Kromosomer, gener og DNA

Transkript

1 Kromosomer, gener og DNA Hva er det, og hvordan undersøker vi det Olaug Kristin Rødningen Dr.scient, overingeniør Avdeling for medisinsk genetikk, OUS

2 Et menneske består av ulike organsystem Organsystemene er bygd opp av organer Organer er bygd opp av vev Vev er bygd opp av celler Mennesker består av trillioner av celler

3 Cellene i kroppen har ulik form, størrelse og funksjon

4 Alle celler har en cellekjerne Her lagres arvematerialet; DNA DNA er et molekyl som inneholder instruksjon om hva cellen skal gjøre, og hvordan den skal kommunisere med andre celler, hvordan den skal vokse, dele seg, og danne fx. muskler og andre deler av kroppen Det bestemmer hvordan vi ser ut, hvilke egenskaper og sykdommer vi har

5 Deoxyribonukleinsyrer (DNA) Dobbeltspiral, bygd opp av 4 ulike byggesteiner, også kalt baser; A, C, G, T På hvert trinn binder A med T eller C med G Består av basepar (x2)

6 Kromosomer DNA-trådene er ca. 3 nanometer brede, og til sammen 2+2 meter Inni cellen kveiles DNA opp De 3 milliardene basepar er ikke en sammenhengende tråd, men delt opp i mindre biter; kromosomer Menneskeceller har 46 kromosomer (23 fra far og 23 fra mor)

7 Hvordan gjenkjenner vi kromosomer Hvert enkelt kromosom har en bestemt lengde, og pakkes på bestemte måter (tett/mindre tett) Karyotype Hvis vi tar ut cellekjerner, og farger dem rett før de har tenkt å dele seg (er veldig kompakte), kan vi ta bilde av dem i mikroskop Vi ser da mørke og lyse områder, og kan sortere dem etter karakteristiske mønster og lengde Kromosom 1 det lengste; 248 mill basepar, 21 kortest; 48 mill basepar Vi kan undersøke om de har et vanlig mønster, vanlig antall, og om vi ser en XX eller XY (kjønn) etc.

8 Gener Et gen er en definert bit av DNA som oftest fungerer som oppskrift for et bestemt protein Vi har omlag gener, og de fleste fins i to kopier (en fra far og en fra mor) De har et startpunkt og et stoppunkt på kromosomet, ex. CFTR Ligger etter hverandre bortover tråden, og har fast plass ift. andre gener Vi kjenner idag rekkefølgen til basene i alle gen, og hvor de ligger på kromosomene

9 Hvordan bruker cellene oppskriften i DNA? Genet blir kopiert til et mindre molekyl kalt mrna mrna blir deretter oversatt til protein ved at et maskineri leser tre og tre av bokstavene, og henter inn en bestemt aminosyre for hver triplett En triplett angir start, en triplett angir stopp, og andre tripletter angir en av 20 ulike aminosyrer Aminosyrene er byggesteiner i proteiner Genene er derfor oppskrifter for tusenvis av ulike proteiner som har ulike oppgaver i cellen Så lenge dette genet er på, fortsetter cellen å lage flere mrna, og flere kopier av dette proteinet

10 Proteiners funksjon i cellen Byggsteiner i alle deler av cellen cellevegg osv. Noen proteiner er enzymer katalyserer ulike kjemiske reaksjoner, næringsomsetning osv. Noen proteiner er med på å regulere når andre gener skal skrus av/på Immunforsvaret (antistoff) er bygd opp av proteiner Noen proteiner har som oppgave å transportere andre molekyler rundt Noen proteiner har som funksjon å reparere skader i DNA og mye mer...

11 Fra DNA til protein

12 Hvis alle celler har samme DNA, hvorfor er cellene så forskjellige? Alle celler har de samme genene, men bruker dem forskjellig. De ulike genene uttrykkes (oversettes til proteiner) i ulik mengde og på ulike tidspunkt i ulike celler Genene skrus av og på etter behov TID STED - MENGDE

13 Hvis vi alle har de samme genene, hvorfor er vi så forskjellige? Fordi vi alle har variasjoner i DNA`et vårt To individer er kun 99.5% like ift. DNA sekvens To individer har ulikheter ca. 4-5 millioner steder i genomet Det er rapportert >320 millioner varianter blant mennesker Forskjellen kan utnyttes innen rettsmedisin Normalvariasjon Variasjon forbundet med sykdom

