Hva gjør vi på molekylærpatologisk laboratorium?

Transkript

1 Bioingeniørkongressen 2016 Hva gjør vi på molekylærpatologisk laboratorium? Dag Andre Nymoen Ingeniør/stipendiat Patologen OUS Laboratorium for molekylærpatologi Operasjon Biopsi Makrobeskjæring Rapport Biopsi Histologen: Fiksering og innstøping av biopsier Biopsi Spesiallaboratorier på patologen: Immunhistokjemi Elektronmikroskopi FISH, Flowcytometri Molekylær patologi 1

2 DNA er ikke noe nytt Glutamine synthetase proteinet Genet Glutamine synthetase er 3800 millioner år, og en av våre eldste funksjonelle gener. Kartlegging av DNA strukturen Rosalind Franklin and Maurice Wilkins tok røntgenbilder av DNA Watson and Crick brukte dataene for å lage en DNA modell (1953) 2

3 DNA Hvor er DNA i cellen? 3

4 Hvilken funksjon har DNA? Spontane endringer i DNA = mutasjoner * * * 4

5 Kreft-definisjoner Kreft er en genetisk sykdom - Mutasjoner i tumor supressor og oppregulering av onkogener driver kreftutviklingen - 90% av alle kreftdødsfall skyldes metastaser fra solide tumorer - Alder, stråling, virus, arv, kjemikalier (røyking), øker antall mutasjoner Hypotese: ( ) Tysk biolog Defekt mitose = kreft 5

6 Medisinsk kreft behandling: - Cellegift/stråling - Målrettet behandling / pasient tilpasset - Immunterapi Cellegift og stråling: -Muterer DNA og skader kromosomer. - Skadene stopper videre celledeling og initierer apoptose 6

7 Cellegift brukt mot eggstokkreft - Carboplatin lager bindinger mellom DNA baser - Taxol Destabiliserer mikrotubuli under mitosen Carboplatin Taxus brevifolia (Taxol) Målrettet behandling: -Målrettede medikamenter kan hemme celledeling eller angiogenese. - Mutasjoner i gener fører til at medikamentene ikke binder proteinet. 7

8 Målrettet behandling: Tarmkreftbehandling Cetuximab brukes sammen med cellegift i tarmkrefbehandling - Cetuximab binder og hemmer EGFR - Kun pasienter med normal (ikke mutert) KRAS har effekt av behandling Målrettet behandling: Leukemi 8

9 Målrettet behandling: Leukemi BCR ABL fusjonsprotein (grønt) Glivec (Imatinib) (rødt) binder ATP lommen Kreft immunterapi: Aktiverer immunforsvaret til å gjenkjenne kreftceller - Passiv terapi ved bruk av antistoffer - Aktiv terapi hvor immunforsvaret trigges ved å sette antistoffer in i virusvektorer eller inn i normalceller. normalceller Inkubator antistoffer Celler som trigger immunsystemet 9

10 Human papillomavirus (HPV) - De fleste seksuelt aktive mennesker får en HPV-infeksjon i løpet av livet - Vedvarende HPV-infeksjon kan gi kreft i bl.a. livmor, anus og hals - Det finnes over 100 HPV-typer hvorav ca 15 er antatt å kunne lede til kreft - Vaksiner mot de mest aggressive typene er nå i bruk Elektronmikroskopibilde av HPV-virus Hva brukes våre DNA/RNA analyser til? - Diagnose - Mutasjoner avgjør valg av medikament - Respons på behandling / restsykdom - Påviser og kvantiterer HPV-virus 10

11 Rekvisisjonsskjema / analyser Kvantifiserbart DNA Alt fiksert materiale blir kvalitetssikret ved bruk av QPCR Prøve uten hemming Prøve med hemming vann 11

12 Hvordan påviser vi mutasjoner? Sanger sekvensering Normalt DNA Mutert DNA Hvordan påviser vi mutasjoner? Pyromark sekvensering Normal wt Mutert V600E Mutert V600K 12

13 Hvordan påviser vi mutasjoner? Mutasjonsspesifik QPCR Passer Woble GGCAGCACAG Nuklotidide spesifik primer AGCTCCGATCCGTCGTATCATGCGTATGATGCCATG mutert gen Passer ikke GGCAGCACAG AGCTCCGATCCGTCGTATGATGCGTATGATGCCATG normalt gen Total DNA primer Hvordan påviser vi mutasjoner? Smeltekurveanalyse (HRM) 13

14 Smeltekurveanalyse (HRM) Funn blir bekreftet ved sanger sekvensering Hvordan kvantifisere mrna? Eksempel: Leukemi BCR ABL restsykdom RNA isoleringc DNA syntese QPCR Analyse og rapport 14

15 BCR ABL rapport Kurve restsykdom God behandlingsrespons Dårlig behandlingsrespons Telle kromosomer Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) 15

16 Mikrosatelite instabile tumorer (MSI) er markør for sviktende DNA reparasjon ttgcatgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacgtacctg Mikrosatelitt og BRAF mutasjonsanalyse er prognostiske markører for colorektal cancer God Dårlig BRAF wt Mikro satellitt innstabil (MSI) BRAF V600E mikro satellitt stabil (MSS) MSS/BRAF V600E 16

17 Hvordan finner vi HPV-virus? Cytologiscreening + Hvordan finner vi HPV-virus? Subtyping 3 assay i samme reaksjon Brukes på positive cytologier og alle biopsier 2557.HPV.11.F 2558.HPV.11.R 2559.HPV.11.pr 2560.HPV.16.F 2561.HPV.16.R 2562.HPV.16.pr FAM (510nm)-BHQ HEX (580nm)-BHQ 2563.HPV.18.F 2564.HPV.18.R 2565.HPV.18.pr Cy5 (660nm) BHQ 17

18 Takk for meg (oss ) 18