Utvikling av molekylære metoder

Transkript

1 Utvikling av molekylære metoder Gunhild Trøen Overingeniør Sivilingeniør, PhD Enhet for molekylærpatologi Avdeling for patologi OUS- Radiumhospitalet NITO-kurs: Molekylærpatologi, 7-8 juni 2017 Oversikt Hva er molekylærpatologi? Hvorfor trenger vi molekylærpatologiske analyser? Hvilke molekylæpatologiske metoder benyttes i dag? Utvikling av molekylære metoder innen patologi Eksempler Fremtiden videre? 1

2 Hva er molekylærpatologi? Molekylærpatologi er en blanding av molekylærbiologi og patologi Sammen med morfologiske undersøkelser avdekke hva som foregår inni og mellom cellene ved å undersøke DNA, RNA og proteiner. Endringer i DNA/RNA som påvirker genekspresjon (mrna) og dermed endring i mengden (uttrykket) av proteinene Hvilke endringer ser vi etter? Mutasjoner varig forandring i arvemateriale (DNA) Genmutasjoner Punktmutasjoner Duplikasjoner/Amplifikasjoner Delesjoner C T Kromosommutasjoner Numeriske Strukturelle, feks translokasjoner c Ytre påvirkninger (Infeksjoner, Virus) Endringene kan måles ved å analysere DNA, RNA (eller protein nivået) 2

3 Hvorfor trenger vi molekylæpatologiske analyser? Bestemme riktig diagnose Gi riktig behandling Effekt av medisin Forventede bivirkninger Forutsi sykdomsforløp Følge respons av behandling (MRD minimal residual disease) Millner LM.Clin Lab Med, 2016 Viktig klinisk betydning spesielt innenfor kreftsykdommer Hvilke molekylæpatologiske metoder benyttes i dag? Karyotyping FISH (Fluorescens In Situ Hybridisering) PCR feks. real-time PCR, MLPA, digital-pcr, fragmentanalyse Sanger sekvensering Mikromatriser genekspresjon CGH (komparativ genomhybridisering), SNP (enkel nukleotidpolymorfisme) NGS målrettede genpaneler exom- eller helgenom-sekvensering Valg av metode avhengig av type mutasjon og sensitivitet som kreves. 3

4 Historie tidslinje molekylære metoder Dobbel helix struktur av DNA (James Watson og Francis Crick) DNA hybridisering (den genetiske koden,marshall Nirenberg) Monoklonale antistoffer (Georges Kohler, César Milstein) DNA sekvensering (Allan Maxam og Walter Gilbert) Sanger sekvensering (Frederick Sanger) FISH Oppdagelsen av PCR (Kerry Mullis) Første automatiske DNA-sekvenseringsinstrument (Applied Biosystem) Oppdagelsen av termostabil DNA polymerase optimalisering av PCR Det humane genome prosjektet lansert i USA Real-time PCR Mikromatrise teknologi Pyrosekvensering (Mostafa Ronaghi) Det første utkast av det humane genome publisert (Nature og Science) Fullført sekvens av det humane genom Massiv parallell sekvensering (NGS, Roche) Videre utvikling av sekvenseringsplattformer hys.org/list/ Durmas AA, BioMed Res Int Utvikling av molekylære metoder Forbedringer skyldes: Bedre enzymer Bedre kjemi Fluoriserende markører Bedre separeringsteknikker Nye bildeteknikker Automatisering Robotteknologi Bedre dataprogrammer 4

5 Utvikling av DNA sekvenseringsmetoder 1977 Maxam-Gilbert sekvensering 1977 Sanger sekvensering 1985 Kapillær-gelelektroforese, automatiserte sekvenseringsmaskiner 2005 NGS Utvikling av DNA sekvenseringsmetoder MR Stratton et al. Nature 458, (2009) doi: /nature

6 Valg av metode Valg av metode avhengig av type mutasjon og sensitivitet som kreves. Deteksjon av BCR-ABL1, t(9;22)(q34;q11): Karyotyping Lite sensitiv (20 celler vurderes), resolusjon > 5Mb FISH Mer sensitiv ( celler), resolusjon > 50Kb, (interfase FISH) Kvantiativ-PCR Svært sensitiv (1x10-5,0.001 %) Påvisning av mutasjoner i BCR-ABL1 Sanger sekvensering (sensitivitet %) NGS (sensitivitet 1-2 %, Soverini S, Blood 2013) Valg av metode TruSight Myeloid Sequencing Panel fra Illumina, dekker 54 gener Myeloide neoplasier Eks. MDS (Myelodysplastisk syndrom) ABL1 CEBPA HRAS MYD88 SF3B1 ASXL1 CSF3R IDH1 NOTCH1 SMC1A ATRX CUX1 IDH2 NPM1 SMC3 DNMT3 BCOR IKZF1 NRAS SRSF2 A ETV6/TE BCORL1 JAK2 PDGFRA STAG2 L BRAF EZH2 JAK3 PHF6 TET2 CALR FBXW7 KDM6A PTEN TP53 CBL FLT3 KIT PTPN11 U2AF1 CBLB GATA1 KRAS RAD21 WT1 CBLC GATA2 MLL RUNX1 ZRSR2 CDKN2A GNAS MPL SETBP1 Undersøke for mutasjoner i mange gener samtidig Gir mutasjonsprofil som kan støtte diagnostikken Nyttig for store gener der mutasjoner ikke ligger i «hot spots» Kvantitativt resultat: ca. 5 % allelfrekvens 6

7 Utvikling av molekylære metoder Kartleggingen av det humane genomet sammen med forbedrede analysemetoder har ført til: Økt forståelse av sykdomsprosesser Opplysninger om molekylære/genetiske signaturer Utvikling av medisiner som angriper spesifikt Økt krav til molekylære analyser av stadig flere markører Økning i antall analyser og markører Utvikling av antall molekylærpatologiske analyser ved enhet for molekylærpatologi, OUS: Nytt rekvisisjonsskjema under utarbeidelse pr. juni 2016: 7

8 Økt tilbud av analyser Khodakov D. Adv Drug Del Rev, 2016 Persontilpasset medisin Persontilpasset medisin Nasjonal strategi for helsetjenesten Med persontilpasset medisin menes forebygging, diagnostikk, behandling og oppfølging tilpasset biologiske forhold hos den enkelte. Strategien skal bidra til utvikling og implementering i helsetjenesten i perioden

9 Persontilpasset medisin Implementering av persontilpasset medisin vil gi økt arbeidsmengde En enkelt markør er sjelden tilstrekkelig Ulike laber utfører analysene Tverrfaglig samarbeid er nødvendig Fremtidig utvikling av molekylære metoder innen patologi? Implementering av NGS i diagnostikk Undersøke epigenetiske endringer Metylering Kromatin struktur Utvikle sensitive metoder Klinisk betydning av tumor-heterogenitet Non-invasive analyser (ctdna) 9