Diagnostisk eksomsekvensering norske erfaringer Øystein L. Holla, Øyvind L. Busk, Kristian Tveten, Hilde T. Hilmarsen, Linda Strand, Helle Høyer, Anette Bakken, Camilla F. Skjelbred, Geir J. Braathen Arvelige perifere nevropatier diagnostisert ved dypsekvensering Helle Høyer, Øyvind L. Busk, Øystein L. Holla, Linda Strand, Michael B. Russell, Camilla F. Skjelbred, Geir J. Braathen 5