14 Hvordan oppstår variasjonen Endringer skjer hele tiden Man tror det skjer feil i DNA i alle celler i kroppen hver dag Kan skje spontant Når cellen skal fordoble sitt DNA (før den skal deles) Når cellen prøver å reparere skadene som har oppstått De fleste blir reparert korrekt (bruker den andre tråden som oppskrift) Hvis den ikke blir reparert med andre tråd som oppskrift, blir den værende Mange variasjoner gir ikke noen effekt på proteinfunksjonen Hvis endringen skjer i kjønnceller, vil varianten kunne nedarves til neste generasjon. Da vil varianten være tilstede i alle celler hos barnet Hvis endringen skjer tidlig i fosterutviklingen, vil den kunne være tilstede i noen eller alle cellene til barnet

15 Typer endringer: DNA-nivå ATG CAC CAC GAA... Met His His Glu... EFFEKT Missense - En annen aminosyre blir satt inn ATG CCC CAC GAA... Met Pro His Glu... ATG CCC CAC TAA... Met Pro His Stop Nonsense - Proteinet blir for kort ATG CCC.ACG AAC... Met Pro Thr Asn... Frameshift (liten delesjon eller insersjon) - Andre aminosyrer blir satt inn herfra Kan endre funksjon eller mengde av proteinet som skal lages

16 Hvor vanlig er variasjonene? Alle mennesker har en variant 4-5 millioner steder i genomet Kun av disse er trolig de novo (nyoppstått) oppstått tilfeldig i kjønncellene eller tidlig i fosterutviklingen Resten er nedarvet de finnes altså i mors eller fars DNA også... Alle mennesker har trolig 1-2 varianter som kan gi alvorlig genetisk sykdom hvis barnet får varianten fra både mor og far (recessiv sykdom)

17 Når gir variasjon sykdom? Vi har vanligvis 2 kopier av alle gener; en fra far og en fra mor Noen varianter gjør at genet får endret aktivitet, dvs. det produseres for mye eller for lite protein Andre varianter kan påvirke hvordan proteinet ser ut og fungerer For noen gener tolereres det at en av kopiene har en ødeleggende variant, men ikke at begge kopiene er ødelagt (recessiv sykdom, ex. Cystisk fibrose) For andre gener er det tilstrekkelig at en av kopiene er ødelagt (dominant sykdom, ex. Familiær hyperkolesterolemi)

18 Arvemønster X-bundet recessive gener Ulike varianter i et gen kan gi ulik alvorlighetsgrad av sykdommen Alvorlighetsgraden er også avhengig av de andre genene -> vanskelig å forutsi akkurat hvordan sykdommen vil forløpe I tillegg til nedarvede varianter vist her, kan varianter også oppstå i kjønnceller eller tidlig i fosterutviklingen, slik at ingen av foreldrene har samme variant (de novo) + imprintede gener og mitokondriell arv Kjenner idag ca monogene sykdommer

19 Typer endringer: kromosomnivå Numeriske antall kromosomer ikke 46 Monosomi (kun ett X-kromosom: Turner syndrom) Trisomi (tre kromosom 21: Down syndrom)(to X og en Y: Klinefelters syndrom) Triploidi (tre kopier av alle kromosomer) Skjer oftest under produksjon av kjønnsceller (nondisjunction i meiose)

20 Typer endringer: kromosomnivå Strukturelle rearrangement i eller mellom kromosomene Om de er større enn 5-10 millioner basepar, kan de oppdages i mikroskop Effekt: - Hvis antall kopier av genet blir > eller < 2, vil mengden protein som lages av de genene som er i regionen endres - Kan ødelegge strukturen til et gen i bruddpunktet, slik at ingen protein blir laget - Kan ødelegge av/på-mekanismen til genene i regionen, slik at vi ikke får normal mengde protein

21 En forelder med en balansert translokasjon mellom to kromosom Mulige gameter Ingen t balansert ubalansert ubalansert Normal mengde kromosommateriale Normal mengde kromosommateriale For mye lilla For lite gult For mye gult For lite lilla

22 Imprintingssykdommer/uniparental disomi Noen gener er programmert til å bare uttrykkes i en kopi enten bare den som kommer fra far eller bare den som kommer fra mor Hvis man arver to kromosom i et par fra mor og ingen fra far (uniparental disomi), vil det skape problemer for de imprintede genene på dette kromosomet Et gen som kun skal uttrykkes fra fars kopi, vil da ikke uttrykkes i det hele tatt I tillegg kan man få recessive sykdommer hvis mor var bærer av en mutasjon på dette kromosomet (to identiske fra mor)

23 Genetisk utredning av sjeldne kromosomavvik og genfeil Om man har en klinisk mistanke om en bestemt sykdom eller syndrom, kan man gjøre målrettede undersøkelser i DNA. Man vet hva som er den vanligste årsaken til sykdommen, og kan lete etter en bestemt variant i genomet. FISH, Sanger sekvensering, MLPA, trisomitest etc. Om man ikke har spesifikk mistanke om bestemt sykdom, kan man benytte screeningmetoder hvor man leter i hele eller store deler av genomet karyotyping, acgh, HTS Starter oftest med en blodprøve, hvor vi tar ut DNA

24 Ulike metoder for å påvise varianter FISH - påvisning av fravær/tilstedeværelse av spesifikke sekvenser - informasjon om plassering - avhengig av celler i deling Sangers sekvensering - enkeltbasemutasjoner - små delesjoner/insersjoner - begrenset av primerplassering Fragmentanalyse - Fragmentlengder (ekspansjoner) - Semikvantitativ - trisomier MLPA - delesjoner/duplikasjoner - begrenset av probeplassering Karyotyping - påvisning av store strukturelle feil >5-10Mb - påvisning av numeriske feil - avhengig av celler i deling Array CGH - påvisning av delesjoner/duplikasjoner > 10 kb hele genomet - ser ikke balanserte kromosomfeil High throughput sekvensering (HTS) - Påviser rekkefølgen av baser i enten hele genomet, eller i utvalgte deler

25 High throughput sekvensering (HTS) Metode for å finne rekkefølgen (sekvensen) i DNA Baserer seg på at man har biter av DNA fra pasienten på en glassbrikke Man tilsetter fargede baser, og lar dem binde til DNAet (A-T, G-C) Man tar bilde av dette, og ser rekkefølgen av hvilke baser som er bundet Når vi har sekvensen, sammenlikner vi denne med en referanse, og finner ut om det har oppstått en fx. missense Kan sekvensere utvalgte gener, eller ALT i en operasjon Metoden vil etterhvert være god nok til å erstatte alle andre metoder

26 Array CGH en metode for å påvise kopitallet til alle gener En glassbrikke har fragmenter av syntetiske DNA-biter festet til seg, hentet fra opptil 1 million kjente steder i genomet 100 µm 10 µm pixel resolution Chromosome 22 TBX1 genet Array

27 DNA fra pasient og kontroll kuttes i biter og merkes med hver sin farge - Røde signal: for mye fra pasient - Grønne signal: for lite fra pasient - Gule signal: like mye av hver Dataanalyse Beregne ratioer mellom fargestyrken for pasient / kontroll DNA fra pasient og kontroll binder til glassbrikken Scanning Ratioer gjøres om til log2-verdier: 0: normal (2 kopier) -1: heterozygot delesjon (1 kopi) >-2: homozygot delesjon (0 kopier) +0.58: duplikasjon (3 kopier) +1: duplikasjon (4 kopier) Ved at vi vet hvor det syntetiske DNA på glasset er hentet fra, kan vi finne ut hvilke gener hos pasienten som hadde et annet kopitall en kontrollen. Vi kan påvise delesjoner/duplikasjoner = ubalanse

28 Hvilke gener ligger i området? Hvilken funksjon har disse genene? Er noen av disse genene relatert til sykdom? Passer det med kliniske funn? Generelle databaser Ensembl OMIM, PubMed Kopinummer databaser: Database of Genomic Variants: Syndrom databaser: DECHIPHER GeneTests ECARUCA Unique Søke i syndrom-databaser Er det rapportert om tilsvarende avvik? Søke i databaser for kopivariasjon Er det rapportert som normalvariasjon? (vi har alle ca kopitallsvarianter, som utgjør ca. 4 mill basepar) er avviket årsak til sykdom hos pasient...eller ikke..?

29 Mikrodelesjons- og duplikasjons-syndromer Pasientene har delesjoner (bortfall) eller duplikasjoner (ekstra kopier) av genetisk materiale som er for små til å oppdages i mikroskop En rekke nye syndromer er oppdaget etter at man startet å bruke acgh i diagnostikken Etterhvert er det utviklet målrettede metoder for å påvise dem (MLPA) Men dette krever at man gjenkjenner syndromet hos barnet først

30 1p36 delesjonssyndrom Fra Unique:

31 DiGeorge syndrom 22q11 delesjonssyndrom 1,5 Mb eller 3 Mb delesjon 24 eller 30 gener 94% de novo 6% arvet fra foreldre Foreldre kan ha en veldig mild fenotype, mange har ikke merket noe Mulige forklaringer på varierende uttrykk: Hyppig: 1/3000-1/6000 barn - Ulike varianter på det andre kromosomet - Modifiserende varianter i andre gener

32 Dagens utfordringer Vi kjenner sekvensen til hele genomet Vi har teknologien til å finne alle slags varianter, og den er rask Vi har masse kunnskap om >5000 monogene sykdommer, masse kromosomforandringer, ulike sykdomsmekanismer og behandlingsmuligheter...men vi har ikke full oversikt over funksjonen til alle gener...og ikke samspillet mellom dem...og ikke full forståelse av hvorfor samme forandring kan gi så forskjellig utfall...og vi finner stadig nye varianter som ingen har sett før